本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，具體而言，涉及一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的過程中，牛血清是培養(yǎng)基的主要成分。由于牛血清中常常含有牛血清白蛋白，因此對疫苗中殘留的牛血清白蛋白(BSA)的檢測是非常重要的，它直接關(guān)系到生物制品使用的安全性。但目前的檢測方法都需要高昂的儀器，同時檢測步驟繁瑣、費時、檢測條件苛刻，且檢測時所使用試劑的毒性較大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針，這種檢測探針結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、容易保藏。采用這種牛血清白蛋白檢測探針檢測BSA時，操作簡單、檢測迅速且靈敏度高，能夠?qū)悠分泻芪⒘康腂SA進行有效檢測，且這種牛血清白蛋白檢測探針利用了玻璃毛細(xì)管的虹吸作用，能夠?qū)ξ⒘康呐Ｑ灏椎鞍讓崿F(xiàn)快速的可視化分析。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的牛血清白蛋白檢測探針的制備方法，這種制備方法步驟簡單、反應(yīng)條件溫和、容易實現(xiàn)，適合工業(yè)大生產(chǎn)。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針的應(yīng)用，即用該牛血清白蛋白檢測探針來檢測待測樣品中牛血清白蛋白的含量。檢測BSA時操作簡單、檢測迅速且靈敏度高，能夠?qū)悠分泻芪⒘康腂SA進行有效檢測。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種基于玻璃毛細(xì)管(glass capillary，GC)的牛血清白蛋白檢測探針的制備方法，其包括：

活化步驟：將玻璃毛細(xì)管與氨水溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min,隨后將玻璃毛細(xì)管取出后再與過氧化氫溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min，然后再用有機溶劑洗滌玻璃毛細(xì)管，得到活化后的玻璃毛細(xì)管(OH-GC)；

修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與活化后的玻璃毛細(xì)管混合，并于20-30℃下攪拌18-24h，然后再用有機溶劑洗滌玻璃毛細(xì)管，得到氨基修飾的玻璃毛細(xì)管(NH₂-GC)；

鍵合步驟：將牛血清白蛋白與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合，于20-30℃下攪拌1-3h；隨后與氨基修飾的玻璃毛細(xì)管混合，于20-30℃下攪拌4-6h，洗滌，得到牛血清白蛋白檢測探針(BSA-GC)。

一種根據(jù)上述制備方法制得的基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針。

一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針的應(yīng)用，其包括：

步驟a：用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗牛血清白蛋白(aBSA)，得到辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體(HRP-aBSA)；

步驟b：將待測樣品與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體混合，震蕩反應(yīng)4-8min；隨后，再與牛血清白蛋白檢測探針混合，震蕩反應(yīng)4-8min，洗滌，得到結(jié)合辣根過氧化物酶的牛血清白蛋白檢測探針(HRP-aBSA-BSA-GC)；

步驟c：在結(jié)合辣根過氧化物酶的牛血清白蛋白檢測探針中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，靜置12-18min進行顯色，隨后加入H₂SO₄終止顯色，于445-455nm處檢測吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中牛血清白蛋白的含量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

在該牛血清白蛋白檢測探針的制備方法中，先采用廉價的氨水溶液和過氧化氫溶液使GC表面的羥基處于活化狀態(tài)，隨后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在活化后的GC表面修飾上氨基，得到NH₂-GC；再然后將BSA鍵合到NH₂-GC上，得到BSA-GC。這種制備方法簡單、反應(yīng)條件溫和，容易實現(xiàn)，適合工業(yè)大生產(chǎn)。

用牛血清白蛋白檢測探針來檢測樣品中的BSA的原理是：

在待測樣品中加入相對BSA過量的HRP-aBSA后，一部分的HRP-aBSA與待測樣品中的BSA進行特異性結(jié)合，形成HRP-aBSA-BSA復(fù)合物，另一部分的HRP-aBSA游離在待測樣品液中；隨后，在待測樣品中加入BSA-GC，BSA-GC與待測樣品液中游離的那部分HRP-aBSA進行特異性結(jié)合，形成HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物；洗滌后，在所得到的HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物中加入TMB。TMB為HRP的底物，在與HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物作用后形成的產(chǎn)物呈藍(lán)色，隨后用H₂SO₄終止反應(yīng)后，TMB的產(chǎn)物由藍(lán)色變?yōu)辄S色。采用比色法測反應(yīng)液在445-455nm處的吸光度，將其數(shù)值帶入由系列標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液采用同樣檢測方法所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可得出待測樣品中BSA的含量。

上述標(biāo)準(zhǔn)曲線為反比例曲線，即當(dāng)待測樣品中的BSA濃度越低，游離的HRP-aBSA的量就越多，用比色法所測得的吸光度值也就越高，由此可見，該吸光度值與待測樣品中的BSA濃度呈反比。

該檢測方法利用了抗原(即BSA)與抗體(即aBSA)的特異性結(jié)合反應(yīng)，特異性強；同時利用HRP來標(biāo)記抗體，實現(xiàn)特異性的可視化檢測，靈敏度高；且在一定的范圍內(nèi)，對待測樣品中是否含有BSA能夠?qū)崿F(xiàn)快速的肉眼可見的可視化分析。

該牛血清白蛋白檢測探針的穩(wěn)定性強，在利用該牛血清白蛋白檢測探針檢測待測樣品中的BSA時，操作過程簡單、迅速，所需要的儀器設(shè)備僅為紫外分光光度計，檢測成本低，簡單易行。該方法的適用廣泛、實用性強，可快速檢測疫苗等生物樣品中BSA的含量。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為BSA-GC的合成路線圖；

圖2為利用BSA-GC檢測待測樣品的BSA的步驟圖；

圖3為實驗例1中的線性擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本實施方式提供了一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針的制備方法，其包括：

(1)活化步驟：將GC與氨水溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min,隨后將玻璃毛細(xì)管取出后再與過氧化氫溶液混合，并于65-90℃下浸泡7-15min，然后再用有機溶劑洗滌玻璃毛細(xì)管，得到OH-GC；

普通的GC表面覆蓋有有機物和金屬離子，如果這些成分不除去，GC表面的羥基則處于鈍化狀態(tài)，難以進一步進行后續(xù)的反應(yīng)。因此，采用氨水和過氧化氫對GC進行浸泡處理，能夠使GC表面的羥基處于活化狀態(tài)，有利于后續(xù)的修飾步驟順利進行。

發(fā)明人經(jīng)過多次試驗探索，得出上述浸泡的條件為：65-90℃下浸泡7-15min。在這種條件下，GC表面的羥基的活化效率高，其中，活化效率以75℃下浸泡10min最佳。

在本發(fā)明較佳的實施例中，上述氨水溶液中氨水與水的體積比為1：3-5。此處，氨水為NH₃·H₂O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26％的市售分析級氨水。采用氨水與水的體積比為1：3-5的氨水溶液，優(yōu)選為1：4，能夠快速除去GC表面的有機物和金屬離子，為GC表面羥基的活化掃清障礙。

在本發(fā)明較佳的實施例中，上述過氧化氫溶液中過氧化氫與水的體積比為1：1-3。此處，過氧化氫為H₂O₂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的市售分析級過氧化氫。采用過氧化氫與水的體積比為1：1-3的過氧化氫溶液，優(yōu)選為1：2，有利于GC表面的OH快速活化，且使得活化更加完全。

(2)修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與OH-GC混合，并于20-30℃下攪拌18-24h，然后再用有機溶劑洗滌玻璃毛細(xì)管，得到NH₂-GC；

使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷與OH-GC反應(yīng)，在GC-OH中的-OH上通過化學(xué)反應(yīng)共價鍵合上NH₂，得到NH₂-GC，便于后期鍵合BSA。為了使反應(yīng)進行的更加充分，采用甲苯為溶劑，有利于反應(yīng)的順利進行。

在本發(fā)明較佳的實施例中，為了在OH-GC表面鍵合較多數(shù)量的氨基，上述3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTEMS)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-5％，優(yōu)選為3％。GC表面鍵合的氨基的數(shù)量越多，GC表面最終鍵合的BSA的量就會越多，能夠大幅提高檢測的靈敏度。

在本發(fā)明較佳的實施例中，上述有機溶劑選自丙酮、四氫呋喃和甲苯中的一種或多種。采用有機溶劑洗滌，有利于除去玻璃表面的其它雜質(zhì)，使GC露出疏水表面，方便下一步鍵合氨基。進一步優(yōu)選的，在活化步驟和修飾的步驟中，上述洗滌的過程為將玻璃毛細(xì)管依次用丙酮、四氫呋喃、以及甲苯各洗滌2-5次。在本發(fā)明中，洗滌是指GC的內(nèi)表面和外表面均被清洗的過程，采用浸泡的方法清洗GC的外表面，利用GC的毛細(xì)管現(xiàn)象將溶劑吸到GC的管腔中，來實現(xiàn)對GC的內(nèi)表面的清洗。采用這種洗滌方式，洗滌效果好，有利于GC-OH與APTEMS的順利反應(yīng)。

(3)鍵合步驟：將牛血清白蛋白與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺混合(NHS)，于20-30℃下攪拌1-3h；隨后與NH₂-GC混合，于20-30℃下攪拌4-6h，洗滌，得到BSA-GC。

EDC和NHS均為羧基活化試劑，將BSA與EDC和NHS混合，使BSA中的羧基活化，進一步與NH₂-GC中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，得到BSA-NH₂-GC復(fù)合物，即為牛血清白蛋白檢測探針，簡稱BSA-GC。

為了使BSA中的羧基完全活化，提高BSA與NH₂-GC的鍵合速率，在本發(fā)明較佳的實施例中，上述EDC與BSA的質(zhì)量比為1：8-12。優(yōu)選為，EDC與BSA的質(zhì)量比為1：10。進一步的，上述NHS與BSA的質(zhì)量比為1：8-12。優(yōu)選為，NHS與BSA的質(zhì)量比為1：10。

為了避免在BSA-GC表面的BSA結(jié)構(gòu)被有機溶劑破壞，在鍵合步驟中洗滌的溶劑為乙醇和/或水。優(yōu)選的洗滌方法為，采用乙醇和水交替洗滌，每種溶劑洗滌3次。采用這種洗滌方法，能夠相對徹底的洗去物理附著在BSA-GC表面的BSA，從而提高該探針在應(yīng)用時的靈敏度和準(zhǔn)確度。

本實施方式還提供一種由上述制備方法制得的基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針。這種探針利用了玻璃毛細(xì)管的虹吸原理，在一定濃度范圍內(nèi)能夠?qū)εＱ灏椎鞍讓崿F(xiàn)可視化分析；且這種探針是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合作用，特異性好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

本實施方式還提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針的應(yīng)用，其包括：

步驟a：用HRP標(biāo)記aBSA，得到HRP-aBSA。

HRP能夠?qū)⑵涞孜颰MB水解成有顏色的產(chǎn)物，用HRP標(biāo)記aBSA，便于采用比色法檢測aBSA，進而對待測樣品中微量的BSA進行分析。

步驟b：將待測樣品與HRP-aBSA混合，震蕩反應(yīng)4-8min；隨后，再與BSA-GC混合，震蕩反應(yīng)4-8min，洗滌，得到HRP-aBSA-BSA-GC。

aBSA與BSA之間的鍵合，是基于抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)，反應(yīng)速度快、特異性強。因此，得到的HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物中，各個基團之間都是通過共價鍵連接的，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

在本發(fā)明較佳的實施例中，上述方法中，震蕩反應(yīng)應(yīng)理解為：反應(yīng)容器位于震蕩反應(yīng)器上，反應(yīng)時的震蕩反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為500-1500rpm。

步驟c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，靜置12-18min進行顯色，隨后加入H₂SO₄終止顯色，于445-455nm處檢測吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中牛血清白蛋白的含量。

在本發(fā)明較佳的實施例中，上述步驟c為在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，靜置15min進行顯色，隨后加入H₂SO₄終止顯色，于450nm處檢測吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中牛血清白蛋白的含量。

用牛血清白蛋白檢測探針來檢測樣品中的BSA的原理是：

在待測樣品中加入相對BSA過量的HRP-aBSA后，一部分的HRP-aBSA與待測樣品中的BSA進行特異性結(jié)合，另一部分的HRP-aBSA游離在待測樣品液中；隨后，在待測樣品中加入BSA-GC，BSA-GC與待測樣品液中游離的那部分HRP-aBSA進行特異性結(jié)合，形成HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物；洗滌后，在所得到的HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物中加入TMB。TMB為HRP的底物，在與HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物作用后形成的產(chǎn)物呈藍(lán)色，隨后用H₂SO₄終止反應(yīng)后，TMB的產(chǎn)物由藍(lán)色變?yōu)辄S色。采用比色法測反應(yīng)液在445-455nm處的吸光度，將其數(shù)值帶入由系列標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液采用同樣檢測方法所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可得出待測樣品中BSA的含量。

上述標(biāo)準(zhǔn)曲線為反比例曲線，即當(dāng)待測樣品中的BSA濃度越低，游離的HRP-aBSA的量就越多，用比色法所測得的吸光度值也就越高，由此可見，該吸光度值與待測樣品中的BSA濃度呈反比。

進一步的，所檢測的待測樣品為疫苗。在培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的過程中，牛血清是培養(yǎng)基的主要成分，因此生產(chǎn)得到的疫苗中極易含有殘留的BSA。若BSA的含量超標(biāo)，則說明疫苗的質(zhì)量不合格，殘留的BSA直接關(guān)系到疫苗使用的安全性。采用本發(fā)明提供的這種探針能夠快速、有效的檢測出疫苗中的BSA含量是否超標(biāo)，從而有效的控制疫苗質(zhì)量。

實施例1

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針，這種牛血清白蛋白檢測探針的合成路線如圖1所示，其制備方法如下：

(1)活化步驟：將GC與氨水溶液混合，并于65℃下浸泡15min,隨后將GC取出后再與過氧化氫溶液混合，并于65℃下浸泡15min，然后再用丙酮洗滌GC，得到OH-GC；

(2)修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與OH-GC混合，并于30℃下攪拌18h，然后再用四氫呋喃洗滌GC，得到NH₂-GC；

(3)鍵合步驟：將BSA與EDC和NHS混合，于20℃下攪拌1h；隨后與NH₂-GC混合，于30℃下攪拌4h，洗滌，得到BSA-GC。

實施例2

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針，這種牛血清白蛋白檢測探針的制備方法為：

(1)活化步驟：將GC與氨水溶液混合，并于75℃下浸泡10min,隨后將GC取出后再與過氧化氫溶液混合，并于75℃下浸泡10min，然后再用丙酮和四氫呋喃依次洗滌GC，得到OH-GC；

(2)修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與OH-GC混合，并于25℃下攪拌20h，然后再用丙酮、四氫呋喃和甲苯依次洗滌GC，得到NH₂-GC；

(3)鍵合步驟：將BSA與EDC和NHS混合，于25℃下攪拌2h；隨后與NH₂-GC混合，于25℃下攪拌5h，洗滌，得到BSA-GC。

實施例3

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針，這種牛血清白蛋白檢測探針的制備方法為：

(1)活化步驟：將GC與氨水溶液混合，并于90℃下浸泡7min,隨后將GC取出后再與過氧化氫溶液混合，并于90℃下浸泡7min，然后再用四氫呋喃洗滌GC，得到OH-GC；

(2)修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與OH-GC混合，并于20℃下攪拌24h，然后再用四氫呋喃和甲苯依次洗滌GC，得到NH₂-GC；

(3)鍵合步驟：將BSA與EDC和NHS混合，于20℃下攪拌3h；隨后與NH₂-GC混合，于20℃下攪拌6h，洗滌，得到BSA-GC。

實施例4

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針，其制備方法與實施例2基本一致，不同之處在于：

(1)活化步驟：將GC與氨水溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中氨水溶液中氨水與水的體積比為1：3；隨后將GC取出后再與過氧化氫溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中過氧化氫溶液中過氧化氫與水的體積比為1：3；然后將GC依次用丙酮、四氫呋喃、以及甲苯各洗滌2次，得到OH-GC；

(2)修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與OH-GC混合，并于25℃下攪拌20h，然后然后將GC依次用丙酮、四氫呋喃、以及甲苯各洗滌5次，得到NH₂-GC。

實施例5

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針，其制備方法與實施例2基本一致，不同之處在于：

(1)活化步驟：將GC與氨水溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中氨水溶液中氨水與水的體積比為1：4；隨后將GC取出后再與過氧化氫溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中過氧化氫溶液中過氧化氫與水的體積比為1：2；然后將GC依次用丙酮、四氫呋喃、以及甲苯各洗滌3次，得到OH-GC；

(2)修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％。隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與OH-GC混合，并于25℃下攪拌20h，然后然后將GC依次用丙酮、四氫呋喃、以及甲苯各洗滌4次，得到NH₂-GC。

實施例6

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針，其制備方法與實施例2基本一致，不同之處在于：

(1)活化步驟：將GC與氨水溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中氨水溶液中氨水與水的體積比為1：5；隨后將GC取出后再與過氧化氫溶液混合并于75℃下浸泡10min，其中過氧化氫溶液中過氧化氫與水的體積比為1：1；然后將GC依次用丙酮、四氫呋喃、以及甲苯各洗滌5次，得到OH-GC；

(2)修飾步驟：以甲苯為溶劑配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，其中3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨基丙基三乙氧基硅烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％。隨后將3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液與OH-GC混合，并于25℃下攪拌20h，然后然后將GC依次用丙酮、四氫呋喃、以及甲苯各洗滌2次，得到NH₂-GC。

實施例7

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針的應(yīng)用，即將上述實施例1-6制備的BSA-GC應(yīng)用于檢測待測樣品中的BSA，其包括下述：

步驟a：用HRP標(biāo)記羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；

步驟b：將待測樣品與HRP-aBSA混合，震蕩反應(yīng)4min；隨后，再與BSA-GC混合，震蕩反應(yīng)4min，洗滌，得到HRP-aBSA-BSA-GC；

步驟c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，靜置18min進行顯色，隨后加入H₂SO₄終止顯色，于445nm處檢測吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中BSA的含量。

實施例8

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針的應(yīng)用，即將上述實施例1-6制備的BSA-GC應(yīng)用于檢測待測樣品中的BSA，其包括下述：

步驟a：用HRP標(biāo)記羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；

步驟b：將待測樣品與HRP-aBSA混合，震蕩反應(yīng)6min；隨后，再與BSA-GC混合，震蕩反應(yīng)6min，洗滌，得到HRP-aBSA-BSA-GC；

步驟c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，靜置15min進行顯色，隨后加入H₂SO₄終止顯色，于450nm處檢測吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中BSA的含量。

實施例9

本實施例提供一種基于玻璃毛細(xì)管的牛血清白蛋白檢測探針的應(yīng)用，即將上述實施例1-6制備的BSA-GC應(yīng)用于檢測待測樣品中的BSA，其包括下述：

步驟a：用HRP標(biāo)記羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；

步驟b：將待測樣品與HRP-aBSA混合，震蕩反應(yīng)8min；隨后，再與BSA-GC混合，震蕩反應(yīng)8min，洗滌，得到HRP-aBSA-BSA-GC；

步驟c：在HRP-aBSA-BSA-GC中加入TMB溶液，靜置12min進行顯色，隨后加入H₂SO₄終止顯色，于455nm處檢測吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中BSA的含量。

實驗例1

本實驗例用上述制備的牛血清白蛋白檢測探針來對狂犬疫苗中BSA含量進行檢測。

一.HRP-aBSA的制備：

(1)取HRP 10mg溶于1mL 1.25％戊二醛溶液中，在室溫下靜置過夜。隨后將反應(yīng)后的酶液過Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫，收集棕色液體并濃縮至1mL。

(2)將0.5mL 10mg/mL的aBSA與0.5mL生理鹽水混合，并加入0.1mL、1M的碳酸鹽緩沖溶液(pH9.5)，混勻。隨后逐滴加入上述收集的棕色液體，于室溫下攪拌3h。

(3)將0.1mL、0.2M的賴氨酸加入上述溶液中，室溫下放置3h。隨后加入等體積的飽和硫酸銨，40℃下靜置1h。隨后，于3000rpm下離心30min，棄去上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌兩次，最后溶于2mL、0.01M的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)中。

(4)將上述溶液裝入透析膜中，0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析24h，濃縮至2mL，即得HRP-aBSA。

二、檢測狂犬疫苗中BSA的含量：

如圖2所述，檢測步驟包括：

(1)配制下列濃度的BSA的標(biāo)準(zhǔn)溶液：10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、70ng/mL、90ng/mL。本實驗中的待測樣品為四種購自勃林格殷格翰集團的狂犬疫苗。共有10個實驗組，其中四組為狂犬疫苗；6組為BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時進行下述平行實驗。

(2)取2mL的樣品溶液，向其中加入1mL的HRP-aBSA，此HRP-aBSA是由上述制得的HRP-aBSA稀釋1000倍而得，再混勻，振蕩5min，使樣品中的BSA充分與HRP-aBSA結(jié)合。

(3)將實施例3制得的BSA-GC分散于上述溶液中，振搖5min，使溶液中游離的HRP-aBSA充分結(jié)合到BSA-GC納米粒子上。

(4)將所得到的HRP-aBSA-BSA-GC復(fù)合物與溶液分離，并洗滌。隨后加入2mL TMB溶液靜置15min顯色，溶液呈藍(lán)色，然后加入2mL的1.25mol/L的H2SO4終止顯色，溶液呈黃色。然后將上述液體采用比色法進行分析，測量其在450nm處的吸光度。

(5)由BSA的標(biāo)準(zhǔn)溶液(10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、70ng/mL、90ng/mL)測得的吸光度值與其BSA濃度做線性模擬，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；再將由四種狂犬疫苗所測得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出每種狂犬疫苗中BSA的含量。

結(jié)果分析：

由BSA的標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的吸光度值與其BSA濃度做線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝-0.007X+0.812(r²＝0.999)，如圖3所示。

將四種狂犬疫苗的實驗組在450nm處測得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式：Y＝-0.007X+0.812(r²＝0.999)中，即可測出狂犬疫苗中BSA的含量，結(jié)果如表1所示，采用其它實施例的探針的檢測結(jié)果與實施例3一致，故沒有逐一列出。

表1.狂犬疫苗中BSA含量的檢測

由表1可知，這四種狂犬疫苗中的BSA的濃度均小于15ng/mL。WHO規(guī)定的疫苗中的BSA的含量不超過50ng/mL。由此可知，這四種狂犬疫苗中的BSA均符合WHO的標(biāo)準(zhǔn)，由此說明該方法能夠快速有效的對疫苗中BSA的含量進行檢測。

實驗例2

本實驗例采用加樣回收法，來測試采用本發(fā)明提供的牛血清白蛋白檢測探針來檢測BSA的這種檢測方法的準(zhǔn)確度。

本實驗例中采用的牛血清白蛋白檢測探針及其檢測方法與實驗例1一致。待測樣品為狂犬疫苗加樣溶液，即在狂犬疫苗中添加不同濃度的BSA蛋白(分別為6.5ng/mL、8.1ng/mL、97ng/mL)。然后按實施例1中的步驟進行分析，結(jié)果如表2所示：

表2加樣回收法檢測結(jié)果

表2中，疫苗中原有的BSA，為采用實驗例1的方法重復(fù)檢測三次的結(jié)果。

回收率＝檢測到的BSA/(疫苗中原有的BSA+添加的BSA)×100％

由表2可以看出，采用該方法檢測BSA的回收率均大于94％，說明該檢測方法的準(zhǔn)確度高，能夠?qū)悠分械腂SA進行準(zhǔn)確的測定。

實驗例3

本實驗例通過配制一系列不同濃度的BSA的待測溶液，其中BSA的濃度分別為0.25ng/mL、0.5ng/mL、0.75ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL。采用實驗例1中的方法對各待測溶液中的BSA的濃度進行測量，確定本發(fā)明提供的牛血清白蛋白檢測探針來檢測BSA的這種檢測方法的最低檢測限，并與文獻中記載的現(xiàn)有技術(shù)的最低檢測限進行比較，如表3所示：

表3本發(fā)明檢測BSA的方法與現(xiàn)有技術(shù)的比較

由表3可知，相比于現(xiàn)有技術(shù)中BSA的檢測方法，本發(fā)明提供的方法的檢測限低、操作簡單、特異性高，且所使用的材料容易合成、檢測成本低廉。

綜上所述，在該牛血清白蛋白檢測探針的制備方法中，先采用廉價的氨水溶液和過氧化氫溶液使GC表面的羥基處于活化狀態(tài)，隨后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在活化后的GC表面修飾上氨基，得到NH₂-GC；再然后將BSA鍵合到NH₂-GC上，得到BSA-GC。這種制備方法簡單、反應(yīng)條件溫和，容易實現(xiàn)，適合工業(yè)大生產(chǎn)。

該檢測方法利用了抗原(即BSA)與抗體(即aBSA)的特異性結(jié)合反應(yīng)，特異性強，同時利用HRP來標(biāo)記抗體，實現(xiàn)特異性的可視化檢測，特異性強，靈敏度高。由于牛血清白蛋白檢測探針為白色的，在一定的范圍內(nèi)，對待測樣品中是否含有BSA能夠?qū)崿F(xiàn)快速的肉眼可見的可視化分析。

該牛血清白蛋白檢測探針的穩(wěn)定性強，在利用該牛血清白蛋白檢測探針檢測待測樣品中的BSA時，操作過程簡單、迅速，所需要的儀器設(shè)備僅為紫外分光光度計，檢測成本低，簡單易行。該方法的適用廣泛、使用性強，可快速檢測疫苗等生物樣品中BSA的含量。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。