專利名稱：增強保護性免疫應答的方法
本申請為美國專利申請No.08/607,509的部分繼續(xù)申請，后者遞交于1996年2月23號，為遞交于1995年6月6號的美國專利申請No.08/488,386的部分繼續(xù)申請，申請No.08/488,386為遞交于1994年4月22號的美國專利申請No.08/232,543的部分繼續(xù)申請。
本發(fā)明大體涉及在病人體內(nèi)、分離細胞和細胞培養(yǎng)中增強免疫應答的化合物和方法。本發(fā)明特別涉及包含作為真核啟動因子4A(eIF4A)同源類似物的利什曼原蟲抗原的全部或部分的化合物及其在刺激免疫應答的疫苗中的應用。
疫苗通常通過在病人體內(nèi)產(chǎn)生對感染或疾病相關的特異性抗原的免疫應答來引發(fā)對感染或疾病的免疫。利用現(xiàn)代技術對適當抗原的識別和應用使試驗和發(fā)展大量針對常見感染(包括細菌，病毒和原生動物感染)以及像癌等疾病的疫苗變得可能。
但是，在許多情況下，純化的抗原免疫原性很低，即一個特異性抗原所產(chǎn)生的免疫應答盡管針對需要的靶位，但沒有足夠的強度提供免疫保護。在這種情況下，必須加入一種免疫調(diào)節(jié)劑，如一種佐劑或免疫刺激劑，來加強免疫應答。佐劑是那種與抗原同時注射或與抗原注射于同一部位時可加強抗原特異性免疫應答的物質(zhì)。佐劑的作用機理很多，包括以下幾種(1)捕捉并緩慢釋放抗原，(2)促使細胞向注射部位移動，(3)刺激或捕捉淋巴細胞，或是刺激淋巴細胞增殖，(4)促進抗原在病人體內(nèi)散布。例如，油類、聚合物、礦物鹽和脂質(zhì)體由于具有這方面的特點而被用作佐劑。與佐劑相此，免疫刺激物是那種引發(fā)病人免疫應答普遍性、階段性提高的物質(zhì)，這種提高與其是否于與抗原同時注射無關。細菌是典型的免疫刺激物，如BCG(結核分枝桿菌的一種減毒株)或小棒狀桿菌的失活株。無論哪一種機制，佐劑和免疫刺激物都是通過非特異的方式來增強目的特異性免疫應答。
目前可得到的許多佐劑的一個嚴重缺陷是其毒性。一般說來，最合適的佐劑(即能夠最大限度地增強目的免疫應答的那些)同時毒性也最大。因此，實施者必須不斷權衡佐劑的刺激水平和毒性。
因此，有必要發(fā)現(xiàn)既可以提供想要的對特異性免疫應答的增強作用，而毒性又低的化合物。本發(fā)明不僅滿足了這方面的需要，而且進一步具有其他相關優(yōu)點。
簡而言之，本發(fā)明提供了有關與真核核糖體蛋白eIF4A同源的利什曼原蟲抗原LbeIF4A或LmeIF4A的化合物和方法。一方面，本發(fā)明提供了在病人體內(nèi)增強或引發(fā)對一種抗原和/或DNA疫苗編碼抗原免疫應答的方法，包括給予病人一種抗原和/或DNA疫苗以及一種LbeIF4A多肽，該LbeIF4A多肽包括選自下組的一個DNA序列編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下可以同SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸互補鏈雜交的DNA序列，其中的DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。另一方面，本發(fā)明提供了在病人體內(nèi)增強或引發(fā)對一種抗原和/或DNA疫苗編碼抗原免疫應答的方法，包括給予病人一種抗原和/或DNA疫苗以及一種LmeIF4A多肽，該LbeIF4A多肽包括選自下組的一個DNA序列編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO.3 117-1325位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下可以同SEQ ID NO.3 117-1325位核苷酸互補鏈雜交的DNA序列，其中的DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
在其他相關方面，本發(fā)明提供了在病人體內(nèi)增強或引發(fā)對一種抗原和/或DNA疫苗編碼抗原免疫應答的方法，包括給予病人一種抗原和/或DNA疫苗以及一種LbeIF4A多肽，該LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO.2 49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體，或給予一種抗原和/或DNA疫苗以及一種LmeIF4A多肽，該LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO.4 49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
在另外的相關方面，本發(fā)明提供了在生物樣本中增強免疫應答的方法，包括將生物樣本與一種抗原和/或DNA疫苗編碼的抗原以及上面提到的一種LbeIF4A多肽接觸，其中生物樣本包括選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞以及其組合的細胞。
在另一相關方面，本發(fā)明提供了在生物樣本中增強或引發(fā)免疫應答的方法，包括將生物樣本與如上所述的LmeIF 4A多肽接觸，其中生物樣本含有選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞及其組合的細胞。
在另一相關方面，本發(fā)明提供了在病人體內(nèi)增強對一種腫瘤免疫應答的方法，包括給予病人一種腫瘤抗原和/或DNA疫苗以及上面提到的一種LbeIF4A多肽或LmeIF4A多肽。
在另一相關方面，本發(fā)明提供了治療病人體內(nèi)一種腫瘤的方法，包括給予病人上面提到的一種LbeIF4A多肽或LmeIF4A多肽。
在上面所提到的每個方面中，可以用病毒載體或核酸分子(總稱為“核酸組份”)替代LbeIF4A或LmeIF4A多肽，這種核酸組份指采用感染或轉染了核酸組份的病人細胞表達這些多肽。核酸組份的給藥步驟可以體內(nèi)或離體方式進行，后者包括隨后給予感染/轉染細胞。另外，當給予一抗原或腫瘤抗原時，顯然也可以設計核酸組份以指導這種抗原的表達(應用相同或不同的載體或核酸分子)。
參照下面的詳細說明及附圖可對本發(fā)明上述的各個方面和其他方面有更清楚的了解。本文所引用的參考文獻以其整體引入本文作為參考，相當于每篇逐一引入。


圖1給出的是利什曼原蟲DNA Southern印跡分析的結果，表明利什曼原蟲中保持了eIF4A同源性，并且L.braziliensis基因組DNA至少含有LbeIF4A的兩個拷貝。
圖2為一免疫印跡分析結果，它證明了LbeIF4A免疫免血清可以同不同種利什曼原蟲的一個約45KDa的優(yōu)勢蛋白反應。
圖3說明了純化的重組LbeIF4A可以刺激L.braziliensis感染個體外周血單核細胞的增殖。
圖4A和4B給出的是確認為有L.braziliensis感染的病人外周血單核細胞中細胞因子mRNA表達模式的分析結果。
圖5表明經(jīng)LbeIF4A或蟲體裂解物刺激后，感染了L.braziliensis的病人外周血單核細胞分泌的IFN-γ上清水平。
圖6表明經(jīng)LbeIF4A或蟲體裂解物刺激后，感染了L.braziliensis的病人外周血單核細胞分泌的IFN-α上清水平。
圖7A-D表明，用LbeIF4A刺激病人外周血單核細胞分泌到培養(yǎng)上清中的IL-12要比用蟲體裂解物刺激的IL-12水平明顯高，并且IL-10抑制IL-12的產(chǎn)生。
圖8A和B證明，在所有被檢測病人外周血單核細胞中IFN-γ的產(chǎn)生依賴于IL-12，但被IL-10抑制。
圖9A和9B表明LbeIF4A可刺激培養(yǎng)的人巨噬細胞及粘附性外周血單核細胞中IL-12的產(chǎn)生。
圖10表明LbeIF4A可刺激人骨髓白血病細胞系THP-1中IL-12p40的產(chǎn)生，并與IFN-γ協(xié)同作用刺激THP-1細胞分泌IL-12。
圖11是表明LbeIF4A致敏的小鼠淋巴結細胞增殖并分泌幾乎單一的Th1細胞因子的結果。
圖12說明LbeIF4A對一個與人類疾病相關的動物模型的L.major感染可提供顯著的保護。
圖13說明用代表性LmeIF4A多肽引發(fā)了抗-卵清蛋白CTL。
圖14說明代表性LmeIF4A多肽用作佐劑引發(fā)三硝基苯酚特異抗體。
圖15表明代表性LmeIF4A多肽可提高抗-MUC-1抗體的產(chǎn)生。
圖16表明代表性LmeIF4A多肽在培養(yǎng)細胞中可增強特異性的CTL活性。
圖17表明IL-2自身或同LmeIF4A多肽一起對CTL活性的體外刺激作用。
圖18表明LmeIF4A多肽對鼠同種異體性CTL的誘導作用。
圖19顯示了包含于微球體的腫瘤抗原和LmeIF4A多肽給藥后的腫瘤抑制。
圖20顯示了包含于微球體的腫瘤抗原和LmeIF4A多肽給藥后的腫瘤抑制。
圖21顯示了包含于微球體的腫瘤抗原和可溶性LmeIF4A多肽給藥后的腫瘤抑制。
上文已提到，一般本發(fā)明涉及在病人或細胞培養(yǎng)中增強體液和/或細胞介導的免疫應答。在本發(fā)明的情形內(nèi)，如文中所述對一抗原包括一免疫激活抗原(即可以引起病人免疫應答的抗原)的免疫應答可通過同時給予病人該抗原和一種或多種來源于LbeIF4A或LmeIF4A的多肽來引發(fā)或加強?？乖兔庖呒せ羁乖ǔ榈鞍追肿?，包括來源于病毒如HIV、HBV、流感病毒、呼吸道合胞病毒，細菌如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌，寄生蟲如利什曼原蟲和錐蟲的分子。另外，可以通過給予病人腫瘤抗原(即刺激產(chǎn)生對腫瘤的免疫應答如CTL)來引發(fā)或增強對腫瘤的免疫應答。在本發(fā)明的情形中，腫瘤抗原包括病毒編碼的分子、MAGE-1、Her-2、PSA以及其他分子。因此本發(fā)明的方法包括特異抗原或免疫激活抗原和本文所公開的LeIF4A來源的多肽共同給藥。對腫瘤的治療可以只給予病人LbeIF4A或LmeIF4A多肽而無需外源性腫瘤抗原。
本發(fā)明的LbeIF4A和LmeIF4A多肽也可用于引發(fā)或增強對DNA疫苗編碼抗原的免疫應答。DNA疫苗編碼一個或幾個免疫激活抗原，使這些抗原就地產(chǎn)生。例如，DNA疫苗可編碼一腫瘤抗原并有選擇地編碼本文所提到的LbIF4A來源的多肽。在這種疫苗中，DNA可以存在于本領域普通技術人員已知的許多轉移系統(tǒng)的任一種中，包括核酸表達系統(tǒng)，細菌和病毒表達系統(tǒng)。適當?shù)暮怂岜磉_系統(tǒng)含有在病人體內(nèi)表達所必需的DNA序列(如合適的啟動子)。細菌轉移系統(tǒng)包括使用可在細胞表面表達前列腺細胞抗原一抗原決定簇的細菌(如卡介苗)。DNA可以通過病毒表達系統(tǒng)(如痘苗或其他痘病毒，逆轉錄病毒或腺病毒)引入，其中應用的為非致病性(缺陷)但可復制的病毒。合適的系統(tǒng)在文獻中已有提及，如Fisher-Hich等，美國國家科學院研究進展(PNAS)86317-321，1989；Flexner等，紐約科學院年鑒(Ann N.Y.Acad.Sci.)56986-103，1989；Flexner等，疫苗(Vaccine)817-21，1990；美國專利號4,603,112，4,796,330和5,017,487；WO89/01973；美國專利號No.4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner，生物技術(Biotechniques)6616-627，1988；Rosenfeld等，科學(Science)252431-434，1991；Kolls等，美國國家科學院研究進展91215-219，1994；Kass-Eisler等，美國國家科學院研究進展，9011498-11502，1993；Guzman等，循環(huán)(Circulation)882838-2848，1993；Guzman等，循環(huán)研究(Cir.Res.)731202-1207，1993。本領域的技術人員對于DNA摻入表達系統(tǒng)的技術都很了解。DNA可以為“裸露”的，如出版的PCT申請WO90/11092和Ulmer等，科學2591745-1749，1993以及Cohen，科學2591691-1692，1993綜述中所述。將DNA包被于可生物降解的小珠中，借助后者有效地轉入細胞可提高裸露DNA的吸收。本發(fā)明的化合物通常包括可刺激外周血單核細胞(PBMC)中Th1或CTL(細胞毒T淋巴細胞)免疫應答的多肽。特別是公開了包括L.braziliensis或L.major真核核糖體蛋白eIF4A同源類似物的全部或其刺激活性部分(本文稱之為LbeIF4A和LmeIF4A)的多肽。本文中“外周血單核細胞”是指外周血中核細胞的制備物?！岸嚯摹痹诒景l(fā)明中指包括全長蛋白及其部分蛋白在內(nèi)的各種長度的氨基酸鏈，其中氨基酸分子之間以共價肽鏈相連。因此，“多肽LbeIF4A”包括LbeIF4A，或其保留刺激活性的部分蛋白或其變體。同樣，“多肽LmeIF4A”包括LmeIF4A或其保留刺激活性的部分蛋白或其變體。本文“LeIF4A”指LbeIF4A或LmeIF4A。盡管LbeIF4A在本文中作為實例，在本發(fā)明中同樣可用LmeIF4A或其部分蛋白，或其變體(或其變體的部分蛋白)。多肽LeIF4A可全部由一個或多個LeIF4A刺激活性部分組成，這些刺激活性部分包含在包括另外LeIF4A序列和/或LeIF4A同源氨基酸序列的較大蛋白中。優(yōu)選多肽基本不含有外源物質(zhì)的污染。
本發(fā)明的多肽包括對外周血單核細胞中Th1或細胞毒T淋巴細胞免疫應答具有刺激活性的LeIF4A變體。這些變體包括主蛋白的各種結構形式。例如，由于可離子化氨基和羧基的存在，LeIF4A多肽可以為酸性鹽或堿性鹽或中性形式。單個氨基酸殘基可通過氧化或還原來修飾。
本發(fā)明范圍內(nèi)的變體還包括LeIF4A一級結構或其片段經(jīng)修飾同其他多肽或者象糖基、脂類、磷酸、乙?；邦愃频幕瘜W基團組成共價或聚集性偶聯(lián)物。共價衍生物可通過在氨基酸側鏈或氨基或羧基末端連接上特殊的功能基來制備。或者，對于另一多肽連接到LeIF4A多肽上形成的衍生物，可以象下面所講的那樣通過重組DNA技術來制備融合蛋白。在一種這樣的實施方案中，LeIF4A多肽可在其氨基端區(qū)域連接上一段信號(或前導)多肽序列，后者在共翻譯時或翻譯后可指導LeIF4A多肽由合成部位轉移到細胞膜或細胞壁內(nèi)側或外側的功能部位(如酵母α-因子前導序列)。
本發(fā)明中的蛋白融合體也可以包括連接上可方便LeIF4A多肽純化和識別的肽鏈(如多聚組氨酸)。例如Hopp等在《生物技術》(Bio/Technology)61204(1988)中描述了一種可用于幫助鑒別的高免疫原性肽。此肽含有一個抗原決定簇，它與一特異的單克隆抗體可逆地結合，這使得表達的重組蛋白易于檢測和純化。Hopp等所提到的序列還可被牛粘膜腸激酶特異性切割，如此可以從純化的蛋白中去除該肽。帶有此類肽鏈的融合蛋白還可耐受大腸桿菌的細胞內(nèi)降解。
本發(fā)明中的蛋白融合體也包括例如連有一免疫球蛋白Fc區(qū)的LeIF4A多肽。假如LeIF4A融合蛋白包含一抗體的重鏈和輕鏈，就有可能形成多到4個LeIF4A蛋白區(qū)的蛋白寡聚體。LeIF4A多肽連接上亮氨酸拉鏈區(qū)也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。亮氨酸拉鏈區(qū)在例如PCT申請WO94/10308中有述。包含亮氨酸拉鏈的LeIF4A多肽可以是例如寡聚體、二聚體或三聚體。所有上面的蛋白融合體可如下所述通過化學連接或以融合蛋白的形式制備。
優(yōu)選的蛋白融合體包括含有有益于刺激對感染性病原體(如抗原)免疫的序列。這種序列可能來自于例如病毒、腫瘤細胞、寄生蟲或細菌。
本發(fā)明也包括帶有或不帶有自身模式糖基化的LeIF4A多肽。表達于酵母或哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的多肽在分子量和糖基化模式上同原分子類似或稍有不同，這取決于表達系統(tǒng)。如，編碼LeIF4A多肽的DNA在象大腸桿菌這樣的細菌中表達時不會有糖基化分子的產(chǎn)生。真核蛋白氨基N-糖基化位點的特征是氨基酸三連體Asn-A1-Z，其中A1為脯氨酸之外的所有氨基酸，Z為絲氨酸或蘇氨酸。本發(fā)明范圍內(nèi)也包括氨基糖基化位點失活的LeIF4A多肽變體，通過本領域普通技術人員所知技術如寡核苷酸的合成和連接，或點突變技術即可得到。或者，在LeIF4A多肽中增加N-連接的糖基化位點。
本發(fā)明也包括如下LeIF4A多肽變體，此變體的氨基酸序列由于一個或幾個缺失、插入、替代或其他修飾而有別于原LeIF4A蛋白。這類變體應與原LeIF4A充分同源并且保持對外周血單核細胞中Th1或細胞毒T淋巴細胞免疫應答的刺激活性。這里的“充分同源”的變體指可由能夠在中等嚴緊的條件下同編碼如LbeIF4A的原DNA序列雜交的DNA序列編碼的氨基酸序列。適當?shù)闹械葒谰o條件包括用5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)預洗；5×SSC 50℃-65℃雜交過夜；然后分別用2×，0.5×，0.2×SSC(含0.1％SDS)65℃洗兩次，每次20分鐘。這類雜交的DNA序列也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。變異對LbeIF4A多肽活性的影響可通過用本文所描述的任何方法分析變異LbeIF4A多肽引發(fā)Th1或細胞毒T淋巴細胞免疫應答的能力而加以確定。優(yōu)選的LbeIF4A多肽變體是L.major中LbeIF4A的同源類似物(LmeIF4A)。
一般說來，氨基酸的替代應該是保守性的，即替代氨基酸應與被替代氨基酸性質(zhì)類似，這樣，蛋白質(zhì)化學領域的熟練技術人員可預料多肽的二級結構和疏水性不會有顯著改變。通常，下面各組內(nèi)的氨基酸的替代表現(xiàn)出保守性(1)丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，絲氨酸，蘇氨酸；(2)半胱氨酸，絲氨酸；酪氨酸，蘇氨酸；(3)纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸；(4)賴氨酸，精氨酸，組氨酸；和(5)苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，組氨酸。本發(fā)明范圍內(nèi)的變體也可同時包括或代之以其他對多肽刺激活性、二級結構和疏水性僅有微弱影響的修飾，包括氨基酸的刪除或增加。一般說來，LbeIF4A片段可通過刪除末端或中間的殘基或序列來構建。通過比較LbeIF4A和eIF4A家族其他成員的序列和結構可以為適當修飾提供另外的指導。例如，生物活性非必需的LbeIF4A末端或中間的殘基或序列可以被刪除。半胱氨酸可被刪除或代之以其他氨基酸以防止復性時形成非正確的分子內(nèi)二硫橋。其他誘變方法包括修飾相鄰三元氨基酸殘基以提高在帶有KEX2蛋白酶活性的酵母系統(tǒng)中的表達。
一個LeIF4A全長蛋白一般可用編碼此蛋白的基因組或cDNA來獲得。SEQ ID NO1顯示的是編碼全長LbeIF4A的基因序列，SEQID NO2給出的是其推定的氨基酸序列。SEQ ID NO3顯示的是編碼全長LmeIF4A的基因序列，SEQ ID NO4給出的是其推定的氨基酸序列。通過在適當?shù)腖.braziliensis或L.major表達文庫中篩選能夠表達對粘膜利什曼病患者血液應答的抗原的克隆，然后分析反應性抗原在病人T細胞檢測中刺激增殖應答和產(chǎn)生優(yōu)勢Th1細胞因子的能力以及在病人T細胞中刺激CTL反應的能力，如此即可分離出上述克隆。文庫的制備及篩選可通過本領域普通技術人員所熟知的方法進行，如Sambrook等，分子克隆實驗室操作手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989中所述的方法，此書作為參考而在本文中引用。簡而言之，可將一噬菌體表達文庫涂板并轉移到濾膜上，然后同血清和檢測試劑一起孵育。在本發(fā)明中，“檢測試劑”包括所有能夠同抗原-抗體復合物結合，然后用本領域普通技術人員所熟知的任何技術能夠檢測的化合物。典型的檢測試劑含有偶連有一報告基團的“結合劑”，如蛋白A、蛋白G、IgG或凝集素。優(yōu)選的報告基團包括酶、底物、輔助因子、抑制因子、染料、放射性核素、發(fā)光基團、熒光基團和生物素。更為優(yōu)選的報告基團為辣根過氧化物酶，同其底物如2，2’-連氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸一起孵育即可檢測此酶。表達與血清中抗體結合之蛋白的基因序列或cDNA序列包含于某一噬菌斑中，通過本領域普通技術人員所掌握的技術可以分離并純化此噬菌斑。例如，適用方法可在Sambrook等，分子克隆實驗室操作手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989中找到。
病人T細胞檢測的一般做法是用應答抗原處理病人PBMC，然后分析細胞的適當反應。例如，PBMC上清可用于檢測所分泌細胞因子的水平。檢測的細胞因子優(yōu)選為干擾素-γ、白介素-2、白介素-12(p40亞單位或具生物活性的p70)、白介素-1或腫瘤壞死因子-α同樣可檢測細胞因子白介素-4和白介素-10，因為這些典型的Th-2型細胞因子的表達水平通常會因本文所述多肽的作用而降低。例如，對細胞因子的檢測可以是把商業(yè)途徑可獲得的目標細胞因子的特異抗體用于ELISA法，根據(jù)生產(chǎn)商的說明確定陽性結果。適用抗體可購自例如Chemicon、Temucula，CA和PharMingen、San Diego，CA?；蛘?，經(jīng)處理的PBMC可用來檢測編碼干擾素-γ、白介素2、白介素12p40亞單位、白介素1或腫瘤壞死因子-α中一種或幾種細胞因子的mRNA，或用來按本文所述檢測增殖應答。或者通過檢查PBMC上清中細胞因子特異性生物活性來測定細胞因子。
保持在PBMC中對Th1免疫應答刺激能力的LbeIF4A變體一般可通過從上文所述的一個或幾個方面對序列加以修飾，并檢測所形成的多肽對Th1應答的激活能力來識別。這類檢測的做法一般為如上文所述，用修飾過的多肽處理病人PBMC并測定反應。天然存在的LbeIF4A變體也可從其他種的利什曼原蟲中分離到，如應用LbeIF4A或其變體的編碼DNA序列對一合適的基因或cDNA文庫進行篩選。
上面所述的序列修飾可用標準的重組技術或人工合成修飾多肽來引入。如通過合成含有一種兩側帶有限制性酶切位點(使之可連入原序列片段)的變異序列的寡核苷酸可在特定位點引入變異。連接后產(chǎn)生的改造序列所編碼的類似物即帶有需要的氨基酸插入、替代或缺失。
或者，寡核苷酸指導下的點突變方法可用于提供一帶有所需替代、缺失或插入而使特定密碼子改變的基因。上文提出的突變方法的例子見于Walder等，基因42133，1986；Bauer等，基因3773，1985；Craik，生物技術，一月，1985，12-19；Smith等，基因工程原理和方法(Genetic Engineering Principles and Methods)，Plenum Press，1981；美國專利No.4,518,584和4,737,462。
所構建的用來表達這類LbeIF4A多肽的核酸序列的變異當然必須保持編碼序列的讀碼框架，并且最好不產(chǎn)生能夠與之互補產(chǎn)生影響受體mRNA翻譯的mRNA二級結構，如環(huán)或發(fā)夾結構。盡管變異位點可預先確定，變異自身的性質(zhì)卻無須預先確定。例如，為了挑出一定點變異的最佳特性，可以對靶密碼子進行隨機誘異，然后在表達的LbeIF4A蛋白中篩選帶有所需活性的蛋白變體。
并非所有LbeIF4A蛋白編碼核酸序列的變異都會表達在終產(chǎn)物中。例如，核酸替代可用來提高表達，主要用來避免轉錄mRNA中二級結構環(huán)的生成(例如可參閱歐洲專利申請75,444A)，或是提供更易于被所選宿主翻譯的密碼子，如眾所周知的大腸桿菌表達的大腸桿菌優(yōu)選密碼子。
本發(fā)明的多肽，包括天然存在的和修飾過的，優(yōu)選用重組DNA技術得到，這種方法包括將一段編碼LbeIF4A多肽的DNA序列插入一重組表達載體，在促進表達的條件下將此DNA序列于一個重組的微生物、哺乳動物或昆蟲細胞表達系統(tǒng)中表達。編碼本發(fā)明所提供多肽的DNA序列可以由cDNA片段和短的寡核苷酸連接子或由一系列寡核苷酸組裝起來，以提供一能夠插入重組表達載體并在一個重組轉錄單位中表達的合成基因。
重組表達載體包括編碼LeIF4A多肽的DNA序列，此序列可操作地連接上來自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的適當轉錄或翻譯調(diào)節(jié)元件。這些調(diào)節(jié)元件包括后面將會提到的一個轉錄啟動子，一個控制轉錄的可選擇的操縱子序列，一段適當?shù)木幋amRNA核糖體結合位點的序列，以及控制轉錄和翻譯終止的序列。另外可加入一復制起點和一個有助于識別轉化子的選擇性標記。
功能相關的DNA區(qū)被可操作性地連接起來。例如，假如一信號肽(分泌性前導肽)的編碼DNA參與了一個多肽的分泌，可將其同多肽的編碼DNA可操作性地連接。如一啟動子控制一個編碼序列的轉錄，可將二者可操作性地連接，或假如一核糖體結合區(qū)可使一個編碼序列定位以便翻譯，可將二者可操作性地連接。一般說來，可操作性連接意味著連續(xù)性，對分泌型前導序列來說，意味著在同一讀碼框架中。用于微生物表達的LeIF4A多肽的編碼序列優(yōu)選不包括可過早終止DNA轉錄為mRNA的內(nèi)含子。
用于細菌的表達載體可包含來自可通過商業(yè)途徑獲得帶有眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)基因元件的質(zhì)粒的一個選擇性標記和細菌復制起點。如，這些商業(yè)載體包括pKK223-3(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分同一個適當?shù)膯幼雍鸵磉_的結構基因序列相連。大腸桿菌通常用大腸桿菌質(zhì)粒pBR322(Bolivar等，基因295，1977)的衍生質(zhì)粒轉化。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因此為鑒定轉化細胞提供了簡單的方法。
重組微生物表達載體中常用的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，自然(Nature)275615，1978；Goeddel等，自然281544，1979)，色氨酸(Trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)84057，1980；歐洲專利申請36,776)和tac啟動子(Maniatis；分子克隆實驗室操作手冊，冷泉港實驗室，p412，1982)。一個特別有用的細菌表達系統(tǒng)使用了λ噬菌體PL啟動子和熱敏感抑制子cI85ts?？蓮拿绹湫团囵B(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)得到的帶有PL啟動子變體的質(zhì)粒載體，包括質(zhì)粒pHUB2(宿主菌為大腸桿菌JMB9株)(ATCC37092)和質(zhì)粒pPLc28(宿主菌為大腸桿菌RR1株)(ATCC53082)。
酵母載體中適當?shù)膯幼有蛄邪ㄒ韵碌鞍椎膯幼咏饘倭虻鞍祝?-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，生物化學期刊(J.Biol.Chem.)2552073，1980)或其他糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；Holland等，生物化學(Biochem.)174900，1978)，如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸變構酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸變構酶，磷酸葡萄糖變構酶以及葡萄糖激酶。用于酵母表達的適用載體和啟動子在R.Hitzeman等的歐洲專利中請73,657中有進一步描述。
優(yōu)選的酵母載體可以用用于在大腸桿菌中篩選和復制的pBR322的DNA序列(氨芐抗性基因和復制起點)和含有葡萄糖可抑制的ADH2啟動子和α-因子分泌前導序列的酵母DNA序列組裝。ADH2啟動子曾被Russell等(生物化學期刊，2582674，1982)和Beier等(自然，300724，1982)所描述。指導異源蛋白分泌的酵母α-因子前導序列可以插入到啟動子和要表達的結構基因中間(例如可參閱Kurjan等，細胞30933，1982和Bitter等，美國國家科學院研究進展815330，1984)。前導序列的近3’端經(jīng)修飾可帶上一個或幾個有用的限制性酶切位點以方便其同外源基因的融合。用于轉化脊椎動物細胞的表達載體，其轉錄和翻譯調(diào)控序列可以來源于病毒。如常用的啟動子和增強子來源于多瘤病毒、猴病毒40(SV40)和人巨細胞病毒。來源于SV40病毒基因組的基因序列，如SV40復制起點、早期和晚期啟動子、增強子、剪切和多聚腺嘌呤位點，可用于提供外源基因表達所需的其他基因元件。由于早期和晚期啟動子易于以同時帶有SV40復制起點的片段形式得到(Fiers等，自然273113，1978)因而特別有用。也可使用包括病毒復制起點中HindIII酶切位點到BglII酶切位點長約250bp的序列在內(nèi)的或短或長的SV40片段。另外，病毒基因組啟動子，調(diào)控和/或信號序列也可使用，前提是這些調(diào)控序列與所選擇的宿主細胞相容。例如，載體可依據(jù)Okayama和Berg，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)3280，1983所述而構建。
用于C127鼠乳房上皮細胞中哺乳動物受體cDNA高效穩(wěn)定表達的一個有用系統(tǒng)大致可如Cosman等(分子免疫(Mol.Immunol.)23935，1986)所述而構建。一優(yōu)選用于LbeIF4A蛋白DNA表達的真核載體是pDC406(McMahan等，歐洲分子生物學協(xié)會期刊(EMBOJ.)102821，1991)并包括來自SV40，人免疫缺陷病毒(HIV)和Epstein-Barr病毒(EBV)的調(diào)節(jié)序列。其他優(yōu)選載體有來自pDC406的pDC409和pDC410。通過用SV40大T抗原編碼序列替代pDC406中的EBV復制起點而得到p410。pDC409與pDC406的區(qū)別在于前者中多克隆位點外的一個BglII位點已被刪除，因而使多克隆位點內(nèi)的BglII位點成為單一位點。
用于象帶有EBV復制起點的pDC406和pDC409這樣的表達載體以附加體形式復制的一個有用細胞系為CV-1/EBNA(ATCC CRL10478)。CV-1/EBNA細胞系通過Epstein-Barr病毒核抗原-I(EBNA-1)編碼基因轉染CV-1細胞系而得到，在人CMV立即早期增強子/啟動子的作用下它可持續(xù)表達EBNA-1。
轉化的宿主細胞是指用應用DNA重組技術構建并帶有本發(fā)明的LbeIF4A多肽編碼序列的表達載體轉化或轉染而得到的細胞。轉化的宿主細胞可表達需要的LbeIF4A蛋白，但是用于LbeIF4A DNA克隆或擴增的轉化宿主細胞并不需要表達LbeIF4A蛋白。表達的LbeIF4A優(yōu)選分泌到培養(yǎng)液上清中(這一點取決于選擇的DNA)，但也可積累在細胞膜內(nèi)。
適用于重組蛋白表達的宿主細胞包括在適當啟動子調(diào)控下的原核細胞，酵母或較高級的真核細胞。原核細胞包括革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌，如大腸桿菌或桿菌。較高級的真核細胞包括下面所述的來自昆蟲或哺乳動物的成型細胞系。無細胞翻譯體系也可用于用源自本文公開的DNA結構的RNA產(chǎn)生LbeIF4A蛋白。例如，適用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的克隆和表達的載體在Pouwels等，克隆載體實驗室手冊(Cloning VectorsA Laboratory Manual)，Elsevier，紐約，1985中有所描述。
原核表達宿主也可用于表達LbeIF4A多肽，表達過程不需要大量的蛋白裂解和二硫鍵形成。原核表達載體一般包括一個或多個表型篩選標記，如一個編碼提供抗生素抗性或自營需要的蛋白的基因，和能夠被宿主菌識別的以保證在宿主菌中擴增的復制起點。適用于轉化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及假單胞菌屬、放線菌屬和肺炎球菌屬的不同菌種，也可使用其他宿主。
重組LbeIF4A多肽也可于酵母宿主中表達，優(yōu)選酵母宿主來自糖酵母屬，如啤酒糖酵母。其他如畢赤氏屬酵母和克魯維氏屬酵母也可使用。酵母載體一般包括來自酵母質(zhì)粒2μ的復制起點或一自主復制序列(ARS)，一個啟動子，編碼LbeIF4A多肽的DNA，多聚腺嘌呤和轉錄終止序列和一選擇基因序列。優(yōu)選酵母載體包括可使其同時轉化酵母和大腸桿菌的復制起點和選擇標記，如大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因，啤酒糖酵母trp1基因(可為失去在色氨酸中生長能力的酵母變異株提供篩選標記)和引導下游結構基因轉錄的高表達酵母基因啟動子。酵母宿主細胞中trp1的缺損通過轉化子在無色氨酸下生長為檢測轉化子提供了一個有效的環(huán)境。
適用的酵母轉化步驟為本領域技術人員所知。如Hind等(美國國家科學院研究進展751929，1978)所述技術包括在一含有0.67％酵母氮源培養(yǎng)基、0.5％酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、10mg/ml腺嘌呤以及20mg/ml尿嘧啶的選擇培養(yǎng)基中篩選Trp陽性轉化子。帶有ADH2啟動子的載體轉化的宿主菌株可在一含有1％酵母抽提物、2％蛋白胨，1％葡萄糖并補充80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)以表達相應蛋白。ADH2啟動子的去抑制有賴于葡萄糖的耗盡。酵母粗上清可通過過濾而收獲，進一步純化以前4℃存放。
不同的哺乳動物或昆蟲(如草地夜蛾或粉蚊夜蛾)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可用來表達重組蛋白。如用于在昆蟲細胞中產(chǎn)生外源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)綜述于Luckow和Summers，生物技術647，1988。適用的哺乳動物細胞系的例子包括猴腎COS-7細胞系(Gluzman，細胞23175，1981)和其他一些能夠表達適當載體的細胞系，如CV-1/EBNA(ATCCCRL 10478)、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、COS、NS-1、Hela和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包含非轉錄元件，如一個復制起點、連接到要表達基因上的一適當?shù)膯幼雍驮鰪娮?、其?’或3’端非轉錄旁側序列以及5’或3’端非翻譯序列，如必需的核糖體結合位點、一多聚腺嘌呤位點、剪切供體和受體位點以及轉錄終止序列。
純化的LbeIF4A多肽可以通過培養(yǎng)適當?shù)乃拗?載體系統(tǒng)來表達本發(fā)明的DNA的重組翻譯產(chǎn)物，然后從培養(yǎng)液或細胞抽提物中純化產(chǎn)物來制備。例如，重組蛋白分泌到培養(yǎng)液中的系統(tǒng)，其上清首先可以用商業(yè)途徑獲得的蛋白濃縮膜(如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)進行濃縮。濃縮之后，將濃縮物施加于一適當?shù)募兓|(zhì)上。例如，一適當?shù)挠H和基質(zhì)可包含結合于一適當支持物上的一個相反結構的蛋白(即通過基于結構的特異反應與LbeIF4A結合的蛋白)、或凝集素或抗體分子。或者應用一離子交換樹脂，如帶有二乙氨基乙基(DEAE)側團的基質(zhì)或底物。該基質(zhì)可以為丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或常用于蛋白純化的其他類型物質(zhì)。或者，應用陽離子交換方法。適用陽離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基基團的不同種類的不溶性基質(zhì)。優(yōu)選磺丙基基團。凝膠過濾層析也是LeIF4A的一種純化方法。
親合層析是純化LbeIF4A多肽的一種特別優(yōu)選的方法。例如，以包含免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白形式表達的LbeIF4A多肽可以用蛋白A或蛋白G親和層析來純化。同時，包含一亮氨酸拉鏈區(qū)的LbeIF4A蛋白可用含有亮氨酸拉鏈區(qū)特異抗體的樹脂來純化。LbeIF4A蛋白的單克隆抗體也可用于親和層析純化，使用方法為本領域所熟知。
最后，一種或多種應用疏水RP-HPLC介質(zhì)(如含有甲基側基或其他脂肪族基團的硅膠)的反相高效液相層析(RP-HPLC)方法可用來進一步純化LbeIF4A蛋白組分。部分或全部前面的純化方法的不同組合也可用于提供一外源重組蛋白。
產(chǎn)生于細菌培養(yǎng)中的重組LbeIF4A多肽的優(yōu)選分離方法是首先抽提細胞沉淀，然后是一次或多次濃縮，鹽析，水中離子交換，或排阻層析。高放液相層析(HPLC)可用作最后的純化步驟。用于重組LbeIF4A蛋白表達的微生物細胞可使用許多方便的方法加以裂解，包括凍融循環(huán)、超聲、物理裂解或是應用細胞裂解劑。
以分泌蛋白形式表達LbeIF4A多肽的酵母的發(fā)酵大大簡化了純化過程。來自大規(guī)模發(fā)酵的分泌重組蛋白可用類似于Urdal等(色譜雜志(J.Chromatog.)296171，1984)中所述的方法加以純化。這篇參考文獻描述了在一制備型HPLC柱上用兩個連續(xù)的反相HPLC步驟來純化重組的GM-CSF。
合成于重組子培養(yǎng)液的LbeIF4A多肽的制備物中可能含有包括蛋白在內(nèi)的非LbeIF4A細胞成分，其數(shù)量和性質(zhì)取決于用于從培養(yǎng)液中回收LbeIF4A蛋白的純化方法。這些成分通常來源于酵母，原核或人以外的真核細胞。這種制備物不含有在天然來源物種中一般與LbeIF4A蛋白相結合的其他蛋白。
自動合成提供了制備小于約100個氨基酸(典型地小于50個氨基酸)的本發(fā)明多肽的另一方法。例如，可應用商業(yè)途徑獲得的各種固相技術，如Merrifield固相合成法，其中將氨基酸順序地連到延伸的氨基酸鏈上(參閱Merrifield，美國化學協(xié)會期刊(J.Am.Chem.Soc.)852149-12146，1963)。用于多肽自動合成的設備可通過商業(yè)途徑購自供應商，如Foster City，CA的Applied Biosystems，Inc.，設備的操作依據(jù)生產(chǎn)商說明。
作為另外一個LbeIF4A多肽的存在形式，本發(fā)明包括能轉移編碼LeIF4A多肽或其部分多肽的核酸分子的組合物。這些組合物包括重組病毒載體(如逆轉錄病毒(參閱WO90/07936，WO91/02805，WO93/25234，WO93/25698，WO94/03622)，腺病毒(參閱Berker，生物技術6616-627，1988；Li等，人類基因治療(Hum.GeneTher.)4403-409，1993；Vincent等，Nat.Genet 5130-134，1993；Kolls等，美國國家科學院研究進展91215-219，1994)，痘病毒(參閱美國專利No.4,769,330；美國專利No.5,017,487，WO89/01973)，裸露DNA(參閱WO90/11092)，復合于一多聚陽離子分子的核酸分子(參閱WO93/03709)，和與脂質(zhì)體結合的核酸(參閱Wang等，美國國家科學院研究進展84；7851，1987)。在某些實施方案中，DNA上可連上被殺死或失活的腺病毒(Curiel等，人類基因治療3147-154，1992；Cotton等，美國國家科學院研究進展896094，1992)。其他適用的組合物包括DNA-配基(參閱Wu等，生物化學期刊26416985-16987，1989)和脂類-DNA復合物(參閱Felgner等，美國國家科學院研究進展，847413-7417，1989)。另外，將裸露DNA包被于可生物降解的膠質(zhì)小珠中可提高其進入細胞的效率。
除了直接的體內(nèi)程序，也可使用離體程序，其中來自動物的細胞改造后移入同一或另一動物。顯而易見，在離體法中，上面的所有組合物都可用于介導LeIF4A核酸分子進入組織細胞。用于吸收的病毒、物理和化學方法的程序為本領域所熟知。
如上文所述，本發(fā)明提供了應用本文中的多肽或相關核酸組分增強或引發(fā)免疫應答的方法。本發(fā)明中已發(fā)現(xiàn)LbeIF4A包含刺激來自利什曼原蟲感染個體的PBMC增殖的抗原決定簇。LbeIF4A也刺激來自感染個體的PBMC產(chǎn)生單一的Th1細胞因子應答。Th1應答的特點是產(chǎn)生細胞因子白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)或干擾素-γ(IFN-γ)，以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。IL-12為一異源雙體分子，包括p40和p35兩個亞單位，此兩個亞單位共表達才能產(chǎn)生具生物活性的IL-12p70。p40亞單位僅在IL-12產(chǎn)生細胞中產(chǎn)生，由細菌和寄生蟲刺激于體外或體內(nèi)誘導，p35亞單位則可持續(xù)表達于各種細胞。因此，產(chǎn)生IL-12的細胞中無生物學活性的游離p40鏈大量過剩(10到100倍)。IL-12的產(chǎn)生所帶來的刺激作用非常重要，因為IL-12能夠影響T細胞產(chǎn)生Th1應答(產(chǎn)生IFN-γ和IL-2)。因此蛋白刺激產(chǎn)生IL-12的能力是其一個重要的佐劑性質(zhì)。
LbeIF4A在來自利仁曼原蟲感染病人的PBMC中也可刺激產(chǎn)生編碼IFN-γ、IL-2、白介素-12p40亞單位和TNF-α的mRNA。在刺激過的PBMC中檢測不到IL-4或IL-10(代表著Th2應答)mRNA。實際上，LbeIF4A一般下調(diào)一些利什曼病患者的新鮮PBMC中IL-10mRNA的表達以及LPS誘導的病人和正常PBMC中IL-10的產(chǎn)生。LbeIF4A的這些性質(zhì)暗示其可以用于在利什曼病患者中產(chǎn)生保護性或治療性免疫應答。
另外，在來自未感染對照個體的PBMC以及培養(yǎng)的人巨細胞病毒、骨髓白血病細胞系THP-1和小鼠中，LbeIF4A刺激產(chǎn)生IL-12和IL-2。LbeIF4A還協(xié)同IFN-α刺激THP-1細胞分泌IL-12，并且抗-IL-12抗體的存在會抑制其對病人PBMC產(chǎn)生IFN-γ的引導作用。LbeIF4A刺激產(chǎn)生IL-12和IL-2的能力表明它可以用來引發(fā)一免疫應答，并且本文所述多肽可廣泛用于提高一非特異性的免疫應答。
因此，本發(fā)明包括在病人或細胞培養(yǎng)中增強或引發(fā)一細胞免疫應答(如抗原特異性細胞裂解性T細胞的產(chǎn)生)的方法。本發(fā)明同時包括應用上面所述LbeIF4A或LmeIF4A多肽增強或引發(fā)針對某一抗原的體液免疫應答(如抗原應答性抗體的產(chǎn)生)的方法。本文所用“病人”一詞指的是任何溫血動物，優(yōu)選為人。病人可患有一種疾病，如利什曼病(或其他感染性疾病)或癌癥，如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、結腸癌或其他癌癥，也可為正常(即無可檢測到的疾病和感染)?！凹毎囵B(yǎng)”指的是對PBMC的任何制備物或分離的組分細胞(包括但并不限于巨噬細胞、單核細胞、B細胞和樹突細胞)。這些細胞可用本領域普通技術人員所熟悉的各種技術(如Ficoll-hypaque密度離心)加以分離。細胞可以(但非必須)從患有利什曼病或其他疾病的病人中分離，并在處理后可重新移入病人體內(nèi)。
在這些方法中，LeIF4A多肽(或核酸組分)同抗原一道給予病人或細胞培養(yǎng)物，以使其發(fā)揮增強或引發(fā)針對抗原的免疫應答的免疫調(diào)節(jié)劑的作用。LeIF4A多肽可以同抗原以同一制劑的形式(如疫苗)給藥，也可單獨給藥。在一種實施方案中，抗原和LeIF4A多肽在同一時間給予病人的同一部位。在這種方法中，如LeIF4A多肽可以作為佐劑用于外源物質(zhì)疫苗制劑。另外一種實施方案中，抗原和LeIF4A多肽給予病人的不同部位，如LeIF4A多肽可在一條手臂上給藥(如注射)，而抗原于另一條手臂給藥。這種給藥可以但不必須在同一時間進行。另外，LeIF4A多肽可在抗原之前或之后給藥。例如，LeIF4A多肽可在抗原給藥之前24小時給藥。后面給出了給藥的適用劑量和方法。
對于接受了LeIF4A多肽的病人，其產(chǎn)生的免疫應答隨著自身條件的不同而有所不同。對于利什曼病患者來說，其產(chǎn)生的免疫應答包括優(yōu)勢的Th1免疫應答(包括對產(chǎn)生IL-12的刺激作用)以及對IL-10表達的下調(diào)作用。對未感染個體來說，免疫應答可為IL-12的產(chǎn)生、IL-2的產(chǎn)生、對γT細胞的刺激作用、干擾素的產(chǎn)生、抗原應答性CTL的產(chǎn)生、抗原特異性抗體的產(chǎn)生，或其任何組合。以上免疫應答的任意一種都可增強病人針對同LeIF4A多肽一起給藥的抗原的免疫應答。另外，對于經(jīng)診斷患有癌癥(如黑色素瘤，乳腺癌，前列腺癌，淋巴瘤，結腸癌或其他癌癥)的病人來說，免疫應答包括優(yōu)勢的CTL反應。對于腫瘤的治療來說，免疫應答應減小腫瘤的體積。
用于上述方法中的LeIF4A多肽(或核酸組分)優(yōu)選配制成藥物組合物或疫苗。藥物組合物通常含有結合有生理學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的一種或多種LeIF4A多肽。這種載體的用量和濃度對受者沒有毒性。疫苗包括一種或多種LeIF4A多肽以及一種或多種另外適于該適應癥的抗原。LeIF4A蛋白與可溶性細胞因子受體、細胞因子和化療試劑的聯(lián)合應用也在本發(fā)明的考慮之內(nèi)。
多肽的劑量以及給藥途徑和頻率隨個體的不同而不同，并與其他感染的現(xiàn)行免疫和治療所用條件平行。一般來說，藥物組合物和疫苗可通過注射(例如肌肉注射，靜脈注射，或皮下注射)，鼻腔途徑(如吸入)或口服來給藥。給藥的劑量和頻率當然取決于待治療臨床表現(xiàn)的性質(zhì)和嚴重性、目的反應、病人的身體條件及其他因素。典型的是2-6周內(nèi)給藥1-4個劑量。優(yōu)選給予2個劑量，第一次給藥后2-4周進行第2次給藥。適當?shù)腖beIF4A多肽劑量應該是刺激病人體內(nèi)IL-12的產(chǎn)生，使從病人分離的PBMC的上清中IL-12的濃度在10ng/ml到10μg/ml之間。通常，可用本領域普通技術人員所知的適當檢測方法包括本文所述方法來對IL-12定量。典型的劑量為每公斤宿主約1pg到100mg LbeIF4A多肽。典型為10pg到約1mg，優(yōu)選為約100pg到約1μg。適當?shù)慕o藥體積隨動物的大小而變，但對于10-60公斤的動物，典型范圍是從約0.01mL到約5mL。用于具體適應癥的特定適當劑量易于決定。
或者，細胞(優(yōu)選外周血單核細胞)從病人中分離，體外用一種LeIF4A多肽和抗原(包括腫瘤抗原)刺激。抗原特異性免疫應答如CTL應答產(chǎn)生后，可擴增細胞并回輸給病人。
盡管為本領域技術人員所知道的適當?shù)妮d體可用于本發(fā)明的藥物組合物，載體的類型則取決于給藥方式以及是否需要持續(xù)釋放。對于象皮下注射這樣的非腸道給藥方式來說，載體優(yōu)選包括水、鹽水、酒精、脂肪、蠟或緩沖液。對于口服給藥方式來說，上面的所有載體或固體載體如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖以及碳酸鎂均可使用?？缮锝到獾奈⑶蝮w(如多聚乳糖半乳糖苷)也可用作本發(fā)明藥物組合物的載體。例如適用的微球體公開在美國專利No.4,897,268和5,075,109和美國專利申請No.08/116,484和08/116,802(列入本文作為參考)中。多肽或多肽/抗原復合物可以包埋于微球體內(nèi)或附于微球體表面。從這個意義上，優(yōu)選的微球體應大于約25微米。
藥物組合物和疫苗也可包含稀釋劑(如緩沖液)、抗氧化劑(如抗壞血酸)、低分子量多肽(約小于10殘基)、蛋白，氨基酸、糖類(包括葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、螯合劑(如EDTA)、谷胱甘肽和其他的穩(wěn)定劑和賦形劑。例如，中性緩沖液平衡的鹽水或者與非特異的血清蛋白混合的鹽水是適當?shù)南♂寗?。?yōu)選用適當?shù)馁x形劑溶液(如蔗糖)作為稀釋劑將產(chǎn)品配制成凍干品。
除LbeIF4A外，另外一些不同的試劑可任選用于本發(fā)明的疫苗或藥物組合物，以進一步非特異地增強免疫應答。這些試劑通常包括旨在保護抗原免受迅速降解的物質(zhì)(如氫氧化鋁或礦物油)和免疫應答的非特異刺激物(如脂A，Bortadella pertussis或結核分枝桿菌)。這類試劑可通過商業(yè)途徑得到，如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLoboratories，Detroit，MI)以及Merck佐劑65(Merck andCompany，Inc.，Rahway，NJ)。
現(xiàn)提供下列實施例用于說明目的，而無任何限制意義。本領域技術人員會發(fā)現(xiàn)對實施例中所包含的本發(fā)明可以進行變動，特別是在本文列出的各種參考文獻的教導下。
實施例1LbeIF4A編碼DNA的制備此實施例舉例說明了編碼L.braziliensis核糖體抗原LbeIF4A的DNA序列的分子克隆。
在噬菌體λZAPII(Stratagene，La Jolla，CA)中用來自L.braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)的切割DNA構建一基因組表達文庫。來自患有粘膜利什曼病的L.braziliensis感染個體的大腸桿菌預吸附血清用于表達文庫的篩選。純化帶有免疫活性重組抗原的噬菌斑，按照制造商的方法切割噬菌粒pBSK(-)。用核酸內(nèi)切酶III處理嵌套缺失，所得到的重疊缺失可用于單鏈模板的制備和測序。用制造商(Stratagene，La Jolla，CA)推薦方法感染VCSM13輔助噬菌體后分離單鏈模板，采用雙脫氧末端終止法或Tap染料終止系統(tǒng)(使用應用生物學系統(tǒng)自動測序儀Model 373A)進行測序。
免疫活性重組抗原然后用在病人T細胞檢測中分析其對增殖性免疫應答(如后面實施例5所述)和主要Th1細胞因子的刺激能力(如后面實施例7所述)。
通過比較重組克隆預測的氨基酸序列和其他蛋白序列，重組在上面的檢測中被鑒定出來的克隆被鑒定為真核啟動因子4A(eIF4A)的L.braziliensis同源類似物。分離的克隆(pLeF.1)缺少全長蛋白序列的前48個氨基酸殘基(144核苷酸)。然后pLeF.1的插入片段用于分離全長基因組序列。
SEQ ID NO1為全長LbeIF4A多肽的完整核苷酸序列。開放讀碼框架(115到1323位核苷酸)編碼-預計分子量為45.3kD的403個氨基酸的蛋白。序列比較表明預測的LbeIF4A蛋白序列同來自煙草(TeIF4)、小鼠(MeIF4)和酵母(YeIF4)的同源蛋白有廣泛的序列同源性，其中前20-30位氨基酸變異最大。LbeIF4A、TeIF4、MeIF4和YeIF4的長度(403，413，407，395個氨基酸)、分子量(45.3，46.8，46.4，44.7kD)和等電點(5.9，5.4，5.5，4.9)都分別類似。LbeIF4A同TeIF4，MeIF4和YeIF4的總體同源性分別為75.5％(57％相同，18.5％為保守性替代)、68.6％(50％相同，18.6％為保守性替代)和67.2％(47.6％相同，19.6％為保守性替代)。
實施例2LbeIF4A基因的定性此實施例舉例說明了利什曼原蟲中LbeIF4A DNA的Southernblot分析。所用的L.braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)、L.guyanensis(MHOM/BR/75/M4147)、L.amazonensis(IFLA/BR/67/PH8)、L.chagasi(MHOM/BR/82/BA-2，Cl和MHOM/BR/84/Jonas)、L.donovani(MHOM/Et/67/HU3)、L.infantum(IPT-1)，L.major(LTM p-2)、L.tropica(1063C)、Trypanosoma cruzi(MHOM/CH/00/Tulahuen C2)和T.brucei(TREU 667)以前曾有描述(參閱Burns等，美國國家科學院研究進展90775-779，1993)。在無菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)原鞭毛蟲和短膜型鞭毛蟲。L.chagasi和L.amazonensis無鞭毛體分別從Syrian倉鼠腎和BALB/c ByJ鼠足墊中得到，純化方法如Burns等，免疫學期刊(J.Immunol.)146742-748，1991中所述。
基因組DNA的制備、酶切(酶切位點包括LbeIF4A內(nèi)的PstI和NotI及LbeIF4A外的BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII，PvuII和SstI)、分離(0.7％的瓊脂糖凝膠)和印跡(Nytran(尼龍)膜)如Sambrook等，分子克隆實驗室操作手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989中所述。用隨機引物法放射性標記LbeIF4A編碼區(qū)中一個長約0.94kb的酶切片段(143-1083位核苷酸)(見Feinberg和Vogelstein，生化年鑒，137266-268，1984)，與印跡膜65℃雜交過夜。分別用2×，0.5×和0.2×含0.1％SDS的SSC 65℃洗膜兩次，每次20分鐘。L.brazliensis基因組DNA中至少含有兩個拷貝的LbeIF4A，BamHI和PvuII條帶中兩條雜交帶的存在即是例證(圖.1)圖1還表明L.braziliensis和利什曼原蟲其他種中的eIF4A同源類似物具有種間保守性。在所有其他利什曼原蟲種中都檢測到了兩個主要Ps+I雜交片段，測定了L.donovani群的成員(L.chagasi，L.donovani和L.infantum)，顯示相同的雜交帶型。在嚴緊雜交條件下，LbeIF4A可以同關系相隔較遠的寄生蟲T.cruzi雜交，但同T.brucei不雜交。這些數(shù)據(jù)表明利什曼原蟲eIF4A同源類似物具有廣泛的種間保守性。
實施例3LbeIF4A的制備此實施例舉例說明了長約45kD的LbeIF4A抗原基因產(chǎn)物的表達和純化。從500毫升IPTG誘導的培養(yǎng)物中純化來自基因組克隆pLeIF.1的45kDa重組抗原(即缺少氨基端48個殘基的抗原)。分離內(nèi)含體，然后用含2、4和8M尿素的10ml TNE(50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl和10mM EDTA)依次洗滌。含有溶解的重組抗原的部分(通常為4和8M尿素上清)經(jīng)收集后，用Tris緩沖的鹽溶液(TBS)透析，然后用硫酸銨沉淀濃縮。經(jīng)制備型的SDS-PAGE膠電泳，切割和電洗脫將重組抗原純化至均一。在Limulus阿米巴樣細胞檢測(方法由Immunex Corp.，Seattle，WA提供)中，本研究所用的所有抗原均含有少于10pg/ml或1ng/ml的內(nèi)毒素蛋白。此劑量的內(nèi)毒素對細胞因子誘導和/或佐劑活性都不重要。
重組抗原用于免疫小鼠以產(chǎn)生多克隆抗體。用包含100μg純化LbeIF4A的不完全弗氏佐劑(IFA，GIBCO，Grand Island，NY)連同100μg胞壁酰二肽(佐劑肽，Calbiochem-Novabiochem Corp.，La Jolla，CA)靜脈免疫一成年兔(New Zealand White；R&R Rabbitry，Stanwood，WA)。四周后用含100μg重組抗原的IFA增強免疫。三周后，用含25μg LbeIF4A的生理鹽水增強免疫，一周后收集血清。
隨后，用多克隆兔抗血清作探針，對來自原鞭毛蟲的L.braziliensis裂解物進行免疫印跡分析(圖2)，其中的原鞭毛蟲收集于對數(shù)期的早、中、晚期或是在培養(yǎng)溫度由22℃變?yōu)?5℃之后。圖2的A組展示了分子量標記(帶M)、未誘導(帶1)及誘導培養(yǎng)的(帶2)的大腸桿菌裂解物和純化的重組抗原(帶3)的免疫印跡分析結果。圖2的B組展示了L.braziliensis原鞭毛蟲裂解物(帶1)、L.chagasi原鞭毛蟲裂解物(帶2)和L.amazonensis原鞭毛蟲裂解物(帶3)或無鞭毛體裂解物(帶4)的免疫印跡分析結果。
通過對細胞沉淀的在不含甘油和β-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液中凍融裂解制備寄生蟲和哺乳動物細胞裂解物。在一微顯離心機中10Krpm離心除去上清中的不溶物質(zhì)。用Pierce BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。5到10μg的寄生蟲或細胞提取物或0.5到1.0μg的重組抗原用12.5％的SDS-PAGE分離，電泳轉移至硝基纖維素膜上。如前人(Skeiky等，實驗醫(yī)學期刊(J.Exp.Med.)176201-211，1992)所述，應用I125標記的蛋白A放射自顯影測定抗血清活性，兔抗血清檢測到一個大小約為45kD的優(yōu)勢蛋白。對所有分析的裂解物來說其45kD eIF4A同源類似物具有相似的相對強度，這表明在寄生蟲生長對數(shù)期的早、中和晚期或是在培養(yǎng)溫度由22℃變?yōu)?5℃之后(模仿細胞內(nèi)無鞭毛體階段)此抗原仍持續(xù)表達。這一點與利什曼原蟲熱休克蛋白家族的成員不同，后者在培養(yǎng)溫度由22℃變?yōu)?5℃之后可提高表達。免疫前兔血清不與寄生蟲裂解物反應。
實施例4制備與LbeIF4A結合的單克隆抗體此實施例舉例說明了抗LbeIF4A的單克隆抗體的制備。純化的LbeIF4A制備物或高水平表達LbeIF4A的轉染細胞可依常規(guī)方法(如美國專利No.4,411,993所述)用于產(chǎn)生LbeIF4A單克隆抗體。此抗體可用來干擾LbeIF4A對PBMC的活化，也可用于LbeIF4A的診斷或研究檢測，或是用于LbeIF4A的親和純化。
為免疫嚙齒類動物，LbeIF4A免疫原乳化至一佐劑(如完全或不完全弗氏佐劑，明礬，或另一個佐劑如Ribi佐劑R700(Ribi，Hamilton，MT))中，用10到100μg的量靜脈注射給選擇的嚙齒類動物，如BALB/c小鼠或Lewis大鼠。十天到三個星期之后，注射免疫原增強免疫，之后每一周、兩周或三周階段性增強免疫。采用后眼球取血或尾端切斷的方法階段性取血，用于點雜交檢測(抗體夾心法)或ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)。其他方法也可使用，如Th1應答引發(fā)的抑制。
測定適當?shù)目贵w濃度后，將鹽水中的抗體靜脈注射給陽性動物。三到四天后，殺死動物，收獲脾細胞，融合于骨髓瘤細胞系(如NS1或優(yōu)選的Ag8.653[ATCC CRL 1580])。將此步產(chǎn)生的雜交瘤細胞系鋪于含選擇性培養(yǎng)基(如，一包括次黃嘌呤核苷酸，氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷，或HAT的培養(yǎng)基)的多孔微滴定板上，以抑制非融合細胞、骨髓瘤-骨髓瘤雜交細胞和脾細胞-脾細胞雜交細胞的增殖。
如此得到的雜交瘤細胞系可用于ELISA篩選以確定與LbeIF4A的反應活性，例如，可采用Engvall等(免疫化學[Immunochem.]8871，1971)和美國專利No4,703,004中所述技術。優(yōu)選的篩選技術為抗體捕捉技術(如Berkman等，免疫學期刊1444212，1990所述)。例如，雜交瘤細胞系可通過有限稀釋或于軟瓊脂中克隆來克隆以產(chǎn)生單克隆細胞系。陽性克隆然后注射到同系嚙齒類動物的腹腔中以產(chǎn)生帶有高濃度(＞1mg/ml)的抗LbeIF4A單克隆抗體的腹水。產(chǎn)生的單克隆抗體可用硫酸銨沉淀然后用凝膠排阻層析的方法加以純化。或者使用基于抗體同蛋白G或蛋白A結合的親和層析，如同基于與LbeIF4A結合的親和層析。
實施例5LbeIF4A對PBMCs增殖的刺激作用此實施例舉例說明了純化LbeIF4A對來自L.braziliensis感染個體的PBMC增殖的刺激能力。外周血來自生活于一有地方性L.braziliensis傳播地區(qū)中的個體，其中本地區(qū)的流行病學、臨床及免疫學調(diào)查已做了十多年。對病人的診斷用下面三項中至少一項臨床調(diào)查結果進行從損傷處分離寄生蟲、應用利什曼原蟲裂解物的陽性皮膚試驗，或陽性血清試驗。
收集外周血，用FicollTM(Winthrop實驗室，紐約)密度離心分離PBMC。對于體外增殖檢測，以2-4×105個細胞/孔于96孔板培養(yǎng)5天，采用帶有或不帶有10μg/ml指定抗原或5μg/ml PHA(SigmaImmunochemicals，St.Louis，MO)的完全培養(yǎng)基(RPMI1640，補加有慶大霉素、2-ME、L-谷氨酰胺和10％過篩收集的A+人血清；Trimar，Hdlywood，CA)。培養(yǎng)到最后18小時時，用1μCi的[3H]胸腺嘧啶輻射細胞。
數(shù)據(jù)以三份培養(yǎng)液的平均cpm的形式給出，刺激指數(shù)(SI)定義為帶抗原培養(yǎng)液與不帶抗原培養(yǎng)液平均cpm之比。如表I和圖3所示，來自大多數(shù)(＞70％)的粘膜和活動的或痊愈的皮膚型病人的PBMC對LbeIF4A的應答表現(xiàn)出不同的增殖方式，其刺激指數(shù)的變化范圍分別為12到233和2到64。
表I對寄生蟲裂解物和LbeIF4A抗原應答，來自L.braziliensis感染個體的PBMC的體外增殖[3H]Tdr摻入(平均cpm(SD)×10-3)患者介質(zhì) 裂解物 LbeIF4ASISI黏膜組JV 0.15(0.0)41.30(1.3)29411.90(4.8) 81SZ 0.45(0.1)140.60(7.6) 308105.90(5.6)233AB 0.42(0.3)44.20(0.5)1045.00(1.3) 12NO 0.38(0.1)52.70(3.3)13812.80(1.6) 33TE 0.18(0.0)27.40(1.5)1508.80(0.3) 48MB 0.18(0.0)300.10(9.4) 1634 41.50(4.5) 226OM 0.28(0.0)35.40(3.2)1246.90(2.5) 24皮膚組AS 0.22(0.0)19.14(1.3)87 14.30(2.3) 64JP 0.25(0.0)55.63(8.6)2184.40(0.3) 17VS 0.17(0.0)0.26(0.0) 1.50.3(0.0) 2RJ 0.10(0.0)0.32(0.2) 3.01.5(0.6) 15JA 0.16(0.0)0.77(0.1) 4.72.5(0.2) 16AD 4.20(1.0)4.01(1.0) 0.014.1(2.2) 3.5HN 0.36(0.0)4.73(1.7) 13 4.69(1.7) 13彌散皮膚組VAL 0.22(0.0)0.51(0.3) 2.02.12(0.2) 9.0自愈皮膚組GS 0.21(0.0)19.70(4.4)94 41.50(2.8) 198MS 0.09(0.0)0.60(0.1) 6.55.10(2.1) 57AH 0.11(0.0)59.60(7.1)5199.60(4.7) 83DJ 0.12(0.0)0.20(0.1) 1.619.00(6.7) 151HS 0.12(0.0)27.10(2.0)22512.40(2.7) 103MCT 0.38(0.0)130.30(14)3406.20(1.5) 16正常組LV 0.14(0.0)0.19(0.0) 1.40.71(0.1) 4.0VV 0.18(0.0)0.31(0.1) 1.70.28(0.1) 1.5N3 0.14(0.0)0.36(0.1) 2.60.27(0.1) 1.9N4 0.59(0.1)2.00(0.3) 3.80.56(0.0) 1.0
一般說來，粘膜型個體的PBMC的刺激指數(shù)要高一些。一些粘膜型個體的PBMC對LbeIF4A應答的刺激指數(shù)可同對寄生蟲裂解物應答的刺激指數(shù)相比。有趣的是，在一些皮膚型利什曼病患者中，對LbeIF4A的增殖應答要高于對寄生蟲裂解物的應答。同粘膜型和皮膚型病人相比，6個自愈皮膚型個體的PBMC對LbeIF4A應答的增殖刺激指數(shù)(16-198)可同粘膜型個體相比。兩個自愈皮膚型個體(MS和DJ)的PBMC的應答要明顯高于從寄生蟲裂解物獲得的應答。LbeIF4A對來自未感染個體的細胞只有輕微的刺激作用。
實施例6LbeIF4A對PBMCs中細胞因子mRNA表達的刺激作用此實施例給出的是PBMC中細胞因子mRNA表達模式的分析，其中PBMC來自確定有L.braziliensis感染的病人。為分析細胞因子mRNA，0.5到1ml的PBMC(1-2×106細胞/毫升)在含有或不含有10μg/ml的缺少SEQ ID NO2氨基末端48個殘基的LbeIF4A抗原(如實施例3中所述)的條件下培養(yǎng)48到72個小時。收獲上清和細胞，用聚合酶鏈反應(PCR)分析細胞因子mRNA。為PCR分析細胞因子mRNA，用酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法(如Chomczynski和Sacchi，分析生化(Anal.Biochem.)162156-159，1987所述)分離PBNC中總RNA。用poly(dT)(Pharmacia)和AMV逆轉錄酶(Bethesda研究實驗室，Gaithersburg，MD)合成cDNA，cDNA的終體積為20μl。cDNA樣品用水稀釋到200μl。
β-肌動蛋白標準化后，用Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)PCR擴增12到20μl稀釋的cDNA，50ml反應體系中還包括0.2μM相應的5’和3’引物。反應條件為94℃變性(β-肌動蛋白、IL-2和IL-41分鐘；IFN-γ45秒；IL-10 30秒)，55℃退火(β-肌動蛋白、IL-2和IL-41分鐘；IL-10 30秒)或60℃45秒(IFN-γ)，72℃延伸。通過一開始將cDNA梯度稀釋并變化PCR循環(huán)次數(shù)證實我們的PCR條件在半定量范圍內(nèi)。在下面所有實驗中，β-肌動蛋白、IL-2、IL-4和IFN-γ擴增反應用30個循環(huán)；IL-10 PCR為25個循環(huán)。
所用引物對和PCR條件來自發(fā)表的文獻β-肌動蛋白、IL-2、IL-4和IFN-γ(Ehlers等，實驗醫(yī)學期刊17323-36，1991)和IL-10(Viera等，美國國家科學院研究進展881172-1176，1991)。5’和3’寡聚核苷酸引物的核苷酸序列分別列于下面(1)β-肌動蛋白，TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA 和CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG；(2)IL-2，ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT和GTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC；(3)IL-4，ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT 和CGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCAT； (4)IFN-γ，ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT和GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT； (5)IL-10，TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA 和ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA。
探針來自含有人IL-2、IFN-γ、IL-4序列(Lewis等，美國國家科學院研究進展859743-9747，1988)和β-肌動蛋白序列的質(zhì)粒(no.65128；美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)，分別用HindIII/EcoRI，EcoRI，SacI/HindIII和EcoRI酶切。從來自正常供體的經(jīng)有絲分裂原刺激的PBMC中進行PCR克隆出人IL-10 cDNA，其中應用設計的引物擴增出一包括人IL-10全部編碼區(qū)的535堿基對片段(Lewis等，美國國家科學院研究進展859743-9747，1988)。cDNA亞克隆于pBluescript，然后用BamHI/EcoRI切割。1％瓊脂糖凝膠分離后，切下插入的DNA片段，電洗脫，并純化。隨機引物法制備放射性標記的32P-探針。
PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，轉到尼龍膜上，用帶放射性標記的32P-DNA插入段探測。55℃雜交過夜，然后55℃分別用包含0.2％SDS的2×和1×SSC洗兩次，每次20分鐘。
圖4A和4B給出了分析結果。細胞因子PCR分析所用細胞包括培養(yǎng)前的細胞(帶0)，不帶抗原條件下培養(yǎng)的細胞(帶-)，帶有10μg/ml利什曼原蟲裂解物培養(yǎng)的細胞(帶Lb)，帶有10μg/ml LbeIF4A培養(yǎng)的細胞(帶IF)。圖4A顯示的是PBMCs分析中六個粘膜型病人中的三個(JV，SZ，TE)和一個患有L.amazonesis感染病人(VA)(表現(xiàn)為彌散皮型利什曼病(DCL))的細胞因子mRNA的PCR結果。對于六個粘膜型病人的三個(圖4A中的TE；未顯示的NO和EO)，其中未在體外培養(yǎng)的PBMC中可檢測到IFN-γ、IL-2和IL-4(病人TE和EO)。在所有的粘膜型病人的“待測”PBMC中未能檢測到IL-10mRNA。但是，經(jīng)過在缺少抗原刺激的條件下的體外培養(yǎng)，大多數(shù)分析的粘膜型PBMC中IL-10mRNA的合成有所增加，另外，在病人TE，NO和EO的“待測”PBMC中所檢測到的細胞因子mRNA的水平則降低到背景水平。
寄生蟲裂解物刺激Th1細胞因子IFN-γ和IL-2以及Th2細胞因子IL-4(六個病人中的三個)的mRNA的表達。一個病人的PBMC(SZ)與寄生蟲裂解物共培養(yǎng)后可檢測到IL-10mRNA增加。LbeIF4A抗原和寄生蟲裂解物在所有粘膜型病人的PBMCs中均引發(fā)產(chǎn)生IFN-γ，和IL-2mRNA，其中LbeIF4A只引發(fā)Th1細胞因子。實際上，LbeIF4A在大多數(shù)未經(jīng)抗原刺激的粘膜型病人的培養(yǎng)PBMC中調(diào)節(jié)減少IL-10mRNA的合成。有趣的是，同粘膜型病人PBMC類似，DCL病人VA中的IL-10mRNA的合成也受LbeIF4A下調(diào)節(jié)。
一般來說，抗原刺激前IFN-γ和IL-2mRNA在溴化乙錠染色的膠中目測不到，經(jīng)抗原刺激后，可提高到易于檢測的水平。但是，細胞因子IL-4和IL-10mRNA只有在分辨的PCR產(chǎn)物放射探測后才能檢測到，表明這些細胞因子mRNA為低豐度的mRNA。
皮膚型病人的PBMC用于類似的PCR分析(圖4B)。來自被分析的四個病人的三個(VS，JP和CA(未顯示))中的新制備的PBMC表明被檢測的Th1細胞因子(IFN-γ和IL-2)和Th2細胞因子(IL-4和IL-10)的mRNA的水平都很高。在從第四個皮膚型病人(AS)中新制備的PBMC中可檢測到IFN-γ和IL-2mRNA，但檢測不到IL-4和IL-10mRNA。因此，與粘膜型病人相比，在新制備的皮膚型利什曼氏病患者PBMC中，除IL-4、IL-2和IFN-γ外也可檢測到IL-10mRNA。有趣的是，在無抗原存在的情況下體外培養(yǎng)PBMC后，IL-2和IFN-γmRNA的水平降低到幾乎檢測不出來，而IL-10則沒有受影響或升高。因此，在皮膚型病人中，IL-10mRNA的自發(fā)水平或是穩(wěn)定的或是其中PBMC在無抗原刺激的情況下持續(xù)合成IL-10mRNA。對皮膚型利什曼病人來說，觀察這樣的應答可用來區(qū)分預計發(fā)展為慢性皮膚型利什曼病的個體和能夠自愈的個體。
所有檢查的皮膚型病人對LbeIF4A抗原和寄生蟲裂解物的應答可以增加IFN-γ和IL-2mRNA的合成，對四個病人中兩人(VS和AS)來說，用寄生蟲裂解物刺激后，IL-4的水平也有提高。在可檢測到IL-10自發(fā)水平的三個病人中，LbeIF4A和寄生蟲裂解物可調(diào)節(jié)降低IL-10mRNA的表達。
能自愈的CL病人的PBMC中的細胞因子特征同ML病人的相似之處在于(a)除一個病人IL-10mRNA可檢測到之外，從四個病人中其他三個新制備的PBMC可檢測到IL-4、IL-2和IFN-γ，但是IL-10mRNA的水平很低或沒有；(b)在無抗原存在的情況下培養(yǎng)PBMC后，IL-10mRNA受調(diào)節(jié)提高表達，而IL-2、IFN-γ和IL-4mRNA的水平降低到背景水平；(c)利什曼原蟲裂解物刺激混合的Th1/Th2細胞因子表達，而LbeIF4A只引發(fā)提高Th1-型細胞因子mRNA的表達，并下調(diào)大多數(shù)自愈個體(未顯示)的培養(yǎng)PBMC中IL-10mRNA的表達。
實施例7LbeIF4A對PBMC中細胞因子分泌的刺激作用此實施例給出的是，用缺少SEQ ID NO2氨基端48個殘基(如實施例3中所述)的LbeIF4A抗原或寄生蟲裂解物刺激后，L.braziliensis感染個體的PBMC培養(yǎng)上清中分泌細胞因子的水平。等分的PBMC上清用于檢測IL-4、IL-2、IFN-γ和IL-10。IFN-γ的定量采用雙夾心ELISA法，其中用鼠抗-人IFN-γ單抗(Chemicon，Temucula，CA)和多克隆兔抗-人IFN-γ血清(Genentech Inc.，San Francisco，CA)。人重組IFN-γ(rIFN-γ)(Genentech Inc.，San Francisco，CA)用于產(chǎn)生標準曲線。上清中IL-4的定量采用雙夾心ELISA法，其中用鼠抗-人IL-4單抗(M1)和多克隆兔抗-人IL-4血清(P3)。人IL-4(Immunex Corp.，Seattle，WA)用于產(chǎn)生標準曲線，范圍在50pg/ml到1ng/ml。IL-10定量采用鼠抗-人IL-10單抗(PharMingen，San Diego，CA，Cat.#18551D)以“捕捉”分泌的IL-10，和生物素化的鼠抗-人IL-10單抗(PharMingen，San Diego，CA，Cat.#18562D)，用結合有親和素的辣根過氧化物酶和ABTS作為底物來檢測結合的IL-10。標準曲線用重組人IL-10(rIL-10)(由DNAX Reseach研究所惠贈，Palo Alto，CA)來得到，范圍從30pg到2ng/ml。
來自三組病人(即，粘膜型、皮膚型和自愈皮膚型)的細胞經(jīng)10μg/ml LbeIF4A或10μg/ml寄生蟲裂解物刺激分泌IFN-γ和TNF-α(圖5和6)。同其類似，LbeIF4A刺激感染L.tropica的病人(DesertStorm病人)的PBMC增殖并分泌IFN-γ(未顯示)。在病人PBMC上清中檢測到的IFN-γ和TNF-α的水平明顯高于未感染對照。在缺少抗原刺激的情況下，只有粘膜型病人(六人中的五位)的PBMC上清中產(chǎn)生可檢測到的TNF-α(60-190pg/ml)。所有被分析的上清中檢測不到或只有微量的TNF-α(未顯示)，這表明其表達水平低于所用ELISA的檢測限。通過比較，利什曼原蟲裂解物同樣刺激PBMC分泌IFN-γ和TNF-α，并且在一些病人中，IL-10也能被檢測到(未顯示)?？傊Y果表明，LbeIF4A在L.braziliensis感染者PBMC中刺激優(yōu)勢Th1細胞因子，而寄生蟲裂解物則刺激混合的Th1/Th2細胞因子。
經(jīng)抗原刺激的粘膜型和自愈型個體的病人PBMC培養(yǎng)上清中TNF-α的檢測水平要高于皮膚型病人(圖6)。五位粘膜型病人中四位(JV，SZ，AB和MB)的PBMC培養(yǎng)上清中的TNF-α水平(0.8到2.20ng/ml)高于經(jīng)寄生蟲裂解物刺激的未感染對照。與其類似，同樣的PBMC經(jīng)LbeIF4A刺激后上清中TNF-α的濃度在0.66到3.14ng/ml之間。同未感染對照相比，被分析的六個自愈型病人中的三個(GS，HS和MCT)PBMC對寄生蟲裂解物的免疫應答產(chǎn)生較高水平的TNF-α，被分析的六個自愈型病人(GS，MS，AH，DJ，HS和MCT)全部對LbeIF4A的免疫應答產(chǎn)生較高水平的TNF-α。對寄生蟲裂解物免疫應答的皮膚型利什曼病患者PBMC所產(chǎn)生的TNF-α與未感染對照接近。但是，LbeIF4A刺激的三個病人(RJ，AD和JS)的PBMC產(chǎn)生TNF-α。這些病人可能處在急性皮膚型利什曼病的發(fā)展過程中。
實施例8LbeIF4A對產(chǎn)生IL-12的刺激作用此實施例表明了LbeIF4A刺激L.braziliensis感染個體的PBMC，以及來自正常供體血液的PBMC或培養(yǎng)的人巨噬細胞或粘附性PBMC和人骨髓瘤細胞系THP-1分泌IL-12。已表明IL-12在細胞介導的免疫的發(fā)展過程中以及對在細胞內(nèi)細菌性或寄生蟲感染中Th1應答的產(chǎn)生和IFN-γ的產(chǎn)生起著重要的調(diào)節(jié)作用。用作LbeIF4A抗原的LbeIF4A多肽缺少SEQ ID NO2的氨基端48個殘基(如實施例3中所述)。
用RIA(檢測限為10pg/ml)對細胞上清中IL-12p40定量，所用mAb對為C11.79/C8.6(如D’Andrea等，實驗醫(yī)學期刊1791387-1398，1992所述)。具生物活性的IL-12 70異源二聚體的定量(檢測限為1pg/ml)如Kubin等所述(血液(Blood)831874-1855，1994)。
圖7A表明，10μg LbeIF4A(LeIF)刺激粘膜型病人PBMC所分泌的IL-12p40要比10μg寄生蟲裂解物作為抗原(Lb)時的量明顯高。無裂解物或抗原存在時，IL-12p40的分泌量也已給出(Med)。此圖還表明，用LbeIF4A(LeIF+IL-10)或裂解物(Lb+IL-10)刺激病人的PBMC后，10μg IL-10可調(diào)節(jié)降低IL-12p40的產(chǎn)生。
未感染個體的PBMC同LbeIF4A一起培養(yǎng)后也可產(chǎn)生IL-12p40(LeIF，圖7B)，而對寄生蟲裂解物(Lb)的免疫應答則檢測不到IL-12p40。這說明IFN-γ對于在病人PBMC中觀察到的裂解物誘導產(chǎn)生的p40有一定的作用，抗原刺激后病人PBMC中產(chǎn)生的IFN-γ要比正常PBMC的高出5到100倍(見圖5)。
為判定在抗原刺激的PBMC培養(yǎng)中觀察到的IL-12p40是否反映生物活性細胞因子，在這些培養(yǎng)中也檢測了IL-12p70(圖7C和7D)。p70的產(chǎn)生一般平行于p40的產(chǎn)生，這說明病人和正常PBMC對LbeIF4A的免疫應答可產(chǎn)生具有生物活性的IL-12。
在培養(yǎng)的人巨噬細胞(圖9A)和粘附性PBMC(圖9B)中也刺激產(chǎn)生IL-12。通過對正常供體血液的PBMC的Ficoll-hypaque密度梯度離心來分離制備粘附細胞。2×106PBMC在500μlRPMI(含2％人AB血清)中培養(yǎng)2小時。用PBS洗板三次純化粘附細胞。接著加入500μl含相應刺激物(IFN-1000U/ml，LbeIF4A(Lf)10μg/ml)的檢測液(RPMI，2％人AB血清)。18小時后收獲上清。
使用五天齡的PHA胚細胞用一種俘獲生物檢測法對粘附性PBMC中產(chǎn)生的IL-12進行定量。簡單說，將IL-12俘獲抗體C11.5.14(由Wistar研究所惠贈)包被于96孔板上。將誘導反應上清以及作為對照的重組IL-12孵育4小時。洗幾遍后，加入五天齡的PHA胚細胞，胚細胞的增殖用于判定粘附細胞上清中IL-12的濃度。
將粘附細胞(2×106PBMC)在檢測液中培養(yǎng)五天產(chǎn)生巨噬細胞。然后用PBS洗，加入500μl RPMI，2％人AB血清和1000U/mLIFN-γ。巨噬細胞用LbeIF4A(10μg/ml)刺激或單獨培養(yǎng)于培養(yǎng)液(M)中。在另一組中，LbeIF4A對照巨噬細胞在500μl RPMI，2％人AB血清(無IFN-γ)中同LbeIF4A一起培養(yǎng)。18小時后收獲上清，用于誘導IL-12依賴性增殖。簡單說，用巨噬細胞上清培養(yǎng)五天齡胚細胞兩天。最后18小時時加入3H胸腺嘧啶。如前所述加入中和性抗-IL-12多克隆羊血清(5μg/ml)。
另外，LbeIF4A刺激人骨髓瘤細胞系THP-1中IL-12p40的產(chǎn)生(圖10)。細胞以106個細胞/毫升的密度在含5％胎牛血清的無內(nèi)毒素的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48小時。IFN-γ協(xié)同10μg/ml LbeIF4A刺激THP-1細胞分泌IL-12p40。這些結果表明LbeIF4A可用作疫苗佐劑。
實施例9IL-12和IL-10對LbeIF4A誘導產(chǎn)生IFN-γ的影響此實施例研究了LbeIF4A多肽免疫應答中IL-12、IL-10和IFN-γ的相互作用，其中LbeIF4A多肽缺少SEQ ID NO2的氨基端48個殘基(如實施例3中所述)。如圖8A所示，用10μg/ml LbeIF4A(LeIF)或加上10ng/ml的抗-IL-12(LeIF+抗-IL-12)或加上10ng/ml IL-10(LeIF+IL-10)刺激粘膜型利什曼病患者的PBMC，培養(yǎng)上清用于檢測IFN-γ的分泌?？?IL-12單抗和IL-10均阻止LbeIF4A誘導的IFN-γ的分泌。但是，抗-IL-12單抗僅部分減少利什曼體裂解物刺激后的IFN-γ的產(chǎn)生(圖8B)。這些結果表明IFN-γ的產(chǎn)生依賴于IL-12，并被IL-10抑制，而IL-12的產(chǎn)生可以由IFN-γ依賴的和不依賴的兩種途徑來調(diào)節(jié)。
實施例10LbeIF4A對小鼠Th1的刺激作用此實施例舉例說明了缺少SEQ ID NO2氨基端48個殘基的LbeIF4A(如實施例3中所述)在BALB/c小鼠中刺激優(yōu)勢Th1細胞因子。以quilA或CFA作為佐劑用LbeIF4A或8E(L.braziliensis線粒體hspP70的羧基端部分，能夠刺激病人PBMC產(chǎn)生高水平的IL-10)接種動物。接種十天后，用重組抗原體外再次刺激淋巴結(LN)細胞，培養(yǎng)上清用于分泌細胞因子的分析。結果(圖11)表明，用LbeIF4A接種的小鼠的LN細胞在用LbeIF4A和兩種類型佐劑激發(fā)后可增殖并分泌幾乎單一的Th1細胞因子(IFN-γ)。比較而言，用8E接種的小鼠的LN細胞對8E激發(fā)的特異應答產(chǎn)生Th0應答或Th1/Th2型細胞因子(用quilA作為佐劑)，其中極其偏向于產(chǎn)生Th2細胞因子IL-4和IL-10。與此相似，用寄生蟲裂解物接種小鼠產(chǎn)生一混合的細胞因子，此結果可反駁把寄生蟲裂解物單獨用作疫苗候選物的做法(圖11)。
這些結果表明LbeIF4A可用作免疫佐劑，也可用作特異性T細胞疫苗。因為LbeIF4A可誘導一強烈的Th1應答，其中包括與實驗利什曼病肯定相關的兩種細胞因子IFN-γ和IL-12，我們研究了此抗原對小鼠利什曼病的保護能力。用無佐劑LbeIF4A免疫BALB/c小鼠一次，七天后靜脈注射L.major。同對照組相比，LbeIF4A對L.major提供明顯的保護(圖12)。因此來自L.braziliensis的異源蛋白能夠對L.major感染產(chǎn)生保護，這表明在這兩種寄生蟲之間至少有一些保守的“保護性”抗原決定簇。
實施例11LmeIF4A的制備此實施例舉例說明了來自L.major的LbeIF4A新變體的制備。
用ZAP-cDNA單向克隆試劑盒(Stratagee，La Jolla，CA)構建一包括L.major polyA+RNA的cDNA文庫。用放射標記的含有SEQ IDNO1中258到1188位核甘酸的DNA探針篩選大約500,000pfu。雜交后用含0.1％SDS的0.5×SSC55℃洗膜。這樣鑒定出一含有約2.5kb插入的克隆(LmeIF4A)。pBSK(-)噬菌粒序列參照制造商給出的程序切割。核酸內(nèi)切酶III處理插入的cDNA得到重疊的克隆，然后用Taq染料終止子測序。
發(fā)現(xiàn)LmeIF4A大約2.7kb cDNA插入片段包括全部編碼序列，以及5’剪切的前導序列和3’旁側序列。使用5’和3’特異的寡聚核苷酸PCR擴增包含LmeIF4A全部編碼序列的片段。5’寡聚核苷酸在ATG起點之前含有一NdeI位點。克隆到pET載體(Novagen，Madison，WI)的NdeI位點后，蛋白的第一個氨基酸為非融合的重組LmeIF4A的起始密碼子(Met)。應用胞漿載體pET和T7聚合酶表達系統(tǒng)(Novagen，Madison，WI)在大腸桿菌中表達非融合的全長重組LmeIF4A(rLmeIF4A)。分離包涵體，然后用含有2、4和8M尿素的10ml TNE(50mM Tris，pH8.0，100mM NaCl，10mM EDTA)洗滌兩次。含重組抗原的8M尿素部分上樣于制備型SDS-PAGE膠。通過制備膠的電洗脫或HPLC純化重組LmeIF4A。終產(chǎn)物中細菌內(nèi)毒素可忽略(內(nèi)毒素含量用Limulus法測定)。
LmeIF4A cDNA的部分序列分析(SEQ ID NOS3和4)表明LmeIF4A和分離自L.braziliensis的抗原(在核酸和氨基酸水平上)具有相當?shù)耐葱?即氨基酸序列等同性大于90％)。
實施例12抗原特異性CTL應答的引發(fā)此實施例舉例說明了用如上所制備的LmeIF4A引發(fā)一針對卵清蛋白的特異性CTL應答。
用30μg可溶性卵清蛋白(Sigma，St.Louis，MO)單獨(ova)或同包埋于聚乳酸乙醇酸苷小珠(Southern Research Institute，Birmingham，AL)的50μg LmeIF4A一起(Lmeif/PLG)免疫C57BL/6小鼠(H-2b)一次。其他組小鼠還用包埋于PLG小珠的LmeIF4A免疫(ova+Lmeif/PLG)或PLG單獨免疫。用于實驗的小珠的大小范圍在1到10μm之間。
免疫三周后，殺死小鼠，取脾。為得到效應細胞，脾細胞經(jīng)5天輻射(20,000拉德)后，用表達ova的EG7.ova細胞體外刺激。EG7.ova細胞系通過用包含ova cDNA的β-肌動蛋白控制下的質(zhì)粒轉染EL4胸腺瘤細胞系(H-2b)(傳染病研究所，Seattle，WA)而得到，(如Moore等，細胞54777-785，1988所述)
通過能夠裂解51Cr標記EG7.ova但不裂解51Cr標記未轉染的親本EG7.ova的效應細胞的存在估價接種。結果顯示于圖13，以百分毒性和效應細胞與靶細胞比的函數(shù)表示。這些結果證明了用可溶性卵清蛋白和LmeIF4A一起免疫的小鼠表現(xiàn)出良好的可特異地殺死靶細胞的CTL免疫應答。在用LmeIF4A，PLG或可溶性卵清蛋白自身免疫小鼠均檢測不到特異的CTL引發(fā)。
實施例13對三硝基苯酚特異抗體的刺激作用此實施例舉例說明了LmeIF4A對抗-三硝基苯酚(TNP)抗體的增強作用。
3μg TNP-KLH加明礬、或LmeIF4A(75μg)或生理鹽水0天腹腔免疫C57BL/6小鼠。第十天取血，第21天增強免疫(同原始免疫)，第26天取血。用酶連免疫吸附檢測法(ELISA)檢測TNF特異的同型特異抗體應答。數(shù)據(jù)以每個ELISA中產(chǎn)生最大OD值(用線性回歸分析計算)的50％時每個抗血清稀釋度對數(shù)值的形式顯示于圖14。
這些結果表明LmeIF4A同單獨使用抗原相比可顯著增強抗體的應答。特別有趣的是，與Th2應答關系最為密切的抗體類型IgE觀察不到明顯增加。另外，如上所述注射TNP-KLH(3μg)加LmeIF4A(75μg)一次即可增強基礎IgM和IgG抗體應答。
實施例14對MUC-1特異抗體產(chǎn)生的增強作用此實施例舉例說明了用LmeIF4A來增強MUC-1特異抗體的產(chǎn)生。
用人腫瘤抗原MUC-1同LmeIF4A的不同組合免疫C57BL/6小鼠。小鼠的分組包括用可溶性MUC-1(帶有或不帶有可溶性LmeIF4A)以及固定于PLG小珠上的MUC-1(帶有或不帶有可溶性LmeIF4A)免疫的小鼠。兩種不同大小的小珠用于MUC-1/PLG實驗中。其中所用的一批小珠的大小為1-10μm，另一批為40-100μm。免疫后10、20和30天取血，血清用于檢測MUC-1特異抗體(IgM和IgG)的存在。血清還可用來檢測同型抗體μ，γ2a，γ2b，γ1的存在。
結果(圖15所示)證明用MUC-1或MUC-1加上LmeIF4A一次免疫不足以產(chǎn)生抗-MUC-1抗體應答，當MUC-1包埋于PLG珠中時LmeIF4A可顯著增強抗體應答。包埋于小PLG珠中的MUC-1據(jù)推斷早在第一次免疫后10天即可誘導強烈的抗-MUC-1應答，LmeIF4A的加入進一步增強了抗體應答。用包埋于大PLG珠的MUC-1一次免疫在10天之內(nèi)檢測不到抗-MUC-1抗體，但是結合LmeIF4A后大PLG珠中MUC-1免疫小鼠則可觀察到增強的應答?？?MUC-1抗體的同型抗體分布包括IgM、IgGγ2a、IgGγ2b和IgGγ1，但沒有檢測到IgE應答。
實施例15對培養(yǎng)細胞中CTL活性的增強作用此實施例舉例說明了在培養(yǎng)細胞中LmeIF4A對特異CTL活性的增強作用。
用30μg可溶性卵清蛋白或包埋于PLG珠的同濃度的卵清蛋白免疫小鼠。兩周后取脾細胞，用無抗原LmeIF4自身(10μg/ml)、輻射過的EG7.ova或輻射過的EG7.ova加上LmeIF4A(10μg/ml)體外刺激。結果見圖16。
結果表明卵清蛋白/PLG免疫小鼠體內(nèi)可敏化卵清蛋白特異的CTL，這可用刺激性應答脾細胞和EG7.ova刺激細胞來檢測。更進一步，卵清蛋白酶化的腎細胞中產(chǎn)生的CTL在加入LmeIF4A(10μg/ml)到含EG7.ova的培養(yǎng)液中后可顯著提高。應注意的是將EG7.ova或EG7.ova加上LmeIF4A用于第一次體外培養(yǎng)時，總單核細胞的數(shù)量沒有改變(見下面表2和3)。
表IILmeIF4A增強離體CTL活性免疫物離體刺激物裂解單位(LU)/106個單核細胞無無抗原 0LmeIF4A自身 0EG7.ova 0LmeIF4A+EG7.ova 0小珠 無抗原 0LmeIF4A自身 0EG7.ova 0LmeIF4A+EG7.ova 0卵清蛋白/小珠 無抗原 0LmeIF4A自身 0EG7.ova 2.5LmeIF4A+EG7.ova 16.6表III來自含LmeIF4A培養(yǎng)物的單核細胞的回收免疫物 體外刺激物 回收的細胞數(shù)目(LU)(106)/107個加入的單核細胞卵清蛋白/PLGA 無抗原 1.8LmeIF4A自身 2.4EG7.ova 2.52LmeIF4A+EG7.ova 2.88可溶性卵清蛋白 3.2可溶性卵清蛋白+LmeIF4A 2.6
我們也評價了LmeIF4A能否用于體外增強和擴大抗原特異的CTL。來自上面提到的卵清蛋白/PLG免疫小鼠的CTL體外用輻射過的EG7.ova加上IL-2或EG7.ova加上IL-12和LmeIF4A再次刺激。培養(yǎng)五天后，用51Cr標記的EL4或EG7.ova細胞檢測效應細胞。
結果(如圖17所示)表明用EG7.ova加上IL-12和LmeIF4A再刺激的卵清蛋白特異CTL殺死EG7.ova要優(yōu)于用EG7.ova加上IL-2所產(chǎn)生的效應細胞，但區(qū)別不明顯。但是，考慮細胞計量后，用LmeIF4A培養(yǎng)產(chǎn)生的效應細胞要比不用LmeIF4A時高出2.5倍。這些結果(見表4)以每培養(yǎng)物中的裂解單位來表示，證明了LmeIF4A體外增加CTL數(shù)量的整體強度。
表IV來自含LmeIF4A培養(yǎng)物的單核細胞的回收回收細胞數(shù)目(LU)(106)/ 裂解單位免疫物 體外刺激物 106個加入的單核細胞 (LU)/培養(yǎng)物卵清蛋白/PLGA EG7.ova+IL-26.475.2NrEG7.ova+IL-2+LmeIF4A16 388.8實施例16LmeIF4A對同種反應性CTL誘導的增強作用此實施例舉例說明了LmeIF4A對鼠同種反應性CTL的誘導作用。
在2ml RPMIFCS(包括或不包括10μg/ml膠純化的LmeIF4A)中共培養(yǎng)2.5×106BALB/c脾細胞和5×106輻射(3500R)過的C57BL/6脾細胞。五天后收獲培養(yǎng)物，洗后檢測不同濃度效應細胞(培養(yǎng)物部分)對培養(yǎng)于200μl培養(yǎng)液中的51Cr標記的EL4細胞(2000/孔)的細胞裂解活性(4小時釋放測定)。圖18中的數(shù)據(jù)以此釋放的百分數(shù)來表示，計算公式為
這些結果表明LmeIF4A能夠明顯增強同種反應性CTL。同上述結果一起表明，利什曼原蟲eIF4A同源類似物在一系列檢測系統(tǒng)中具有強佐劑活性。進一步講，利什曼原蟲eIF4A同源類似物的IL-12誘導能力和無毒性使之成為獨特的佐劑。
實施例17給予LmeIF4A和抗原后的腫瘤抑制用皮下注射的方式免疫6-8周齡的C57BL/6(H-2b)母鼠一次，所用免疫物包括50μg LmeIF4A或30μg包埋于聚乳酸乙醇酸苷(PLG)小珠的LmeIF4A(LbeIF/PLG)，VSV肽或包埋于PLG珠中的VSV肽，包埋于PLG珠中的GM-CSF，或載體(PBS)。用VSV(帶狀皰疹病毒)核殼蛋白基因轉染EL4細胞得到N1細胞。因為指導VSV核殼蛋白表達的質(zhì)粒含有一篩選性標記新霉素抗性基因，因此細胞可在含G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。從大腸桿菌轉化物中產(chǎn)生重組LmeIF4A，用HPLC分級分離的方法純化?；瘜W合成并用HPLC純化N1特異的肽抗原。蛋白用PLG微球體(Southern Research Institute，Birmingham，AL)包埋。
約2×105N1細胞腹腔接種到C57BL/6小鼠的右側?？捎|摸到腫瘤后，小鼠被隨機分組，每組5只，將上述各肽皮下注射到小鼠的另一側。每2到3天測量腫瘤直徑并換算成體積(按照公式V＝4/3πr3)，以此檢測腫瘤的生長。
檢測了LmeIF4A引發(fā)針對腫瘤特異性抗原的免疫應答的效力。在鼠腫瘤N1中，H-2Kb分子持續(xù)表達八聚體抗原肽抗原決定簇RGYVYQGL。如圖19所示，注射VSV/PLG加LmeIF4A/PLG越明顯抑制腫瘤的生長。在對照組小鼠和接受其他抗原組合的小鼠中觀察不到抑制作用。另一項研究(圖20)證實這個結果并且證實LmeIF4A作為佐劑比GM-CSF要好很多。在這個實驗中，用腫瘤特異性VSV/PLG加LmeIF4A/PLG對小鼠實施免疫注射后一周腫瘤開始消退。實際上，在這個實驗中五只小鼠中的三個的腫瘤完全消失。另外，結合PLG包埋的VSV肽的可溶性LeIF也具有強抗腫瘤活性(圖21)。
另外，通過LmeIF4A和腫瘤抗原共免疫所產(chǎn)生的免疫應答非常特異。通過外科手術從未完全消除N1腫瘤的小鼠中取出殘留的腫瘤。將殘留的腫瘤細胞培養(yǎng)于含有0.2mg/ml G418的培養(yǎng)液中，兩天后死亡。與其相比，用于腫瘤接種的原始N1細胞則可以抗G418。因此，殘留的腫瘤來自已丟失了包含抗原性VSV序列和新霉素抗性基因的質(zhì)粒的N1變體。所以，LeIF能夠增強針對一預定抗原的特異性免疫應答，此免疫應答對腫瘤具有治療效果。
實施例18LmeIF對已建立腫瘤的治療對C57BL/6母鼠皮下注射2×105個Lewis肺癌細胞，8天后檢查所有鼠中的腫瘤。然后將鼠分為兩組，每組5只。在腫瘤接種后的第8，10，13和16天，在遠離腫瘤的部位皮下注射0.2ml生理鹽水或50μg LmeIF(溶于0.2ml生理鹽水)。在第8、10、13和16天檢查腫瘤的生長。如下表所示，16天時接種LmeIF的小鼠的腫瘤生長顯著降低。
表VLmeIF對腫瘤生長的抑制作用腫瘤的平均體積(立方毫米)組別8天 10天 13天 16天注射鹽水組 5.2112.6141.06283.53注射Lmeif組 6.7910.8326.7569.48從上文中可以認識到，盡管為說明的目的描述了本發(fā)明的具體實施方案，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的前提下可進行各種修改。
序列表(1)一般資料(i)申請人Reed，Steven G.
(ii)發(fā)明題目增強保護性免疫應答的方法(iii)序列數(shù)目4(iv)通信地址(A)收信人SEED and BERRY(B)街道6300 Columbia Center，701 Fifth Avenue(C)城市西雅圖(D)州華盛頓(F)郵政編碼98104-7092(v)計算機閱讀模式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)目前申請材料(A)申請?zhí)?B)遞交日期16-FEB-1996(C)類別(viii)律師/代理人資料(A)姓名Nottenburg Ph.D.，Carol(B)登記號39，317(C)卷號/備案號210121.404C3(ix)電信資料(A)電話(206)622-4900(B)傳真(206)682-6031(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特點(A)長度1618堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置115..1326(xi)序列詳述SEQ ID NO1CCACTCTCTC GGTCGTCTGT CTCCCACGCG CGCACGCAGT TGATTTCCGC CTTCTTAAAC 60GCTCTCTTTT TTTTTATTTT TCACCTGACC AACCGCACCA CGTCGGCCTC CATC ATG117Met1 1TCG CAG CAA GAC CGA GTT GCC CCA CAG GAC CAG GAC TCG TTC CTC GAC 165Ser Gln Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu Asp5 10 15GAC CAG CCC GGC GTC CGC CCG ATC CCG TCC TTC GAT GAC ATG CCG TTG 213Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro Leu20 25 30CAC CAG AAC CTT CTG CGC GGC ATC TAC TCG TAC GGC TTC GAG AAA CCG 261His Gln Asn 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Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp Val150 155 160ATC AAG CGC GGC GCG CTG CGC ACC GAG TCC CTG CGC GTG CTG GTG CTC 645Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val Leu165 170 175GAC GAG GCT GAT GAG ATG CTG TCT CAG GGC TTC GCG GAT CAG ATT TAC 693Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile Tyr180 185 190GAG ATC TTC CGC TTC CTG CCG AAG GAC ATC CAG GTC GCG CTC TTC TCC 741Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe Ser195 200 205GCC ACG ATG CCG GAG GAG GTG CTG GAG CTG ACA AAG AAG TTC ATG CGC 789Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met Arg210 215 220 225GAC CCC GTA CGC ATT CTC GTG AAG CGC GAG AGC CTG ACG CTG GAG GGC 837Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu Gly230 235 240ATC AAG CAG TTC TTC ATC GCC GTC GAG GAG GAG CAC AAG CTG GAC ACG 885Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp Thr245 250 255CTG ATG GAC CTG TAC GAG ACC GTG TCC ATC GCG CAG TCC GTC ATC TTC933Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile Phe260 265 270GCC AAC ACC CGC CGC AAG GTG GAC TGG ATC GCC GAG AAG CTG AAT CAG981Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn Gln275 280 285AGC AAC CAC ACC GTC AGC AGC ATG CAC GCC GAG ATG CCC AAG AGC GAC 1029Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser Asp290 295 300 305CGC GAG CGC GTC ATG AAC ACC TTC CGC AGC GGC AGC TCC CGC GTG CTC 1077Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val Leu310 315 320GTA ACG ACC GAC CTC GTG GCC CGC GGC ATC GAC GTG CAC CAC GTG AAC 1125Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val Asn325 330 335ATC GTC ATC AAC TTC GAC CTG CCG ACG AAC AAG GAG AAC TAC CTG CAC 1173Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu His340 345 350CGC ATT GGC CGC GGC GGC CGC TAC GGC GTA AAG GGT GTT GCC ATC AAC 1221Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Val Lys Gly Val Ala Ile Asn355 360 365TTC GTG ACG GAG AAA GAC GTG GAG CTG CTG CAC GAG ATC GAG GGG CAC 1269Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly His370 375 380 385TAC CAC ACG CAG ATC GAT GAG CTC CCG GTG GAC TTT GCC GCC TAC CTC 1317Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr Leu390 395 400GGC GAG TGA GCGGGCCCCT GCCCCCCTTC CCTGCCCCCC TCTCGCGACG 1366Gly GluAGAGAACGCA CATCGTAACA CAGCCACGCG AACGATAGTA AGGGCGTGCG GCGGCGTTCC 1426CCTCCTCCTG CCAGCGGCCC CCCTCCGCAG CGCTTCTCTT TTGAGAGGGG GGCAGGGGGA 1486GGCGCTGCGC CTGGCTGGAT GTGTGCTTGA GCTTGCATTC CGTCAAGCAA GTGCTTTGTT 1546TTAATTATGC GCGCCGTTTT GTTGCTCGTC CCTTTCGTTG GTGTTTTTTC GGCCGAAACG 1606GCGTTTAAAG CA 1618(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特點(A)長度403個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列詳述SEQ ID NO2Met Ser Gln Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu1 5 10 15Asp Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro20 25 30Leu His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys35 40 45Pro Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly50 55 60Asp Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe65 70 75 80Ser Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln85 90 95Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu100 105 110Val Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys115 120 125Glu Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu130 135 140Gln Ala Gly Val Val Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Val Lys Gly Val Ala Ile355 360 365Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly370 375 380His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385 390 395 400Leu Gly Glu(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特點(A)長度1678堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置117..1325(xi)序列詳述SEQ ID NO3CTTTATTGTT GATTTCCGCC TTCTGAACAG CCCTCATTTT TTTTTGGTTT ACCTCTCGTT60GCTTGTGACG CCCCTCCCCC TCTTCACCCA TCAAGCACCC CCTGTCGTCC TCCATC 116ATG GCG CAG AAT GAT AAG ATC GCC CCC CAG GAC CAG GAC TCC TTC CTC 164Met Ala Gln Asn Asp Lys Ile Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu1 5 10 15GAT GAC CAG CCC GGC GTT CGC CCG ATC CCG TCC TTC GAC GAC ATG CCG 212Asp Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro20 25 30CTG CAC CAG AAC CTG CTG CGT GGC ATC TAC TCG TAC GGG TTC GAG AAG 260Leu His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys35 40 45cCG TCC AGC ATC CAG CAG CGC GCG ATA GCC CCC TTC ACG CGC GGC GGC 306pro Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly50 55 60GAC ATC ATC GCG CAG GCC CAG TCC GGT ACC GGC AAG ACG GGT GCC TTC 356Asp Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe65 70 75 80TCC ATC GGT CTG CTG CAG CGC CTG GAC TTC CGC CAC AAC CTG ATC CAG 404Ser Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln85 90 95GGC CTC GTG CTC TCC CCC ACT CGC GAG CTG GCC CTG CAG ACG GCG GAG452Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu100 105 110GTG ATC AGC CGC ATC GGT GAG TTC CTG TCG AAC AGC TCC AAG TTC TGC500Val Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ser Lys Phe Cys115 120 125GAG ACC TTT GTC GGC GGC ACG CGC GTG CAG GAT GAC CTG CGC AAG CTG548Glu Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu130 135 140CAG GCC GGC GTC ATC GTT GCC GTG GGC ACG CCG GGC CGC GTG TCC GAC596Gln Ala Gly Val Ile Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160GTG ATC AAG CGT GGC GCG CTG CGC ACA GAG TCG CTG CGC GTG CTG GTG644Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175CTC GAC GAG GCT GAT GAG ATG CTG TCT CAG GGC TTC GCG GAC CAG ATT692Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190TAC GAG ATC TTC CGC TTC CTG CCG AAG GAC ATC CAG GTC GCG CTC TTC740Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205TCC GCC ACG ATG CCG GAG GAG GTA CTG GAG CTG ACG AAG AAG TTC ATG788Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220CGC GAC CCC GTG CGT ATT CTC GTG AAG CGC GAG AGC CTG ACG CTG GAG836Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240GGC ATC AAG CAG TTC TTC ATC GCC GTC GAA GAG GAG CAC AAG CTG GAC884Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255ACG CTG ATG GAC CTG TAC GAG ACC GTG TCC ATC GCG CAG TCC GTC ATC932Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270TTC GCC AAC ACG CGC CGC AAG GTG GAC TGG ATC GCC GAG AAG CTG AAC980Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285CAG AGC AAC CAC ACC GTC AGC AGC ATG CAC GCC GAG ATG CCC AAG AGC 1028Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300GAC CGC GAG CGC GTC ATG AAC ACC TTC CGC AGC GGC AGC TCC CGC GTG 1076Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320CTC GTC ACG ACC GAC CTC GTG GCG CGC GGT ATC GAT GTG CAC CAC GTG 1124Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335AAC ATC GTC ATC AAC TTC GAC CTG CCA ACG AAC AAG GAG AAC TAC CTG 1172Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350CAT CGC ATT GGT CGC GGC GGC CGC TAC GGC CGT AAG GGT GTT GCC ATC 1220His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile355 360 365AAC TTC GTG ACG GAG AAG GAC GTG GAG CTA CTG CAC GAG ATC GAG GCG 1268Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Ala370 375 380CAC TAC CAC ACG CAG ATC GAC GAG CTC CCG GTC GAC TTC GCT GCC TAC 1316His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385 390 395 400CTT GGC GAG TAA GCGGGTCCTT GCCTCCCCCC CCCTCCTCCT CCATCCCCAT 1368Leu Gly GluCCCCCACCAC CCCACACACC CCCCCCCCGT TCCTCGTCGG AAGAAGAAAG GACGCACATC 1428GCCACGCGAA GGATGACGAG GGCTGAGGAG GAGCTCAGGG AACGGACTCG TCCCCGGTGA 1488GCGGGGGGAG GAGGAGGTGA GGCCATCGCG CGAGCGCACC GCCGGAAGGT CGACCAGGGC 1548GCTCAACACC CACCCAGCAC CCCGGTAGTT CCCTGCCCTC TCGTGCGCCT CCTCTCCCAC 1608CCCGTAAATC TCCTGACGAC TTTGTGTGGA CCACACACGC GCGCTCTCGC TCCGTATCGG 1668ACGCGCCCTA TACAACACAA CGAACCCGCC AACGTGCCGG TCGNCTTGTG GATGTGTGTC 1728TGGCGTAGAA CGTGCGTCTG CCCCCGTCCC ATCCCCATCC CACCTCCTCG NGTGTGTGTG 1788TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGTGTGTGTG TTTAAAAACT ATNATNTAGA 1848ATATATATCT ATATAGGTN 1867(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特點(A)長度403個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列詳述SEQ ID NO4Met Ala Gln Asn Asp Lys Ile Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu1 5 10 15Asp Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro20 25 30Leu His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys35 40 45Pro Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly50 55 60Asp Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe65 70 75 80Ser Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln85 90 95Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu100 105 110Val Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ser Lys Phe Cys115 120 125Glu Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu130 135 140Gln Ala Gly Val Ile Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile355 360 365Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Ala370 375 380His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385 390 395 400Leu Gly Glu
權利要求
1.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的、包括一種抗原和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
3.根據(jù)權利要求1的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的1-403位氨基酸或其部分。
4.根據(jù)權利要求1的組合物，其中LbeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc區(qū)。
5.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的、包括一種抗原和一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
6.根據(jù)權利要求5的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的49-403位氨基酸。
7.根據(jù)權利要求5的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸或其部分。
8.根據(jù)權利要求5的組合物，其中LmeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc區(qū)。
9.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的、包括一種抗原和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
10.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的、包括一種抗原和一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
11.根據(jù)權利要求1-10的組合物，其中抗原和LbeIF4A或LmeIF4A多肽存在于同一組合物中。
12.根據(jù)權利要求1-10的組合物，其中抗原包埋于可生物降解的微球體中。
13.根據(jù)權利要求書1-10的組合物，其中LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球體中或結合于其表面。
14.根據(jù)權利要求1-10的組合物，其中抗原和LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球體中。
15.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某DNA疫苗的免疫應答的藥物的、包括一種DNA疫苗和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
16.根據(jù)權利要求15的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO2的49-403位氨基酸。
17.根據(jù)權利要求15的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO2的1-403位氨基酸序列或其部分。
18.根據(jù)權利要求15的組合物，其中LbeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc區(qū)。
19.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某DNA疫苗的免疫應答的藥物的、包括一種DNA疫苗和一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
20.根據(jù)權利要求19的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的49-403位氨基酸。
21.根據(jù)權利要求19的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸或其部分。
22.根據(jù)權利要求19的組合物，其中LmeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc區(qū)。
23.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某DNA疫苗的免疫應答的藥物的、包括一種DNA疫苗和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
24.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某DNA疫苗的免疫應答的藥物的、包括一種DNA疫苗和一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
25.根據(jù)權利要求15-24中任一項的組合物，其中DNA疫苗和LbeIF4A或LmeIF4A多肽存在于同一組合物中。
26.根據(jù)權利要求15-24中任一項的組合物，其中DNA疫苗包埋于可生物降解的微球體中。
27.根據(jù)權利要求15-24中任一項的組合物，其中LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球體中或結合于其表面上。
28.根據(jù)權利要求15-24中任一項的組合物，其中DNA疫苗和LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球體中。
29.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的、包括一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
30.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的、包括一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
31.一種在生物學樣本中增強或引發(fā)免疫應答的方法，包括將生物學樣本與一種抗原和一種LbeIF4A多肽接觸，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽；并且其中生物學樣本包括選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞以及其組合的細胞。
32.一種在生物學樣本中增強或引發(fā)免疫應答的方法，包括將生物學樣本與一種抗原和一種LmeIF4A多肽接觸，其中LmeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽；并且其中生物學樣本包括選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞以及其組合的細胞。
33.一種在生物學樣本中增強或引發(fā)免疫應答的方法，包括將生物學樣本與一種DNA疫苗和一種LbeIF4A多肽接觸，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽；并且其中生物學樣本包括選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞及其組合的細胞。
34.一種在生物學樣本中增強或引發(fā)免疫應答的方法，包括將生物學樣本與一種DNA疫苗和一種LmeIF4A多肽接觸，其中LmeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽；并且其中生物學樣本包括選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞及其組合的細胞。
35.一種在生物學樣本中增強或引發(fā)免疫應答的方法，包括將生物學樣本與一種LbeIF4A多肽接觸，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO.1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽；并且其中生物學樣本包括選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞及其組合的細胞。
36.一種在生物學樣本中增強或引發(fā)免疫應答的方法，包括將生物學樣本與一種LmeIF4A多肽接觸，其中LmeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽；并且其中生物學樣本包括選自外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、樹突細胞及其組合的細胞。
37.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種腫瘤抗原和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的CTL應答的多肽。
38.根據(jù)權利要求37的方法，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
39.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種腫瘤抗原和一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的CTL應答的多肽。
40.根據(jù)權利要求39的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4 49-403的位氨基酸。
41.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種腫瘤抗原和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
42.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種腫瘤抗原和一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
43.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種編碼腫瘤抗原的DNA疫苗和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的CTL應答的多肽。
44.根據(jù)權利要求44的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
45.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種編碼腫瘤抗原的DNA疫苗和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血中單核細胞的CTL應答的多肽。
46.根據(jù)權利要求45的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的49-403位氨基酸。
47.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種編碼腫瘤抗原的DNA疫苗和一種LbeIF4A多肽的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸；或是其保守性替代和/或修飾變體。
48.用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的、包括一種編碼腫瘤抗原的DNA疫苗和一種LmeIF4A多肽的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修飾變體。
49.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的LbeIF4A多肽，包括(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得的外周血單核細胞的CTL應答的多肽。
50.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的LmeIF4A多肽，包括(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得的外周血單核細胞的CTL反應的多肽。
51.根據(jù)權利要求39-50中任一項的組合物，其中LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球體中或結合于其表面上。
52.根據(jù)權利要求49或50中任一項的組合物，另外包含一種選自細胞因子和化療試劑的治療試劑。
53.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種抗原和一種病毒載體，其中在用該病毒載體感染的病人細胞中病毒載體指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
54.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種抗原和一種核酸分子，其中在用該核酸分子轉染的病人細胞中核酸分子指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
55.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某DNA疫苗的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種DNA疫苗和一種病毒載體，其中在用該病毒載體感染的病人細胞中病毒載體指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
56.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某DNA疫苗的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種DNA疫苗和一種核酸分子，其中在用該核酸分子轉染的病人細胞中核酸分子指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
57.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種病毒載體，其中在用該病毒載體感染的病人細胞中病毒載體指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
58.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某抗原的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種核酸分子，其中在用核酸分子轉染的病人細胞中核酸分子指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
59.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種腫瘤抗原和一種病毒載體，其中在用該病毒載體感染的病人細胞中病毒載體指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
60.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種腫瘤抗原和一種核酸分子，其中在用該核酸分子轉染的病人細胞中核酸分子指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
61. 一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種編碼腫瘤抗原的DNA疫苗和一種病毒載體，其中在用該病毒載體感染的病人細胞中病毒載體指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
62.一種用于制備在病人體內(nèi)增強或引發(fā)針對某腫瘤的免疫應答的藥物的組合物，其包含一種編碼腫瘤抗原的DNA疫苗和一種核酸分子，其中在用該核酸分子轉染的病人細胞中核酸分子指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
63.一種用于制備治療病人腫瘤的組合物，其包含一種病毒載體，在用該病毒載體感染的病人細胞中該病毒載體指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
64.一種用于制備治療病人腫瘤的組合物，其包含一種核酸分子，在用該核酸分子轉染的病人細胞中核酸分子指導LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表達。
65.根據(jù)權利要求53-64中任一項的組合物，其中多肽是LbeIF4A多肽，后者包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
66.根據(jù)權利要求65的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
67.根據(jù)權利要求65的組合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO2的1-403位氨基酸或其部分。
68.根據(jù)權利要求53-64中任一項的組合物，其中多肽是LmeIF4A多肽，后者包括選自下組的DNA序列所編碼的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等嚴緊的條件下與SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互補鏈雜交的DNA序列，其中該DNA序列編碼可以刺激從利什曼原蟲感染個體所得外周血單核細胞的Th1免疫應答的多肽。
69.根據(jù)權利要求68的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的49-403位氨基酸。
70.根據(jù)權利要求68的組合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的1-403位氨基酸或其部分。
71.根據(jù)權利要求53或59的組合物，其中病毒載體也指導抗原的表達。
72.根據(jù)權利要求54或60的組合物，其中核酸分子也指導抗原的表達。
全文摘要
本文提供了引發(fā)或增強對抗原包括腫瘤抗原和/或DNA疫苗的免疫應答的方法。該方法中使用包括利什曼原蟲L.braziliensis或L.major中真核啟動因子4A同源類似物中的至少一個生物活性部分或其變化的多肽或核酸組分。這種多肽和核酸組分可有效地增強或引發(fā)病人的細胞和/或體液免疫應答,如用于腫瘤的治療。
文檔編號A61K38/00GK1194000SQ96195382
公開日1998年9月23日 申請日期1996年6月5日 優(yōu)先權日1995年6月6日
發(fā)明者S·G·芮德 申請人:科里克薩有限公司