專利名稱：佐劑病毒顆粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及攜帶免疫原和具有免疫增強或佐劑活性的病毒顆粒。本發(fā)明具體涉及重組病毒顆粒和在人或動物中借助這些顆粒增強免疫應答的方法。
背景技術：
接種是最有效的抗擊傳染病的方法。新病毒病的出現(xiàn)(例如丙型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒)，和病原菌(傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhii))對抗生素的抗性是令人擔憂的。接種因此成為幫助控制這些疾病的有效備選方案。
在過去15年中，遺傳工程允許精確鑒定負責保護性免疫應答的蛋白質(zhì)片段。因此，出現(xiàn)新的接種策略。用適當免疫原性肽免疫動物允許生產(chǎn)可以控制疾病的中和抗體。那些免疫原性肽在異種系統(tǒng)中的表達提供亞單位疫苗的基礎。
盡管已經(jīng)證實化學合成的寡肽能夠刺激針對衍生它們的蛋白質(zhì)的抗體生產(chǎn)，通常已發(fā)現(xiàn)肽本身免疫原性不足以用作疫苗。這是已經(jīng)有相當大興趣開發(fā)表位呈遞系統(tǒng)的原因，在該系統(tǒng)中肽序列與能夠組裝成大分子結構的載體分子融合。
當向宿主施用抗原時，通過使用免疫增強劑如佐劑，可以增強特異性免疫。免疫應答由免疫系統(tǒng)中的各種細胞介導。存在兩種類型的免疫應答由抗體介導的體液免疫，和主要由細胞毒性T淋巴細胞介導的細胞免疫?？乖蔬f細胞(“APC”)加工和呈遞抗原至B和T細胞。作為激活結果B細胞分泌特異性抗體，T細胞變成體液應答的輔助細胞或細胞毒性細胞并直接攻擊抗原。佐劑已經(jīng)顯示增加這些免疫應答。
抗原的初始呈遞誘導IgM和IgG抗體，形成初次應答。然而該抗體的生產(chǎn)可能隨時間下降。再次應答主要涉及IgG抗體的生產(chǎn)，可以通過第二次或時間較晚的抗原呈遞引發(fā)。然而僅通過用抗原起動宿主不能保證再次應答乃至初次應答。
抗原施用中經(jīng)常遇到的一個困難是免疫系統(tǒng)響應的程度。某些抗原免疫原性不高，因為在施用后它們激發(fā)弱的初次應答或根本無應答。在這些情形中，免疫系統(tǒng)可能不對二次攻擊響應，例如，宿主可能遭受計劃防止抗原免疫的疾病或病癥。
在這些情形中，通常提供生理應答調(diào)節(jié)劑(“PRM”)。PRM通常定義為免疫增強化合物。它可以來源于細菌，如百日咳博德特氏菌(Bordellapertussis)或小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。PRM還可以包括化學物質(zhì)，如多核苷酸，生理活性分子，如胸腺激素，和佐劑。
佐劑是當與抗原施用時增強免疫系統(tǒng)應答的化合物，產(chǎn)生更高的抗體滴度和延長的宿主應答。通常使用的佐劑包括由油包水型乳狀液組成的不完全弗氏佐劑，包含以上及加入的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的弗氏完全佐劑和明礬。然而在人中使用這些材料的困難例如在于它們有毒或者可導致宿主在注射位點發(fā)展損傷。
Kawamura和Berzofsky在J.Immunol.，13658(1986)中描述另一種方法。在該方法中，將與某些B細胞上存在的免疫球蛋白反應的抗-Ig抗體與鐵蛋白和肌紅蛋白偶聯(lián)，并與不完全弗氏佐劑施用于小鼠?；旌衔锏拿庖咴愿纳屏耍珱]有表明未加入佐劑的混合物的免疫原性。此外，盡管佐劑如弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑和Montanide可以極大地增強對抗原的免疫應答，它們具有一些缺點。當與注射形式的抗原使用時，在注射位點經(jīng)常形成大的損傷，該情形使得它們不能令人滿意地用于人，寵物或肉用家畜。此外，當口服或腸內(nèi)施用時，這些佐劑不能用作免疫增強劑。
本領域已知不同性質(zhì)的免疫原或抗原載體可以相對容易地遺傳改造。植物病毒是可以在植物中生產(chǎn)的那些系統(tǒng)和容易適合于本申請。豇豆花葉病毒(CPMV)，煙草花葉病毒X(TMVX)，和苜?；ㄈ~病毒(AIMV)已知已經(jīng)被修飾來呈遞目標表位。另一種植物病毒載體，馬鈴薯病毒X(PVX)，馬鈴薯X病毒組成員，已知容忍攜帶完整的蛋白質(zhì)外殼。此外，美國專利6,232,099和6,042,832，國際專利申請公開號WO97/39134，WO02/04007，WO01/66778，WO02/00169，和歐洲專利申請1167530，全部描述攜帶與內(nèi)源蛋白質(zhì)融合的外源蛋白質(zhì)的病毒樣顆粒的不同變體。然而，在這些參考文獻中沒有任何地方提及該顆粒具有任何免疫增強或佐劑性能。
鑒于本文所述現(xiàn)有技術，仍有對允許強烈免疫人和動物而同時避免實際實行的佐劑和二次免疫的使用的化合物和載體顆粒的巨大需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供具有免疫增強性能的免疫原-載體復合體，其由攜帶至少一種與所述VLP的蛋白質(zhì)或其片段融合的免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成，可以用于制備誘導針對蛋白質(zhì)或其片段的免疫應答的組合物。
本發(fā)明另一目的是提供包含病毒樣顆粒(VLP)和來源于病毒、細菌或寄生蟲的蛋白質(zhì)或提取物的組合物，其可以用作疫苗。
按照本發(fā)明還提供在人或動物中免疫增強免疫應答的方法，其包含向所述人或動物施用免疫原-載體，其由攜帶至少一種與所述VLP的蛋白質(zhì)或其片段融合的免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成，或者與不與所述VLP直接連接的抗原共同施用VLP或其片段。
本發(fā)明還涉及編碼由攜帶至少一種與蛋白質(zhì)融合的免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成的免疫原-載體復合體的多核苷酸，或編碼由所述VLP其片段、或單獨VLP組成的免疫原-載體復合體的多核苷酸，當在植物細胞、動物細胞或微生物中表達時，所述免疫原-載體復合體具有組裝的能力。
本發(fā)明還提供番木瓜花葉病毒(papaya mosaic virus)作為佐劑的應用。
為了本發(fā)明的目的以下定義下列術語。
當兩個或多個通常編碼兩個單獨蛋白質(zhì)的基因天然或作為人工干預的結果重組而編碼那兩個蛋白質(zhì)各自全部或部分的組合的蛋白質(zhì)時，產(chǎn)生表述“嵌合蛋白質(zhì)”。
表述“融合衣殼蛋白”是指其中融合基因之一編碼植物病毒的衣殼蛋白的融合蛋白。
本文所用表述“保護性免疫”意欲是指動物如哺乳動物、鳥類、或魚抵抗(延緩癥狀發(fā)作或減輕癥狀嚴重程度)作為其暴露于病原體抗原的結果或在與病原體接觸之后的疾病或死亡的能力。通過一種或多種下列機制實現(xiàn)保護性免疫粘膜，體液或細胞免疫。粘膜免疫主要是呼吸道、腸胃道和泌尿生殖道的粘膜表面上分泌的IgA(sIGA)抗體的結果。在一系列由抗原加工細胞(B和T淋巴細胞)介導的導致B淋巴細胞在身體粘膜系組織上sIGA生產(chǎn)的事件之后產(chǎn)生sIGA抗體。通過口服疫苗可以刺激粘膜免疫。保護性免疫的主要結果是破壞病原體或抑制其復制自身的能力。
本文所用表述“體液免疫”是指血清中IgG抗體和IgM抗體的結果。
通過細胞毒性T淋巴細胞或通過涉及巨噬細胞和T淋巴細胞的遲發(fā)型超敏反應以及不需要抗體的涉及T細胞的其它機制可以實現(xiàn)本文所用表述“細胞免疫”。
“重組病毒”是其中病毒的遺傳物質(zhì)已經(jīng)與其它遺傳材料組合的病毒。
本文所用術語“多肽”或“肽”意欲是指其中存在至少四個肽鍵連接的氨基酸的分子。
本文所用表述“病毒核酸”可以是病毒的基因組(或其大部分)，或與該基因組堿基序列互補的核酸分子。與病毒RNA互補的DNA分子也認為是病毒核酸。與病毒DNA堿基序列互補的RNA分子也被認為是病毒核酸。
本文所用術語“病毒樣顆粒”(VLP)是指與病毒顆粒具有類似物理外觀的自組裝顆粒并且包括假病毒。病毒樣顆粒可以缺少或具有功能異常的某些野生型病毒基因的拷貝，這可導致病毒樣顆粒不具有野生型病毒特征的一些功能，如復制和/或細胞-細胞移動。
本文所用術語“疫苗”意欲是指融合蛋白，該蛋白作為一部分的任何顆粒，或該蛋白作為一部分的任何制劑如植物材料。
本文所用術語“免疫增強劑”意欲是指當與抗原混合時增強免疫原性或抗原性和提供優(yōu)異免疫應答的物質(zhì)。應當認識到它可以增強巨噬細胞和其它抗原呈遞細胞上共刺激因子的表達。
附圖簡述

圖1舉例說明純化的PapMV的電子顯微照片；圖2舉例說明PapMV CP的苜蓿素(tricine)的SDS-PAGE分析(A)和顯示融合暴露在PapMV VLP表面上的免疫金標記(B)；
圖3A-3G舉例說明體外組裝的PapMV和PapMV VLP的電子顯微照片；圖4舉例說明在氣囊模型中PapMV誘導的白細胞累積；圖5舉例說明對PapMV的免疫應答。IP注射PapMV或ISS(等滲鹽溶液)一次的小鼠(每個濃度6只)；圖6舉例說明對PapMV的免疫應答。IP注射PapMV或ISS(等滲鹽溶液)一次的小鼠(每個濃度6只)；圖7舉例說明PapMV作為卵清蛋白佐劑的效力評估；圖8A和8B舉例說明對PapMV和來自HCV表面糖蛋白的E1和E2的HCV肽的免疫應答的特征；和圖9舉例說明顯示在腹膜內(nèi)注射后PapMV CP向淋巴結和脾特異性遷移的蛋白印跡。
實施本發(fā)明的方法按照本發(fā)明，提供攜帶與內(nèi)源性病毒蛋白融合的免疫原的病毒樣顆粒，由此形成還能夠免疫增強或具有佐劑作用的新型免疫原-載體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一類載體，其當與免疫原或半抗原遺傳連鎖時可以增強宿主對免疫原或半抗原的免疫應答，無論復合體腸胃外、腸內(nèi)或口服施用。另外它們的應用不導致注射位點的大損傷形成。
輔佐細胞如巨噬細胞，B淋巴細胞，和樹突細胞對于T細胞依賴性免疫應答的誘導是關鍵性的。輔佐細胞將抗原呈遞給MHC-限制T細胞和生產(chǎn)膜相關的和分泌的共刺激因子，增強T淋巴細胞的增殖和分化。因此，感受態(tài)輔佐細胞的存在刺激T細胞依賴性免疫應答，它們的缺乏導致應答不足。該抗原呈遞細胞(APC)運送的休眠的巨噬細胞和天然、未刺激的B淋巴細胞可能不能刺激天然CD4+T細胞，甚至可能誘導T細胞耐受。相反，樹突細胞和激活的巨噬細胞和B細胞表達共刺激因子，以及高水平的APC。本發(fā)明免疫原-載體的作用機制是增強巨噬細胞和其它APC上共刺激因子的表達。為此，免疫原或蛋白質(zhì)抗原與同時作為佐劑的本發(fā)明免疫原載體的施用，促進細胞介導免疫和T細胞依賴性抗體的生產(chǎn)。當與本發(fā)明免疫原-載體偶聯(lián)在一起施用時，免疫原對于產(chǎn)生系統(tǒng)免疫最有效。
在第一個實施方案中，本發(fā)明提供復合體，其包含與載體病毒樣顆粒(VLP)偶聯(lián)的免疫原，以使當將復合體施用于所述宿主時載體分子導致宿主對免疫原的免疫應答增強，其中免疫原可以包含抗原或半抗原和載體分子包含完整的病毒顆粒。更具體地，本發(fā)明的病毒是植物病毒。
獲得良好B細胞應答的一種方法是將抗原以有組織的形式提供。顯示重復排列的表位與B細胞受體有效交聯(lián)和迅速誘導不依賴T的IgM應答，稍后接著IgG應答。因此，增加表位免疫原性和對免疫系統(tǒng)的識別和呈遞的一個好策略是如在植物病毒如PapMV的表面上以有組織的形式表達優(yōu)勢免疫表位。特別是，PapMV具備良好佐劑和載體的幾個特征，因為它是系統(tǒng)發(fā)育距離遠的抗原，它對于哺乳動物免疫系統(tǒng)是外源的，它的分子極其復雜并且是具有高分子量的有組織的結構。
申請人已經(jīng)意外地認識到晶體和重復結構不僅被先天免疫系統(tǒng)識別，而且另外對免疫宿主的免疫系統(tǒng)具有佐劑作用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種方法，其中良性高拷貝數(shù)桿狀病毒、優(yōu)選植物病毒如番木瓜花葉病毒(PapMV)的應用生產(chǎn)與病毒外殼蛋白亞基連接的免疫原。當組裝時，病毒顆粒每個病毒粒包含多于1000個相同融合蛋白(其典型地為外殼蛋白-外源蛋白的融合分子)的長螺旋陣列。通常，免疫原部分將展示在病毒顆粒的外表面。
按照本發(fā)明，植物和動物病毒的衣殼蛋白的結構滿足這些要求并且可以設計呈遞來源于病原體或其它來源的免疫原性肽，從而生產(chǎn)疫苗-佐劑。番木瓜花葉病毒(PapMV)的外殼蛋白例如，但不限于此，是開發(fā)該免疫原-載體-免疫增強劑的優(yōu)異候選物。該病毒具有晶體桿狀并且重復性極高(每個病毒粒1200個拷貝的相同亞基)。最近使用PapMV的免疫實驗顯示該病毒在小鼠中誘導極強的免疫應答和是開發(fā)疫苗的極好載體。可以用幾種HCV表面包膜蛋白的免疫原性肽，如例如來源于膜孔蛋白的傷寒沙門氏桿菌肽，和用胰島素的肽α9-23來設計該免疫原載體病毒。由病毒樣顆粒(VLP)攜帶的融合外殼蛋白的組裝定義為具有佐劑或免疫增強性能的免疫原-載體。
按照本發(fā)明，可以免疫增強，或加強對給定抗原的免疫反應。特別是已知在它們在體內(nèi)系統(tǒng)中激發(fā)抗體的能力方面小分子經(jīng)常僅用作弱免疫原。當連接到本發(fā)明的、自身是抗原性的免疫原-載體病毒上時，它將產(chǎn)生對小分子的提高的抗體應答。在該系統(tǒng)中與免疫原-載體連接的小分子可以成為半抗原或抗原，并且大小可以從小變到相當大。在該組合對衛(wèi)生保健有意義的一個實施例中，乙型肝炎表面抗原的一小部分，包含其本身不是抗原性的測定的氨基酸序列，可以與VLP(匙孔免疫原載體)共價結合，獲得的偶聯(lián)物在體內(nèi)系統(tǒng)中激發(fā)可以與VLP的天然表面抗原并且還強烈與整個肝炎病毒交叉反應的抗體。該免疫原-載體系統(tǒng)可以是針對半抗原或抗原編碼的疾病的有效疫苗的基礎。
在本發(fā)明中，提供如下所述的某些新型免疫原-載體，其便利地通過重組DNA技術生產(chǎn)，用于提供單價以及多價免疫原性疫苗，和利用上述免疫原-載體概念。
免疫原與載體VLP偶聯(lián)形成免疫原-載體復合體并且然后可以用于宿主中以便激發(fā)免疫應答。免疫原對于T細胞，B細胞，NK細胞和巨噬細胞上的表面結構可以是特異性的或識別的，但對于I類或II類APC相關細胞表面結構則不然。
載體VLP偶聯(lián)的免疫原可以包含肽，半抗原，糖，蛋白質(zhì)，核酸，和病毒一部分，細菌，寄生蟲和其它完整的微生物。無論選擇哪種免疫原，它必須以不干擾宿主免疫系統(tǒng)識別免疫原作為免疫原性實體的方式與載體VLP偶聯(lián)。
免疫原-載體復合體可以用作在宿主中產(chǎn)生免疫應答的疫苗。開始可以以適當劑量提供復合體以便引發(fā)免疫應答。這可以接著用復合體或單獨免疫原加強。該方法的變化可包括形成一種或多種免疫原-載體復合體，其中一種或多種形式的免疫原與一種或多種載體VLP偶聯(lián)并施用多種該復合體。
施用免疫原-載體復合體的目的是以免疫的形式為宿主提供針對抗原的保護和避免使用具有不希望有的副作用的佐劑。
在一個實施方案中，抗原可以小至諸如半抗原的免疫原或者可以相對大，如病毒的一部分。抗原的大小和類型對于本發(fā)明的實施不是關鍵性的。可以使用期望在宿主中針對其產(chǎn)生免疫應答的任何抗原。然而，本發(fā)明對于小的弱免疫原性半抗原特別有效。
一旦一種或多種免疫原-載體復合體形成，可將該一種或多種復合體施用于宿主。給藥方案無需不同于其它任何常規(guī)接受的接種程序。可以使用足以引發(fā)有效免疫應答的量的單一給藥。備選地，可以使用開始給藥復合體接著用單獨抗原或一種或多種復合體加強的其它方案。類似地，如果抗體滴度下降低于可接受水平，用復合體或抗原加強可以在遠晚于初始給藥的時刻發(fā)生。
本發(fā)明另一實施方案是因為VLP具有規(guī)則多價的和真正的螺旋結構，其比蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)游離亞基的聚集體更具免疫原性，可以容易地從編碼的核酸組裝。另外顆粒更大的穩(wěn)定性可以提供免疫原部分對免疫系統(tǒng)長時間持續(xù)暴露。
免疫原連接的病毒部分優(yōu)選位于VLP的外表面。因此當顆粒來源于PaPMV時，載體部分可以位于氨基或羧基末端，或者插入位于CP外表面上的內(nèi)環(huán)。這可導致與在CP另一位置上具有第二部分的顆粒的組裝相比改善的組裝，和可以增強顆粒表面上第二部分的免疫識別。
在本發(fā)明的一個實施方案中，使用植物病毒載體的肽疫苗開發(fā)允許在安全條件下大量生產(chǎn)疫苗。使用重組PapMV期望每kg新鮮感染葉多達1g的重組病毒。
在本發(fā)明的另一實施方案中，給藥200μg重組病毒，或免疫原-載體復合體，其相當于14μg肽，可足以免疫。1公頃的感染番木瓜于是可能可以潛在地足以接種5百萬患者。此外，培養(yǎng)植物是廉價的和有效的。農(nóng)業(yè)是最廉價的生產(chǎn)生物量的方法，因為它不需要復雜的裝備。
病毒或假病毒可以在宿主細胞中組裝以生產(chǎn)包含核酸和融合蛋白的感染性病毒顆粒。這可以使得用感染性病毒或假病毒顆粒感染相鄰細胞并在其中表達融合蛋白。
最初可以用顆粒形式(即組裝的含有核酸和蛋白質(zhì)的桿)或備選地核酸形式(即RNA如病毒RNA；cDNA或由cDNA制備的最終轉錄物)的病毒或假病毒感染宿主細胞，條件是用于初始感染的病毒核酸可以復制和導致具有嵌合蛋白質(zhì)的整個病毒顆粒的生產(chǎn)。
融合蛋白的第一(病毒)部分可以是來自包括其任何遺傳修飾型式(如缺失，插入，氨基酸替代等)的病毒源的任何蛋白質(zhì)、多肽或其部分。在某些實施方案中，第一部分來源于病毒外殼蛋白(或其遺傳修飾形式)。可以提及適于該目的的番木瓜花葉病毒的外殼蛋白。融合蛋白分子可以與其它融合蛋白分子或野生型外殼蛋白組裝成免疫原-載體病毒粒。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，顆粒來源于potyvirus或甚至更優(yōu)選馬鈴薯X病毒組如PapMV，在該實施方案中，第二部分優(yōu)選位于或鄰近外殼蛋白的C-末端。在PapMV中，外殼蛋白的C-末端在病毒粒的外面形成一個區(qū)域。
優(yōu)選地，將編碼免疫原部分的多核苷酸插入于或鄰近編碼病毒部分的多核苷酸的末端，以使在翻譯后，融合蛋白在一末端具有病毒部分和在相反末端具有免疫原部分。病毒部分不必包含整個病毒外殼蛋白，但這仍然是個備選選擇。
遺傳修飾以表達融合蛋白的病毒或假病毒形成本發(fā)明的另一實施方案，如任何宿主細胞感染該病毒或假病毒。
優(yōu)選地，用于復制病毒或假病毒的宿主細胞是細菌，其中病毒是植物病毒，盡管植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和細菌可以與在這些細胞中復制的病毒一起使用。該細胞優(yōu)選是細菌如大腸桿菌，盡管其它形式的細菌和其它細胞可能有用，如上述細胞。細胞可以是病毒的天然宿主細胞，從中衍生病毒樣顆粒，但這不是必需。
按照本發(fā)明的一個具體實施方案，將整個病毒樣顆粒用于動物接種的肽表位的穩(wěn)定和長時間持續(xù)展呈。
按照本發(fā)明的另一實施方案，PapMV和PapMV病毒樣顆粒似乎非常穩(wěn)定和可以容易地在室溫下保存。它們抵抗極高的溫度和不利條件，因為植物病毒已經(jīng)進化抵抗我們在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的非常困難的條件。當疫苗必須到達生活在貧窮國家、在難以接近的區(qū)域的人民時或?qū)τ谠\斷試驗長時間貯存，這是非常重要的優(yōu)勢。
備選地，此處所述的VLP可以單獨用作免疫增強劑或佐劑來增強人或動物中針對靶抗原的免疫應答。優(yōu)選佐劑或免疫增強VLP與針對其必須產(chǎn)生免疫應答的抗原共同施用。然而，佐劑VLP可以根據(jù)需要先于或接著向患者、人或動物給藥抗原而施用。
通過參考下列實施例將更容易理解本發(fā)明，提供這些實施例來舉例說明本發(fā)明而不是限制其范圍。
實施例I免疫原-載體VLP的制備通過將肽多聚化將提高選自本文所述淘選法的親和肽的親和力。多聚化將在番木瓜花葉病毒(PapMV)的表面上完成，該病毒是馬鈴薯X病毒組的成員。PapMV具有由CP亞基組裝組成的桿狀結構。一個病毒顆粒包含1200個亞基。我們將制備所選肽與PapMV CP的融合體。在體外組裝從大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達和純化的PapMV CP后將制備融合體來將肽暴露在PapMV顆粒的表面。病毒CP的組裝然后確保肽的多聚化并顯著地提高親和力。
克隆外殼蛋白(CP)并使用番木瓜花葉病毒(PapMV)(圖1)的外殼蛋白(CP)開發(fā)體外組裝系統(tǒng)。在大腸桿菌中大量生產(chǎn)PapMV的CP(圖2a)和在體外生產(chǎn)極類似于野生型病毒(wt virus)的PapMV病毒樣顆粒(圖2b)。首次顯示重組PapMV CP可以在體外組裝成病毒樣顆粒。通過體外組裝允許幾種肽融合至CP的C-末端和因為融合產(chǎn)生比野生型病毒更寬的病毒樣顆粒(圖3)。
實施例II免疫原-載體VLP的免疫增強作用經(jīng)常使用佐劑以便增加候選疫苗的免疫應答。炎性應答的增強有利于更多吞噬細胞向注射位點的遷移，其又導致改善的抗原呈遞細胞(APC)的抗原呈遞。明礬，乳狀液，微粒和細胞因子如GM-CSF已經(jīng)全部用于增加候選疫苗的免疫應答。證實PapMV其自身誘導炎癥事件，由此消除了對另外佐劑的需要。將氣囊模型用于檢驗PapMV是否在體內(nèi)誘導促炎事件。在該模型中，在第0天和第3天將無菌空氣注射到小鼠的背部之下。在第7天，可以將促炎劑注射到氣囊中并測量炎性應答。該模型緊密地表示皮下注射位點。
將PapMV注射到鼠氣囊中，與注射載體的小鼠(PBS)的0.8×106個白細胞相比導致約8.5×106個白細胞的累積(圖4)。在注射PapMV后6小時在氣囊中累積的嗜中性粒細胞(85％)和單核細胞(15％)。盡管低至1μg的PapMV的量足以誘導白細胞的累積，當注射100μg PapMV時出現(xiàn)最大累積。該累積類似于通過注射1μg強促炎因子LPS所誘導的累積。這些結果清楚地顯示PapMV可以有效誘導炎癥事件。該觀察清楚地顯示PapMV被免疫系統(tǒng)察覺，其誘導信號和涉及我們生物體防御的細胞的募集?？赡躊apMV通過自然免疫誘導信號。
此外，在本發(fā)明實施方案中顯示PapMV在小鼠中誘導強烈和長時間持續(xù)的體液應答(圖5)。用三種濃度的PapMV1，10和100αg注射10只小鼠。與免疫途徑無關，在用PapMV免疫的BALB/c小鼠中有效誘導初次抗體應答(圖5)。在免疫后第5天檢測到高滴度。觀察到初次IgM應答的典型曲線。第20天左右，即使用更多病毒加強免疫小鼠以后，缺乏IgM應答。免疫小鼠中的IgG應答遵循經(jīng)典動力學。在免疫后第12天檢測到高滴度的抗-PapMV，并且在用該病毒加強后按比例增加。IgG同種型分析顯示在Ab應答的初次和二次階段期間優(yōu)選生產(chǎn)IgG2b和IgG1。在ab應答的記憶階段期間IgG3增加滴度。這些數(shù)據(jù)顯示PapMV能夠在小鼠中誘導有效的Ab應答。有效誘導初次和再次應答以及持久的Ab記憶。優(yōu)選生產(chǎn)IgG1提示優(yōu)選釋放IL-4。IL-4有利于向該類IgG的類別轉換。因此在這些小鼠中可以設想對TH2應答的平衡。缺乏IgG2a顯示缺乏IFN-α的釋放，因為該細胞因子已經(jīng)直接參與向該IgG同種型的類別轉換。總之，這些數(shù)據(jù)顯示PapMV誘導有效和持久抗體應答的能力。該結果提示PapMV顆粒是開發(fā)體液疫苗的優(yōu)異載體。目的免疫原與VLP的融合體然后也將被免疫系統(tǒng)識別并引發(fā)對目的表位的強烈免疫應答。
此外，發(fā)現(xiàn)在腹膜內(nèi)或皮下注射到Balb/C小鼠以后PapMV VLP特異性地遷移至淋巴結和脾臟(圖6)。該結果顯示PapMV VLP是優(yōu)異的載體，因為它們有效地遷移至免疫應答出現(xiàn)的位點。
實驗數(shù)據(jù)顯示PapMV-抗原在小鼠中誘導有效抗體應答(圖5)。實際上，有效誘導初次和再次應答以及持久的抗體記憶(圖6)。幾種免疫途徑有效產(chǎn)生大量抗體。僅口服免疫不產(chǎn)生免疫應答?？赡苡糜谥泻臀杆岬腘aHCO3損害病毒顆粒和影響顆粒的免疫原性。即使在一次注射100μgPapMV 350天以后也存在IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3(圖6)。因為IgG2a和IgG3存在和持久，我們可以推斷PapMV誘導TH1應答。這提示PapMV顆粒是開發(fā)針對外源抗原的免疫體液應答的優(yōu)異載體。目標表位與PapMV-顆粒的融合應當幫助引發(fā)針對目標表位的體液免疫應答。
使用小鼠背部氣囊模型的實驗數(shù)據(jù)顯示PapMV增強炎性應答和有利于吞噬細胞向接種位點的遷移(圖6)。該結果證實PapMV其本身誘導炎癥事件，因此消除了對另外的旨在改善抗原呈遞細胞抗原呈遞的佐劑策略的需要。用含有由重組蛋白質(zhì)體外產(chǎn)生的特定肽融合體的病毒樣顆粒(VLP)獲得類似結果(圖6)。募集非常快，因為我們觀察到在處理后6-9小時之間細胞最多(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，PapMV-顆粒有效誘導對卵清蛋白的免疫應答，該蛋白質(zhì)已知是非免疫原性(圖7)。這通過腹膜內(nèi)途徑用2mg卵清蛋白，一種已知極弱的免疫原，或與50或100αg PapMV聯(lián)合注射小鼠(Balb/C)證實。我們每次處理注射6只小鼠并在注射后0，4，8，12和20天收集樣品。對每次治療僅進行一次注射。即使卵清蛋白是弱免疫原，在PapMV的存在下，我們檢測到強2倍的免疫應答。
這些觀察顯示PapMV-顆粒迅速地被哺乳動物的免疫系統(tǒng)察覺為外源，其又誘導信號和參與生物體防御的細胞的募集。
實施例III作為接種目標的丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(HCV)是導致急性和慢性肝病的正鏈RNA病毒。感染急性階段通常與溫和癥狀相關，但它可以導致肝硬化和肝細胞癌。全世界多于170百萬的人受感染，是HIV的4倍。在接下來數(shù)年中，由HCV相關疾病導致死亡的數(shù)量可能甚至超過由AIDS導致的死亡率。目前，當前對HCV的治療是不能令人滿意的。僅可提供的治療是干擾素(IFN)，但大多數(shù)HCV有抗性，因為干擾素誘導的蛋白激酶(PKR)被HCV E2蛋白抑制。
已知20％的HCV感染患者自然清除病毒。該發(fā)現(xiàn)提示如果它有效反應，免疫系統(tǒng)可以消除病毒。還提示如果我們用針對HCV的治療性疫苗加強它們的免疫系統(tǒng)，我們可以幫助慢性感染的患者，該疫苗可以通過產(chǎn)生針對病毒的中和抗體幫助清除病毒感染。
發(fā)現(xiàn)所選2個表位在HCV病毒粒的表面上。E1表位(氨基酸285-303)和E2表位(氨基酸512-536)，在已經(jīng)清除病毒感染的患者中顯示強免疫原性(David等，2001)。設計PapMV以在其C-末端包含HCV的E1和E2肽的融合，所述E1和E2可以在體外組裝成PapMV病毒樣顆粒(圖3)。
選擇3個表位，發(fā)現(xiàn)其位于病毒包膜糖蛋白保守區(qū)域中HVR-1外部E1和E2的HCV病毒粒表面上。E1表位(氨基酸285-303)和2個E2表位(氨基酸512-536和528-546)顯示在已經(jīng)清除病毒感染的患者中是強免疫原性的。此外，一個E2表位(512-536)顯示引發(fā)中和抗體的生產(chǎn)，該中和抗體發(fā)現(xiàn)在清除感染的患者的血清中。這三個區(qū)域是開發(fā)HCV疫苗的良好候選物，因為它們在HCV亞型和毒株中是保守的和位于包膜糖蛋白高變區(qū)之外。PapMV-E1和PapMV-E2的構建體在大腸桿菌中表達。純化重組蛋白質(zhì)和體外組裝。重組CP與HCV E2融合體的組裝產(chǎn)生類似于重組wt CP對照的rVLP，除了它們因為融合似乎稍微較大以外。
用體外生產(chǎn)的重組VLP免疫小鼠。使用多粘菌素柱去除LPS并且腹膜內(nèi)和皮下注射到小鼠中。我們使用1，10和100αg VLP，每次治療注射三只小鼠。通過ELISA分析對肽和對PapMV的免疫應答。觀察到IgG針對肽以及VLP的表面(圖8)。該結果顯示重組PapMV可以用于在表位表面引發(fā)優(yōu)異的免疫應答并且用作疫苗而無需佐劑幫助。
實施例IV針對傷寒的免疫傷寒是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、腸淋巴組織和膽囊的急性感染，其是由細菌傷寒沙門氏桿菌導致。它仍然是全世界的重大疾病，影響多于1600萬人，其中600,000感染死亡。感染大多數(shù)影響兒童和年輕人，并且可以通過接種預防。當前可獲得不同類型的疫苗1)熱失活的、酚保存的全細胞親代疫苗(Wyet-Ayers)，肌內(nèi)或皮下施用。2)丙酮失活的和干燥的全細胞親代疫苗。3)純化的(非變性的)Vi多糖親代疫苗(Aventis)，其通過注射到三角肌中施用。4)減毒gal E，Vi-陰性毒株Ty21a，用作活口服疫苗。
失活的親代疫苗(1-3類)可導致不希望有的免疫應答，因為脂多糖(LPS)的復雜性和存在抗原的數(shù)量，其引發(fā)不希望有的副作用。此外，Vi多糖是不依賴胸腺的抗原(Robins和Robins，1984)，其顯示在田間試驗(field trial)中具有良好功效，但也已知不足以誘導免疫記憶。需要對抗原的幾個暴露來保持保護，使得該方法僅適合于旅行者訪問的流行地。當前可提供的疫苗不適合于永久生活在污染區(qū)域的人們?；跍p毒細菌的疫苗(類型4)可以導致惡心，嘔吐和腹痛。還不推薦將該疫苗施用于患有免疫抑制、腸疾病、瘧疾、服用抗生素的患者和孕婦和小于6歲的兒童。該疫苗必須保存在4℃，因為它對熱敏感并且不能冷凍。當你想到達生活在熱帶氣候最受傷寒影響區(qū)域的窮國家的人群時，ty21A對不利條件的敏感性是有問題的。
傷寒沙門氏桿菌稱為膜孔蛋白的膜蛋白顯示是良好的免疫原，因為它在小鼠和人中引發(fā)抗體和細胞免疫應答并且能夠保護小鼠抗傷寒沙門氏桿菌。膜孔蛋白是革蘭氏陰性菌的膜上最豐富的蛋白質(zhì)，其用作低分子量分子的被動擴散通道。這些蛋白質(zhì)顯示高程度的結構和功能同源性，因此推測具有共同祖先。對應于傷寒沙門氏桿菌膜孔蛋白的環(huán)6和7的兩個小表位暴露于細菌表面，顯示涉及通過用膜孔蛋白免疫引發(fā)的保護性機制。那些區(qū)域?qū)τ趥抽T氏桿菌是特異性的和是開發(fā)重組亞單位疫苗的極好表位。我們已經(jīng)在PapMV CP的C-末端克隆了傷寒沙門氏桿菌膜孔蛋白的環(huán)6。純化重組蛋白質(zhì)并且如上所述用RNA體外生產(chǎn)PapMV病毒樣顆粒(圖3F)。
應當理解本發(fā)明不限于上述優(yōu)選實施方案，并且可能有修改，條件是它們在后附權利要求的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種具有免疫增強性能的免疫原-載體復合體，其由攜帶至少一種免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成，所示免疫原與所述VLP的蛋白質(zhì)或其片段融合。
2.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述免疫增強性能是以下各項中的至少一種佐劑作用、增強細胞介導的依賴性抗體生產(chǎn)或T-細胞依賴性抗體生產(chǎn)的能力、或增強巨噬細胞或其它抗原呈遞細胞上至少一種共刺激劑表達的能力。
3.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述免疫原選自由肽、蛋白質(zhì)、半抗原和過敏原組成的組。
4.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述免疫原是能夠在人或動物中誘導免疫應答的病毒、細菌、或寄生蟲蛋白質(zhì)或其片段。
5.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述免疫原與所述VLP的衣殼、coque或膜蛋白羧基或氨基末端融合。
6.權利要求1的免疫原-載體，其中所述VLP是病毒，病毒顆粒，病毒?；騺碓从诓《就鈿さ鞍捉M裝的顆粒。
7.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述VLP選自由植物馬鈴薯X病毒組組成的組。
8.權利要求7的免疫原-載體復合體，其中所述馬鈴薯X病毒組是番木瓜花葉病毒。
9.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述免疫原融合在所述VLP的外表面。
10.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述免疫原由一個或多個抗原結構域組成，每個抗原結構域引發(fā)特異的免疫應答。
11.權利要求1的免疫原-載體復合體，其中所述VLP攜帶具有多于一種特異性的免疫原。
12.一種在人或動物中免疫增強免疫應答的方法，其包含向所述人或動物施用免疫原-載體，其由攜帶至少一種免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成，所述免疫原與所述VLP的蛋白質(zhì)或其片段融合，或者與不與所述VLP直接連接的抗原共同施用VLP或其片段。
13.一種編碼由攜帶至少一種與蛋白質(zhì)融合的免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成的免疫原-載體復合體的多核苷酸，或者一種編碼由所述VLP其片段、或單獨VLP組成的免疫原-載體復合體的多核苷酸，當在植物細胞、動物細胞或微生物中表達時，所述免疫原-載體復合體具有被組裝的能力。
14.VLP或由攜帶至少一種與所述VLP的蛋白質(zhì)或其片段融合的免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成的免疫原-載體復合體在制備誘導針對所述蛋白質(zhì)或其片段的免疫應答的組合物中的應用。
15.一種免疫增強針對包含VLP或免疫原-載體復合體的抗原的免疫應答的組合物，所述免疫原-載體復合體由攜帶至少一種與所述VLP的蛋白質(zhì)或其片段融合的免疫原的病毒樣顆粒(VLP)組成。
16.一種包含VLP或其片段的免疫增強劑。
17.一種包含病毒樣顆粒(VLP)和來源于病毒、細菌或寄生蟲的蛋白質(zhì)或提取物的組合物。
18.按照權利要求17的組合物作為疫苗的應用。
19.番木瓜花葉病毒作為佐劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有免疫增強或佐劑性能的免疫原載體。更具體地，免疫原載體是來自馬鈴薯X病毒組家族、最具體地番木瓜花葉病毒的病毒樣顆粒(VLP)。重組技術生產(chǎn)的VLP與其自身蛋白質(zhì)之一蛋白質(zhì)免疫原融合。上述VLP和來自病毒、細菌或寄生病原體的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)提取物可以用作疫苗。
文檔編號C07K14/08GK1665528SQ03815935
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月30日 優(yōu)先權日2002年7月5日
發(fā)明者德尼·勒克萊爾, 納塔莉·馬杰奧, 菲利普·泰西耶, 康斯坦丁諾·三氏·羅伯托·洛佩斯－馬西亞斯 申請人:德尼·勒克萊爾