專(zhuān)利名稱(chēng)：凈化血液及血液制品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凈化血液及血液制品的方法，具體涉及一種用吩噻嗪類(lèi)染料修 飾的磁性微粒殺滅并去除血液及血液制品中病毒的方法。
技術(shù)背景輸血是治病救人的有效治療手段，但輸血也伴隨著艾滋病、乙型肝炎以及丙型肝炎等病毒性疾病傳播的危險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界被艾滋病毒(HIV)感染的人 數(shù)大于三千萬(wàn)，被乙肝病毒(HBV)感染的人數(shù)大約3.7億，被丙肝病毒(HCV) 感染的人數(shù)大約1.8億，而被HIV感染總數(shù)的5-10%源于不安全的輸血！ 目前，血液及血液制品中所含病毒的處理主要有滅活和去除兩種形式。 滅活方法中巴斯德消毒法，對(duì)一些耐熱病毒的滅活效果不佳。有機(jī)溶劑結(jié)合 表面活性劑(S/D)法，對(duì)非脂包膜病毒無(wú)效，且工藝復(fù)雜，成本高。干熱滅活法， 雖安全有效，但僅適用于凍干制劑的病毒滅活。光化學(xué)滅活法，是目前被視為頗有 前景的血液凈化的熱點(diǎn)研究方向，不僅可以滅活血漿中游離的病毒，而且可以滅活 細(xì)胞內(nèi)整合的病毒，故可用于全血、血漿及血細(xì)胞等各種血液成分及血液制品的消 毒。己使用的化學(xué)光敏劑主要有血卟啉衍生物、補(bǔ)骨脂素衍生物及吩噻嗪類(lèi)染料亞 甲藍(lán)等。亞甲藍(lán)光化學(xué)法具有效率高、成本低、起效快、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，滅活后的血 槳副作用小，血漿蛋白的免疫原性無(wú)變異，主要用于血槳中HIV、 HBV及HCV的 滅活；且亞甲藍(lán)是FDA批準(zhǔn)的臨床用藥，毒副作用較小。對(duì)亞甲藍(lán)光化學(xué)法作用 機(jī)理的研究表明，亞甲藍(lán)既可與病毒脂包膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合，又可與核酸， 尤其是富含GC堿基區(qū)域結(jié)合，經(jīng)一定波長(zhǎng)的光照后，光敏劑形成單態(tài)氧和氫氧自 由基，破壞了病毒脂包膜，使得鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生氧化，核酸發(fā)生斷裂，從而可阻止病毒 的復(fù)制。該方法目前主要用于新鮮冰凍血漿中病毒的凈化，而其它的一些對(duì)核酸具 有更高親和力并可殺滅細(xì)胞內(nèi)病毒的亞甲藍(lán)衍生物已用于全血及紅細(xì)胞懸液中病毒 的滅活研究。1993年起在歐洲一些國(guó)家的紅十字會(huì)輸血中心開(kāi)始使用該方法滅活新 鮮冷凍血漿中的病毒，至今未發(fā)現(xiàn)明顯的負(fù)面反應(yīng)。我國(guó)近年來(lái)也將采用該法滅活 的血漿用于臨床治療，取得了良好的效果。但該法主要的缺點(diǎn)是亞甲藍(lán)殘留在血 液中，導(dǎo)致血液顏色變化，會(huì)使受血者產(chǎn)生心理抗拒。尤其是殘留的亞甲藍(lán)在人體 內(nèi)會(huì)積累，存在潛在的致突變的危險(xiǎn)。雖然可以用吸附劑法去除亞甲藍(lán)，但去除率通常只能達(dá)到85%左右，且該過(guò)程會(huì)影響血液制品中的正常成分。上述兒種滅活病毒的方法均無(wú)法將滅活后的病毒從血液或血液制品中去除，而且臨床使用表明，沒(méi)有一種病毒滅活方法能保證血液制品絕對(duì)無(wú)傳播病毒的危險(xiǎn)。 比較成熟的病毒去除方法中色譜法耗時(shí)太長(zhǎng)，且去除病毒不徹底。膜法易損傷細(xì)胞成分。免疫吸附柱法處于研發(fā)之中，可用于血液制品中病毒的徹底去除，但該法特異性太強(qiáng)，故實(shí)際應(yīng)用范圍很窄。申請(qǐng)?zhí)枮?00410026221.2的中國(guó)專(zhuān)利，公開(kāi)了 一種將抗體固定于磁性微粒表面， 利用抗原抗體間的特異性結(jié)合及磁性微粒的磁性分離性能去除血液中病毒的方法。 但由于該法中抗體穩(wěn)定性較差，產(chǎn)品難以長(zhǎng)期保存，故實(shí)際應(yīng)用受到很大限制。綜上所述，現(xiàn)存的血液凈化方法，有的只能殺滅病毒而無(wú)法去除被殺滅的病毒， 致使異源蛋白/核酸雖無(wú)活性但依然存在于血液或血液制品中，而這種存在本身就有 潛在的危險(xiǎn)；有的雖能去除病毒，但無(wú)法確保病毒被完全去除。磁性微粒是由有機(jī)或無(wú)機(jī)基質(zhì)與磁性金屬、金屬氧化物等磁性超細(xì)粉末復(fù)合形 成的納米或微米級(jí)膠態(tài)顆粒。該材料的超順磁性使其在膠體溶液中具有穩(wěn)定性，其 磁響應(yīng)性可保證在外加磁場(chǎng)中顆粒與懸浮介質(zhì)的分離，在撤去外磁場(chǎng)時(shí)微粒本身會(huì) 重新懸浮分散而不聚集，即不具有磁記憶性。更有意義的是，通過(guò)高分子或有機(jī)試 劑與磁性顆粒的復(fù)合，可在顆粒表面引入氨基、羧基、巰基、羥基等功能基團(tuán)，通 過(guò)共價(jià)作用將酶、抗體、細(xì)胞、核酸及寡核苷酸等生物分子固定在表面，可應(yīng)用于 細(xì)胞分選、酶的固定化、免疫檢測(cè)、藥物載體及核酸的純化與分離、腫瘤的靶向治 療研究等生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。磁性微粒的制備有球磨法、乳液聚合法、液相干燥法、溶膠-凝膠法、均勻沉淀 法、氣溶膠法、反相膠束法、無(wú)定型晶化法等許多方法，國(guó)外已有相關(guān)上市產(chǎn)品， 1986年挪威的Dynal公司率先實(shí)現(xiàn)了該類(lèi)產(chǎn)品的商業(yè)化，所提供的DynabeadBeads M-280和M-450已廣泛用于細(xì)胞分選、蛋白質(zhì)及核酸分離等領(lǐng)域；德國(guó)Miltenyi Biotech公司利用多糖包覆的磁性微粒偶聯(lián)抗體己應(yīng)用于細(xì)胞分選方面；Boehringer Mannheim公司的mRNA分離試劑盒也是特色產(chǎn)品；美國(guó)的FeRx公司、PE公司、 Perseptive公司、瑞典的Pharmacia公司、法國(guó)的Estapor、德國(guó)的Micromod以及加 拿大的Biochem Immunosystem等公司，都已將相關(guān)的產(chǎn)品商業(yè)化。產(chǎn)品所涉及的 高分子種類(lèi)、特性及其與磁性?xún)?nèi)芯組成等各種各樣，應(yīng)用領(lǐng)域也越來(lái)越廣。目前，國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域大多處于研究階段。中科院成都有機(jī)所較早利用單體聚合 法進(jìn)行了磁性聚苯乙烯微粒的合成，并用于固定化中性蛋白酶的研究。南開(kāi)大學(xué)高 分子化學(xué)所研究了磁性葡聚糖毫微粒的合成，并探討了固定化酶的條件。中國(guó)專(zhuān)利CN03124061.5公開(kāi)的一種核/殼型超順磁性復(fù)合微粒及其制備方法與應(yīng)用，中國(guó)專(zhuān) 利CN03153486.4公開(kāi)的一種組裝型磁性復(fù)合微粒及其制備方法與應(yīng)用，中國(guó)專(zhuān)利 CN02139365.6公開(kāi)的一種磁性熒光微球及其制備方法和采用該磁性熒光微球進(jìn)行 生物分子檢測(cè)的方法，中國(guó)專(zhuān)利CN03134319.8公開(kāi)的一種磁性微球介導(dǎo)的微流體 分析系統(tǒng)及其檢測(cè)方法，均與磁性微粒的制備與應(yīng)用相關(guān)?！吨袊?guó)藥師》(陶利軍， 孫永海，張宏，劉建行9: 24-26, 2006)最近有文章報(bào)道了一種將亞甲藍(lán)包加在磁 性明膠微粒中以制備磁性藥物緩釋劑的方法，僅僅對(duì)產(chǎn)品的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。對(duì)吩 噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒用于滅活及去除血液及血液制品中病毒的方法及裝置則 未報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種凈化血液及血液制品的方法，其解決了背景技術(shù)中 無(wú)法將滅活后的病毒從血液或血液制品中完全去除的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下一種凈化血液及血液制品的方法，其實(shí)現(xiàn)步驟包括(1) 以吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒作為反應(yīng)和分離的固相載體，將吩噻嗪類(lèi) 染料修飾的磁性微粒加入待處理血液或血液制品中；比例為每1升待處理血液或血液制品中加入5 50mg吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒；(2) 將待處理血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒通過(guò)溫和振蕩混合均勻，吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒表面的吩噻嗪類(lèi)染料分子與血液或血液制品中的病毒作用，則病毒被吸附于吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒上；(3) 用波長(zhǎng)600 800nm的光照射血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性 微粒的混合物，激活鍵合在吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒表面的吩噻嗪類(lèi)染料，所 產(chǎn)生單線態(tài)氧及氫氧自由基將血液或血液制品中的病毒殺滅；(4) 用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合 物，作用時(shí)間10 30分鐘，則將吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒與被殺滅病毒的血液 或血液制品的混合物進(jìn)行分離，得到凈化血液或血液制品。上述用光照射殺滅血液或血液制品中的病毒的光波長(zhǎng)可為600 700nm;光照時(shí) 間一般為5 30分鐘；光照溫度一般可為4 30°C;用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液 制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合物，進(jìn)行分離的磁場(chǎng)強(qiáng)度一般可為 2500 3500高斯。上述用光照射殺滅血液或血液制品中的病毒的光的波長(zhǎng)優(yōu)選660nm;光照時(shí)間 以10分鐘為宜；光照溫度20 25"C即可；用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合物，進(jìn)行分離的磁場(chǎng)強(qiáng)度優(yōu)選3000高斯。上述吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒以采用水或生理鹽水為介質(zhì)的膠體狀態(tài)的吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒為宜。上述用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合物，進(jìn)行分離的磁性分離裝置一般采用圓柱狀容器或管道，以及設(shè)置于該圓柱狀容器或管道外周的磁場(chǎng)構(gòu)成。磁性分離裝置的圓柱狀容器或管道可采用高分子材料或玻璃，優(yōu)選透明有機(jī)玻璃材料。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)，殺滅及去除病毒效率高。操作容易，不需復(fù)雜設(shè)備，成本低。本發(fā) 明無(wú)染料殘留，無(wú)毒副作用，安全可靠，既能殺滅血液及血液制品中的病毒，又能 將滅活后的病毒從血液或血液制品中完全去除，還能去除殺滅病毒所采用的物質(zhì)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)歩驟如下 (1)以吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒作為反應(yīng)和分離的固相載體，將吩噻嗪類(lèi) 染料修飾的磁性微粒加入待處理血液或血液制品中；比例為每1升待處理血液或血 液制品中加入5 50mg吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒。吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微 粒以采用水或生理鹽水為介質(zhì)的膠體狀態(tài)的吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒為宜。(2 )將待處理血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒通過(guò)溫和振蕩混 合均勻，吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒表面的吩噻嗪類(lèi)染料分子與血液或血液制品 中的病毒作用，則病毒被吸附于吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒上。(3) 用波長(zhǎng)600 800nm的光照射血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性 微粒的混合物，激活鍵合在吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒表面的吩噻嗪類(lèi)染料，所 產(chǎn)生單線態(tài)氧及氫氧自由基將血液或血液制品中的病毒殺滅。用光照射殺滅血液或 血液制品中的病毒的光波長(zhǎng)以600 700nm為宜，優(yōu)選波長(zhǎng)660nm的光。光照時(shí)間一 般可為5 30分鐘，通常IO分鐘為宜。光照溫度可為4 30'C，通常20 25'C或室 溫為宜。(4) 用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合 物，作用時(shí)間10 30分鐘，將吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒與被殺滅病毒的血液或 血液制品的混合物進(jìn)行分離，得到凈化血液或血液制品。用外加磁場(chǎng)進(jìn)行分離，磁 場(chǎng)強(qiáng)度以2500 3500高斯為宜，優(yōu)選3000高斯。磁性分離裝置一般可采用圓柱狀 容器或管道，在該圓柱狀容器或管道外周設(shè)置磁場(chǎng)構(gòu)成。磁性分離裝置的圓柱狀容 器或管道可采用高分子材料或玻璃，優(yōu)選透明有機(jī)玻璃材料。其中R,、 R9分別表示H、低級(jí)烷基或低級(jí)芳烷基；R2表示H或低級(jí)烷基；R3、 & 分別表示低級(jí)烷基；n表示2 5之間的整數(shù)；P表示微米級(jí)？^04磁性微粒；低級(jí) 烷基為含1 6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，低級(jí)芳烷基為連接有芳基的低級(jí)烷基。本發(fā)明的血液主要是指全血或各種成分血，如濃縮紅細(xì)胞、洗滌紅細(xì)胞、代槳 血、少白細(xì)胞的紅細(xì)胞、冰凍紅細(xì)胞、濃縮血小板、新鮮冰凍血漿、冰凍血漿、冷 沉淀等。血液制品主要是指白蛋白、丙種球蛋白、特異性免疫球蛋白、濃縮VIII 因子、凝血酶原復(fù)合物、干擾素、轉(zhuǎn)移因子等。血液或血液制品中的病毒主要是指 含有包膜的RNA病毒，如丙肝病毒(HCV)以及反轉(zhuǎn)錄病毒艾滋病病毒(HIV) 等；或含有包膜的DNA病毒，如乙肝病毒(HBV)等。實(shí)施例1:向臨床袋裝的200ml血液中加入3mg吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒， 以660nm波長(zhǎng)光照射20分鐘，將血袋置于3000高斯強(qiáng)磁場(chǎng)中，使磁性微粒沉淀下 來(lái)，實(shí)現(xiàn)與血液的分離。凈化后的血液可直接用于臨床輸注。實(shí)施例2:每15升血液或血液制品屮加入0. 2g吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒。 磁性分離裝g^用直徑20cm、容積20升的細(xì)長(zhǎng)透明圓柱狀容器固定在支架上，容器兩 端設(shè)置有液體引入接口及流出接口，圓柱狀容器外周設(shè)有若干可產(chǎn)生波長(zhǎng)60Q 700nm 光線的燈管。將血液或血液帝IJ品與吩噻麟染料斷袖勺磁性微粒的混^物弓l入磁性分離 器，并緩廈箭dl磁性分離驢，圓柱狀容器在電機(jī)^^力下繞軸緩慢旋轉(zhuǎn)，光照30^H中， 溫度為室。凈化后的血液可直接罐裝入血袋于血站貯存或直接用于臨床輸注。本發(fā)明吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)為:<formula>formula see original document page 7</formula>
權(quán)利要求
1. 一種凈化血液及血液制品的方法，其實(shí)現(xiàn)步驟包括(1)以吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒作為反應(yīng)和分離的固相載體，將吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒加入待處理血液或血液制品中；比例為每1升待處理血液或血液制品中加入5～50mg吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒；(2)將待處理血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒通過(guò)溫和振蕩混合均勻，吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒表面的吩噻嗪類(lèi)染料分子與血液或血液制品中的病毒作用，病毒被吸附于吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒上；(3)用波長(zhǎng)600～800nm的光照射血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合物，激活鍵合在吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒表面的吩噻嗪類(lèi)染料，所產(chǎn)生單線態(tài)氧及氫氧自由基將血液或血液制品中的病毒殺滅；(4)用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合物，作用時(shí)間10～30分鐘，則將吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒與被殺滅病毒的血液或血液制品的混合物進(jìn)行分離，得到凈化血液或血液制品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凈化血液及血液制品的方法，其特征在于所述用光 照射殺滅血液或血液制品中的病毒的光波長(zhǎng)為600 700nm;所述的光照時(shí)間為5 30分鐘；所述的光照溫度為4 3(TC;所述用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩 噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合物，進(jìn)行分離的磁場(chǎng)強(qiáng)度為2500 3500高斯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凈化血液及血液制品的方法，其特征在于所述用光 照射殺滅血液或血液制品中的病毒的光的波長(zhǎng)為660ran;所述的光照時(shí)間為10分 鐘；所述的光照溫度為20 25°C;所述用外加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩噻 嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒混合物，進(jìn)行分離的磁場(chǎng)強(qiáng)度為3000高斯。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的凈化血液及血液制品的方法，其特征在于所述的吩 噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒是以水或生理鹽水為介質(zhì)的膠體狀態(tài)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的凈化血液及血液制品的方法，其特征在于所述用外 加磁場(chǎng)作用于血液或血液制品與吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的混合物進(jìn)行分離， 進(jìn)行分離的磁性分離裝置由圓柱狀容器或管道以及設(shè)置于該圓柱狀容器或管道外 周的磁場(chǎng)構(gòu)成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的凈化血液及血液制品的方法，其特征在于所述磁性 分離裝置的圓柱狀容器或管道為高分子材料、玻璃或透明有機(jī)玻璃材料。
全文摘要
一種凈化血液及血液制品的方法，其以吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒作為反應(yīng)和分離的固相載體，按每1升待處理血液或血液制品中加入5～50mg吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒的比例加入這種磁球并混合均勻，則病毒被吸附于吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒上，用波長(zhǎng)600～800nm的光照射，激活鍵合在吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒表面的吩噻嗪類(lèi)染料，所產(chǎn)生單線態(tài)氧及氫氧自由基將病毒殺滅，用外加磁場(chǎng)將吩噻嗪類(lèi)染料修飾的磁性微粒與被殺滅病毒的血液或血液制品的混合物進(jìn)行分離，得到凈化血液或血液制品。本發(fā)明解決了背景技術(shù)中無(wú)法將滅活后的病毒從血液或血液制品中完全去除的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明特異性強(qiáng)，無(wú)染料殘留，操作簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)A61L101/40GK101273996SQ20071001764
公開(kāi)日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者超 陳, 高文運(yùn) 申請(qǐng)人:陜西北美基因股份有限公司