本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料的制備及其臨床應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由于外傷、感染、腫瘤切除或先天性缺陷原因等造成的體表組織器官凹陷畸形，除了影響容貌之外，還會(huì)不同程度的影響患者的心理健康及社會(huì)交際活動(dòng)。自體脂肪移植填充是目前治療體表軟組織凹陷或輪廓不對(duì)稱的主要方法之一。其主要缺點(diǎn)是移植后容易吸收，吸收率占20％～90％不等，大多需要接受反復(fù)數(shù)次注射才能達(dá)到較為滿意的效果，因此如何減少脂肪移植后的吸收率，提高成活率已成為近年的研究熱點(diǎn)。

脂肪細(xì)胞在移植早期缺乏有效血供，在移植物的血供充分建立之前，移植的脂肪組織的主要營養(yǎng)來源于周圍組織液的滲透，而中央部分的脂肪組織往往因與周圍組織的距離較大，缺血缺氧時(shí)間過長，更容易發(fā)生壞死、液化。巴西carpaned醫(yī)師于1993年就提出“邊緣地帶”的概念并觀察到約有40％組織存活于距離移植物邊緣約1.5±0.5mm之以內(nèi)的邊緣地帶，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)移植物中央?yún)^(qū)纖維化較邊緣區(qū)多，脂肪細(xì)胞體積較小，說明移植物的吸收大部分發(fā)生在中央?yún)^(qū)域，因此改善移植物中央?yún)^(qū)早期的營養(yǎng)狀態(tài)，促進(jìn)血供建立至關(guān)重要[carpanedaca,ribeiromt.studyofthehistologicalterationsandviabilityoftheadiposegraftinhumans.aestheticplastsurg,1993,17(1):43-47.doik,ogataf,etoh,katoh,kunos,kinoshitak,kanayamak,fengj,manabei,yoshimurak.differentialcontributionsofgraft-derivedandhost-derivedcellsintissueregeneration/remodelingafterfatgrafting.plastreconstrsurg,2015,135(6):1607-1617.]。

自2001年zuk等首次從脂肪組織中分離、提取出脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells，ascs)并命名以來，ascs因來源廣泛、取材方便、組織損傷小、擴(kuò)增迅速等優(yōu)點(diǎn)已成為細(xì)胞治療和組織工程應(yīng)用中的理想工具。大量研究表明，ascs在體內(nèi)損傷修復(fù)、抗衰老等方面均可發(fā)揮較為顯著的作用；其生物學(xué)作用的實(shí)現(xiàn)一部分通過多向分化能力，ascs可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)等多種細(xì)胞，補(bǔ)充替代老化、缺損的組織細(xì)胞；另一部分通過旁分泌功能，ascs可分泌多種細(xì)胞因子、多肽類等活性成分，提高受損細(xì)胞的生命力和抗凋亡能力。ascs來源豐富，可分化為多種譜系，可分泌多種細(xì)胞因子，并具有免疫調(diào)節(jié)作用，其在組織再生領(lǐng)域中的突出表現(xiàn)使其具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。[zukpa,zhum,mizunoh,huangj,futrelljw,katzaj,benhaimp,lorenzhp,hedrickmh.multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies.tissueeng,2001,7(2):211-28.uzbasf,mayid,parisiam,thompsonsk,kayaa,perkinsad,memilie.molecularphysiognomiesandapplicationsofadipose-derivedstemcells.stemcellrev,2015,11(2):298-308.]

自2005年以來，我們的研究團(tuán)隊(duì)以人類不同解剖部位的皮下脂肪為組織來源，建立了自己的一整套實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)及方法，進(jìn)一步優(yōu)化ascs分離培養(yǎng)方案，并對(duì)其進(jìn)行多潛能分化表型鑒定，通過在細(xì)胞體外培養(yǎng)或體內(nèi)移植過程中添加人參皂苷rg1或自體prp/prf等成分，觀察及評(píng)價(jià)細(xì)胞表型及其它生物學(xué)行為的變化情況，同時(shí)評(píng)價(jià)這些成分對(duì)脂肪干細(xì)胞生長增殖、多向分化、旁分泌功能及特定組織構(gòu)建的影響，取得了可喜的研究成果，為脂肪干細(xì)胞應(yīng)用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)研究及在臨床上促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生、器官重建及細(xì)胞治療提供理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于提供一種富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料的制備及其臨床應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

1.一種富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料的制備，制備方法包括以下步驟：

1)脂肪顆粒團(tuán)的獲取與純化

選取大腿上段內(nèi)外側(cè)或下腹部為供區(qū)，用手持20ml針筒預(yù)留空氣法低負(fù)壓抽取，根據(jù)患者情況，選定脂肪供區(qū)位置后，局部腫脹液浸潤麻醉，采用自行設(shè)計(jì)的多孔專用吸脂針進(jìn)行抽吸，抽吸時(shí)由深層向淺層抽吸，扇形反復(fù)抽吸；將抽吸出來的脂肪顆粒，采用生理鹽水沖洗備用；采取低速離心方法獲取并純化脂肪顆粒團(tuán)，離心轉(zhuǎn)速600rpm/min，離心時(shí)間2min，操作過程全程遵循無菌密閉操作原則，盡量減少脂肪組織與空氣的接觸時(shí)間。如圖1所示。

2)納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞的獲取

將一部分脂肪顆粒團(tuán)經(jīng)機(jī)械搗碎乳化法制備富含脂肪干細(xì)胞的納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞，將步驟1)初步處理后的顆粒脂肪經(jīng)孔徑0.5mm的濾網(wǎng)過濾，隨后將顆粒脂肪經(jīng)2個(gè)20ml注射針筒連接納米脂肪專用乳化器快速對(duì)打30次，機(jī)械乳化，用0.5mm孔徑的濾網(wǎng)再次過濾，最后經(jīng)轉(zhuǎn)速為8000rpm/min，離心時(shí)間為5min高速離心去除油脂后得到的脂肪乳化液即為納米脂肪如圖1所示，這部分乳化后的納米脂肪攜帶有較多的基質(zhì)血管成分和脂肪干細(xì)胞，有利于增加基質(zhì)血管成分與脂肪細(xì)胞的接觸面，提高脂肪移植物的成活率，將機(jī)械乳化顆粒脂肪分離培養(yǎng)并傳代后獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞稱為納米脂肪來源干細(xì)胞。

3)納米脂肪來源干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化鑒定

經(jīng)步驟2)機(jī)械乳化后的納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞含有較多的基質(zhì)血管成分，培養(yǎng)24h后開始有少量成纖維細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞散在貼壁，大部分未貼壁細(xì)胞為球形或圓形的雜細(xì)胞。24-48h后首次換液去除未貼壁細(xì)胞后，大部分貼壁細(xì)胞呈寬大扁平的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，這些貼壁細(xì)胞呈集落狀生長，集落大小不一；集落中細(xì)胞形態(tài)為典型的梭形細(xì)胞。約7-10d可達(dá)80％～90％致密層單層。傳代后細(xì)胞形態(tài)主要為梭形，如圖2的a、b、c所示。傳代后細(xì)胞生長速度較原代細(xì)胞明顯增快，如果按1：3傳代，2-3d即可長滿。連續(xù)傳代培養(yǎng)10代細(xì)胞未出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象。傳代后細(xì)胞突起明顯，呈梭形或多角形，生長較快，經(jīng)檢測細(xì)胞倍增時(shí)間平均約為40h，各代細(xì)胞形態(tài)與傳統(tǒng)膠原酶消化法獲取的脂肪干細(xì)胞相似。第3代細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)14d，可見細(xì)胞內(nèi)有透亮的脂滴形成，油紅o染色可見脂滴被染成鮮紅色如圖2的d、e所示。成骨誘導(dǎo)21d后，可見典型的礦化鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色吳鮮紅色如圖2的f、g所示；成軟骨誘導(dǎo)14d后，可見高度聚集樣生長的細(xì)胞團(tuán)，呈斑片狀或結(jié)節(jié)狀，周圍細(xì)胞呈放射狀；結(jié)節(jié)較大，肉眼可見；阿利辛藍(lán)染色提示結(jié)節(jié)及周邊聚集的細(xì)胞呈藍(lán)色如圖2的h、i所示。第3代納米脂肪來源干細(xì)胞流式細(xì)胞分析顯示cd29、cd44、cd49d、cd54、cd90和cd105呈陽性，而cd34、cd45和cd106呈陰性，如圖5所示。

4)富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠的獲取

抽取同一個(gè)體的適量靜脈血，置于的無菌負(fù)壓采血管內(nèi)，采用choukroun’s法離心轉(zhuǎn)速為2700rpm/min、離心時(shí)間為12min一次高速離心提取富含細(xì)胞因子的凝膠狀物質(zhì)。即刻用20ml無菌注射器采集患者靜脈血液20-40ml，并密封蓋封。將無菌的離心套管放入離心機(jī)中，然后將裝有患者靜脈血液的20ml注射器放入套管中，以轉(zhuǎn)速為2700rpm/min離心12min。靜置3～5min后棄上清，去除底層紅細(xì)胞碎片，收集中間纖維蛋白凝膠層，過濾去除血清，將富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠收集備用，如圖3所示。同時(shí)對(duì)富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠在1～168h時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞因子釋放濃度的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、表皮生長因子、白細(xì)胞介素-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和胰島素樣生長因子-1的濃度呈上升趨勢，如圖4所示。這些細(xì)胞因子對(duì)促進(jìn)組織修復(fù)和再生具有重要的作用。

5)臨床應(yīng)用情況

移植物由結(jié)構(gòu)性脂肪顆粒、納米脂肪基質(zhì)細(xì)胞和富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠按一定比例混合而成，在受區(qū)周圍標(biāo)記，選擇較為隱蔽的部位作為進(jìn)針點(diǎn)，局部麻醉，自遠(yuǎn)向近緩慢注入移植物，使其均勻分布。在注入前，先用銳針剌破皮膚，再換成鈍針注射復(fù)合移植物，先回抽是否有回血，尤其是在眼周，避免注入至血管內(nèi)，注射時(shí)，給予最小的壓力，緩慢注入。注射時(shí)應(yīng)注意間斷、扇形、線狀注入，采用多點(diǎn)分層注入，避免團(tuán)塊情況出現(xiàn)，而影響血運(yùn)。注射量應(yīng)較所需量多25％～30％左右：注入后局部按摩，使移植物分布均勻。術(shù)后輕度壓迫.敷料固定2天。靜脈使用抗生素3天，預(yù)防感染。

本發(fā)明項(xiàng)目使用新鮮分離富含基質(zhì)血管成分的納米脂肪、富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠與自體顆粒脂肪形成復(fù)合移植物后，對(duì)62例面部凹陷、皮膚老化及乳房萎縮或先天性發(fā)育不良的患者進(jìn)行局部注射移植治療，經(jīng)過12～24個(gè)月的隨訪，發(fā)現(xiàn)脂肪存活情況良好，大部分病例單次注射即能達(dá)到滿意效果，僅有5例(8.06％)需行2次注射，而傳統(tǒng)的自體脂肪移植絕大部分患者則需要反復(fù)多次注射治療，且移植物發(fā)生囊腫、液化的概率較高。此外所有患者術(shù)后均未發(fā)現(xiàn)局部感染、脂肪液化、硬結(jié)、感覺異常等不良并發(fā)癥，說明該方法安全性可靠，且效果顯著，可作為臨床上治療各類軟組織缺損及皮膚衰老的首選方案。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)所有患者接受移植部位的膚質(zhì)得到了不同程度的改善，如色斑淡化、細(xì)紋消失、毛孔縮小等，其主要作用機(jī)制是納米脂肪中血管基質(zhì)成分的旁分泌功能以及富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠中的細(xì)胞因子發(fā)揮了組織再生及皮膚抗衰老作用。

綜上所述，應(yīng)用新鮮分離富含基質(zhì)血管成分的納米脂肪、富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠按一定比例與自體結(jié)構(gòu)性顆粒脂肪移植作為面部、胸部軟組織凹陷或缺損患者的塑形治療，術(shù)后患者滿意度高，脂肪組織可以在受區(qū)長期存活，未見不良并發(fā)癥，單次注射即可獲得比較滿意的效果，是安全性好、遠(yuǎn)期療效顯著的面部輪廓及胸部整形方法，該方法可顯著提高脂肪移植成活率，達(dá)到塑形、豐胸、精雕面部輪廓并能改善面部膚質(zhì)的作用，值得進(jìn)一步深入研究和推廣應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明基于基質(zhì)血管成分促進(jìn)創(chuàng)傷或創(chuàng)面修復(fù)并減少瘢痕增生、促進(jìn)組織再生修復(fù)與器官重建的新技術(shù)，縮短患者的康復(fù)時(shí)間，取得良好的療效，為臨床上細(xì)胞輔助的自體脂肪組織移植修復(fù)軟組織或器官缺損、燒傷創(chuàng)面、難愈性創(chuàng)面及乳腺癌術(shù)后乳房重建提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論支持。

附圖說明

圖1是本發(fā)明結(jié)構(gòu)性顆粒脂肪和納米脂肪的提取圖。

圖2是本發(fā)明第3代納米脂肪來源干細(xì)胞形態(tài)特征及多向分化誘導(dǎo)結(jié)果圖。

圖中，a、b、c為傳代后細(xì)胞形態(tài)主要為梭形，少數(shù)為三角形或多邊形；d、e為第3代細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)14d，可見細(xì)胞內(nèi)有透亮的脂滴形成，油紅o染色可見脂滴被染成鮮紅色；f、g為成骨誘導(dǎo)21d后，可見典型的礦化鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色吳鮮紅色；h、i為成軟骨誘導(dǎo)14d后，可見高度聚集樣生長的細(xì)胞團(tuán)，呈斑片狀或結(jié)節(jié)狀，周圍細(xì)胞呈放射狀；結(jié)節(jié)較大，肉眼可見；阿利辛藍(lán)染色提示結(jié)節(jié)及周邊聚集的細(xì)胞呈藍(lán)色。

圖3是本發(fā)明富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠的提取示意圖。

圖4是本發(fā)明不同時(shí)間點(diǎn)富含細(xì)胞因子纖維蛋白膠釋放細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附檢測結(jié)果圖。

圖5是本發(fā)明第3代nfscs表面抗原流式細(xì)胞分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合典型案例對(duì)本發(fā)明實(shí)施效果作詳細(xì)的說明。

典型案例1

患者韋某某，女，30歲，因面部軟組織凹陷及輪廓不協(xié)調(diào)就診，要求手術(shù)改善。于2016年1月29日在局部麻醉下行“富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料”局部注射治療，其中雙側(cè)顳部注射移植45ml，額部注射移植30ml，雙側(cè)面頰部注射移植20ml，下巴注射移植5ml。術(shù)后隨訪12個(gè)月見面部輪廓好，軟組織凹陷處較飽滿，移植物存活良好，面部膚質(zhì)明顯改善，療效滿意。

典型案例2

患者何某某，女，26歲，因雙側(cè)下瞼部(瞼頰溝)、法令紋(鼻唇溝)軟組織凹陷不協(xié)調(diào)就診，要求手術(shù)改善。于2016年3月12日在局部麻醉下行“富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料”局部注射治療，其中雙側(cè)瞼頰溝注射移植1.6ml，雙側(cè)鼻唇溝注射移植10ml。術(shù)后隨訪12個(gè)月見輪廓好，軟組織凹陷處較飽滿，移植物存活良好，局部皮膚光滑、毛孔變小，療效滿意。

典型案例3

患者蘇某某，女，25歲。因先天性乳房發(fā)育不良及不對(duì)稱來診，要求手術(shù)改善。于2015年11月28日在全身麻醉下行雙側(cè)大腿吸脂術(shù)+雙側(cè)乳房“富含細(xì)胞因子的脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合移植材料“注射移植術(shù)，其中左側(cè)乳房注射細(xì)胞復(fù)合物220ml，右側(cè)乳房注射細(xì)胞復(fù)合物190ml。術(shù)后隨訪12個(gè)月見雙側(cè)乳房形態(tài)飽滿，移植物存活良好，未見移植物液化、硬結(jié)、囊腫等并發(fā)癥，療效滿意。