專利名稱:Bcr－abl基因熒光定量rt－pcr引物和探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)。
背景技術(shù)：
ABL為一原癌基因，位于9號(hào)染色體q34，基因產(chǎn)物是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，但通常沒(méi)有激酶活性。BCR基因位于22號(hào)染色體q11，正常的her基因產(chǎn)物為160kD的胞質(zhì)磷酸蛋白。由于t(9；22)(q34；q11)的易位，導(dǎo)致位于9號(hào)染色體上的ABL原癌基因與位于22號(hào)染色體上的BCR基因并列，形成新的BCR-ABL融臺(tái)基因，在這易位中，9號(hào)染色體上的ABL原癌基因斷裂點(diǎn)比較恒定，22號(hào)上的BCR基因斷裂點(diǎn)不恒定，絕大多數(shù)斷裂點(diǎn)位于第14號(hào)外顯子上下游。根據(jù)斷裂點(diǎn)不同而形成的融合基因主要有b2a2、b3a2和e1a2三種亞型，其中99％的CML患者屬于前兩種亞型，而且這兩種亞型分子結(jié)構(gòu)上只相關(guān)一個(gè)外顯子(75bp)，但由于該外顯子沒(méi)有表達(dá)產(chǎn)物，因此二者均翻譯為一種融合蛋白----p210蛋白，而e1a2亞型所表達(dá)的產(chǎn)物為p190蛋白，該蛋白為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者特征性表達(dá)產(chǎn)物。因p210和p190蛋白的表達(dá)激活了酪氨酸蛋白激酶，改變了細(xì)胞的蛋白酪氨酸水平和肌動(dòng)蛋白結(jié)合能力，擾亂了正常的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制凋亡的發(fā)生。
目前BCR-ABL融合基因?qū)е侣运杓?xì)胞白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)檢測(cè)常用方法有①形態(tài)學(xué)檢查，由于白血病細(xì)胞的高度異質(zhì)性和多態(tài)性，重復(fù)性差，易受主觀因素的影響，其診斷一致平約60％～80％；②免疫學(xué)檢測(cè)方法有兩種細(xì)胞涂片法和FCM。細(xì)胞涂片法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，可在顯微鏡下清楚地判斷細(xì)胞抗原和抗體結(jié)合的部位，尤其對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)較易排除因細(xì)胞膜滲透處理帶來(lái)的非特異性反應(yīng)，但目測(cè)不易對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，故敏感度較低，一般為10-2，目前主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)；而FCM可同時(shí)對(duì)同一細(xì)胞中2個(gè)以上的抗原進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)大量細(xì)胞行快速分析，準(zhǔn)確客觀、簡(jiǎn)單方便。實(shí)驗(yàn)證明對(duì)其流動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行反復(fù)和長(zhǎng)時(shí)間清洗后，檢測(cè)MRD可獲得的最高敏感度是10-6，但實(shí)際操作中一般達(dá)到的是10-4。③細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)方法，常規(guī)應(yīng)用直接法或短期培養(yǎng)法進(jìn)行染色體RHG顯帶，但是白血病細(xì)胞分裂指數(shù)低，染色體形態(tài)短小，常顯帶不清，使得一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜或細(xì)微的改變難以準(zhǔn)確識(shí)別。④熒光原位雜交(FISH)，F(xiàn)ISH技術(shù)靈敏度高，取材方便，骨髓或外周血均可作為研究對(duì)象，不儀對(duì)分裂中期細(xì)胞，而且對(duì)間期核細(xì)胞均能檢測(cè)到，對(duì)隱匿型、變異型也可同樣進(jìn)行檢測(cè)分析，是直觀、敏感、快速、特異的診斷方法。但是，常用的雙色單融合探針檢測(cè)bcr/abl融合基因時(shí)，由于bcr和abl基因信號(hào)空間上的隨機(jī)分布或光學(xué)重疊，可造成4％～10％的假陽(yáng)性率。過(guò)高的假陽(yáng)性率不僅影響到靈敏度與特異性，還可一定程度上影響研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋。⑤分子生物學(xué)檢測(cè)，主要有兩種PCR方法一種為直接原位RT-PCR，這種方案更直接且容易實(shí)施，直接原位RT-PCR檢測(cè)慢粒bcr/abl mRNA具有特異性好，敏感度高，且無(wú)須提取RNA等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報(bào)道bcr/abl融合基因陽(yáng)性的CML患者預(yù)后較好，但ALL患者正相反，CML+ALL往往呈現(xiàn)高危癥狀，其完全緩解率低、緩解時(shí)間及生存期短、早期耐藥，且緩解后復(fù)發(fā)率達(dá)100％。但由于引物錯(cuò)配和非特異性退火發(fā)生，容易產(chǎn)生非特異性結(jié)果。另一種是尚未報(bào)道和應(yīng)用的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。
所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在熒光定量PCR技術(shù)中，通常以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，而將每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)設(shè)為Ct值。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷見數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱橫標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增過(guò)程中加入一對(duì)引物的同時(shí)也加入一條特異的熒光探針，目前常用的為Taqman熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，故檢測(cè)不到熒光；在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq酶的5’-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。每個(gè)循環(huán)過(guò)程結(jié)束檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，反應(yīng)結(jié)束后，便可得一條工作曲線。
由于熒光定量PCR具有重復(fù)性好，靈敏度高，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，所以醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面，一些常規(guī)檢測(cè)方法所不能解決的問(wèn)題得到了解決。例如，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查可直接觀測(cè)到腫瘤細(xì)胞，但由于腫瘤脫落至血循環(huán)中的數(shù)目微小，這種檢查的敏感性和特異性均較差，陽(yáng)性率低。免疫組織化學(xué)方法提高于血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞染色的特異性，特別是單克隆抗體的應(yīng)用使染色的特異性和敏感性有了較大的改善，可查出104-105個(gè)有核細(xì)胞中的一個(gè)腫瘤細(xì)胞。但該技術(shù)則需要特異性的抗體，生產(chǎn)相對(duì)復(fù)雜。同時(shí)，假陽(yáng)性限制了此項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。與這些技術(shù)相比，熒光定量PCR技術(shù)有著明顯的優(yōu)點(diǎn)，由于大多數(shù)基因的調(diào)節(jié)發(fā)生于轉(zhuǎn)移水平，有些腫瘤可轉(zhuǎn)錄特異性mRNA，但無(wú)相應(yīng)蛋白合成，故熒光定量PCR應(yīng)用范圍較廣；PCR簡(jiǎn)便易行，只要知道待測(cè)基因序列，即可設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增；該方法具有較高的靈敏度及可重復(fù)性，也保證了醫(yī)學(xué)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以該技術(shù)的應(yīng)用，將會(huì)對(duì)早期尋找腫瘤患者血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療、改善患者預(yù)后產(chǎn)生極為重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容所要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種BCR-ABL融合基因(P190BCR/ABL和P210BCR/ABL)mRNA熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)慢性髓細(xì)胞白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者細(xì)胞中BCR/ABL融合基因mRNA表達(dá)水平的定量檢測(cè)準(zhǔn)確性差、靈敏度低、檢測(cè)速度慢，不利于慢性髓細(xì)胞白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的臨床分型、病情觀察及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的缺陷。
技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一組BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，包括如下序列BCR-ABL融合基因上、下游引物P210BCR/ABL上游引物SEQ ID NO15’-CCG CTG ACC ATC AATAAG G-3’P190BCR/ABL上游引物SEQ ID NO25’-ACT GCC CGG TTG TCGTGT-3’P190BCR/ABL、P210BCR/ABL下游引物SEQ ID NO35’-GTT CCA ACGAGC GGC TTC A-3’；BCR-ABL融合基因檢測(cè)探針為SEQ ID NO45’-FAM-TCT TCC CAG CCC ACC ATC CC-TAMRA-3’或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
上述的一組BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針的優(yōu)選技術(shù)方案為，其序列組還包括內(nèi)參基因TBP基因的引物和探針TBP內(nèi)參基因上、下游引物上游引物SEQ ID NO55’-GTG CCC GAA ACG CCG AAT A-3’，下游引物SEQ ID NO65’-CTG GAC TGT TCT TCA CTC TT-3’TBP內(nèi)參基因檢測(cè)探針為SEQ ID NO7
5’-FAM-AAT CCC AAG CGG TTT GCT GCG G-TAMRA-3’；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種含有上述引物和探針序列的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其組成為細(xì)胞裂解液、水、含引物序列SEQ ID NO1-3的BCR-ABL RT-PCR反應(yīng)液、內(nèi)參TBP RT-PCR反應(yīng)液、含探針序列SEQ ID NO4的BCR-ABL基因探針、TBP基因探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。
所說(shuō)的BCR-ABL RT-PCR反應(yīng)液組成為RT-PCR緩沖液、MgCl2、目的基因(BCR-ABL融合基因)上、下游引物、dNTPs、無(wú)RNA酶的水。
上述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之一為，所說(shuō)的內(nèi)參TBP RT-PCR反應(yīng)液中的引物序列為SEQ IDNO5和6，且所說(shuō)的TBP基因探針序列為SEQ ID NO7。
所說(shuō)的TBP RT-PCR反應(yīng)液組成為RT-PCR緩沖液、MgCl2、管家基因(TBP)上、下游引物、dNTPs、無(wú)RNA酶的水。
上述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之二為，所說(shuō)的標(biāo)準(zhǔn)品為如下DNA序列SEQ ID NO85’-TGTGAAACTC CAGACTGTCC ACAGCATTCC GCTGACCATCAATAAGGAAG ATGATGAGTC TCCGGGGCTC TATGGGTTTCTGAATGTCAT CGTCCACTCA GCCACTGGAT TTAAGCAGAG
TTCAAAAGCC CTTCAGCGGC CAGTAGCATC TGACTTTGAGCCTCAGGGTC TGAGTGAAGC CGCTCGTTGG AACTCCAAGGAAAACCTTCT CGCTGGACCC AGTGAAA-3’。
作為特例，標(biāo)準(zhǔn)品是含有插入BCR-ABL特異性保守序列的T載體，該載體可在大腸桿菌DH5a中增殖。
上述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之三為，所說(shuō)的水為無(wú)RNA酶的水。
一般，無(wú)RNA酶的水獲得方法為向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.01％(V/V)，室溫(22-25℃)放置10-12小時(shí)后，121℃，20分鐘高壓，室溫放置備用；上述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之四為，所說(shuō)的陰性對(duì)照為無(wú)BCR-ABL融合基因的正常細(xì)胞樣本。
上述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之五為，所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照為含有BCR-ABL融合基因的白血病細(xì)胞樣本。
上述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之六為，所說(shuō)的細(xì)胞裂解液由細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II組成。
作為特例，細(xì)胞裂解液I組成為320mM蔗糖、5mM MgCl2、1％TritonX-100，10mM Tris-HCl[pH7.5]、水；作為特例，細(xì)胞裂解液II組成為4M硫氰酸胍、0.75M檸檬酸鈉(pH7.0)和10％月桂酰基肌氨酸鈉(Sarcosyl 1g/10mL)、14.3M β-巰基乙醇、2M醋酸鈉(pH4.0)和水飽和酚；上述各方案中所說(shuō)的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶在試劑盒中的形式可以為混合兩種酶的混合液。一般而言，DNA聚合酶選用耐熱Taq DNA聚合酶。
上述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選技術(shù)方案之六為，每盒中各組分的量為細(xì)胞裂解液I 1瓶24mL、細(xì)胞裂解液II 1瓶6mL、無(wú)RNA酶的水1瓶2mL、BCR-ABL RT-PCR反應(yīng)液1管210μL、TBP RT-PCR反應(yīng)液1管210μL、BCR-ABL基因探針1管30μL、TBP內(nèi)參基因探針30μL、標(biāo)準(zhǔn)品1管10μL、和陰性對(duì)照品1管10μL。
本試劑盒中的細(xì)胞裂解液(即RNA總提取試劑)應(yīng)于4℃保存，RT-PCR試劑保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物和探針序列的在基因中的核苷酸位置、Tm值和產(chǎn)物長(zhǎng)度如下PCR標(biāo)準(zhǔn)品引物序列
BCR/ABL融合基因檢測(cè)引物、探針序列
內(nèi)參引物、探針序列
標(biāo)準(zhǔn)品序列
本發(fā)明還提供所說(shuō)的試劑盒的使用方法如下首先，每次檢測(cè)目的基因(BCR-ABL融合基因)和管家基因(TBP:TATA盒結(jié)合蛋白)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
樣品要求
1～2ml抗凝的新鮮外周血或骨髓樣本。
采集靜脈血或骨髓1～2ml于含有抗凝劑的無(wú)菌離心管中，或于無(wú)菌離心管中，使用EDTA作抗凝劑(1.44mg/ml全血)。樣本采集后應(yīng)立即使用，若不能立即使用，可以4℃保存1-2小時(shí)，但時(shí)間不宜再過(guò)長(zhǎng)，否則將影響檢測(cè)結(jié)果。全血經(jīng)處理后，得到的有核細(xì)胞可在-80℃或液氮中保存數(shù)月，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
操作步驟
一、總RNA提取1.將新鮮抗凝全血或骨髓1～1.5ml置于1.5ml Beckman離心管中，4℃下3000g離心10min，棄上清液。
2.在下層細(xì)胞中補(bǔ)滿細(xì)胞裂解液I，混勻，冰浴10min其間再次混勻兩次，溶液變清表明紅細(xì)胞已裂解。
3.4℃下3000g，離心10min沉淀有核細(xì)胞，完全棄去含有裂解細(xì)胞的上清液。
4.用細(xì)胞裂解液I重復(fù)裂解1次后(若沉淀中仍有紅細(xì)胞，需重復(fù)此操作1～2次)，傾去上清，吸干管口。
5.在上述沉淀有核細(xì)胞中加入50μL無(wú)RNA酶水，用槍頭抽吸打散形成清亮不粘的溶液，再加入450μL細(xì)胞裂解液II，用移液器反復(fù)吹打混勻，室溫放置5分鐘。
6.加200μL三氯甲烷，用手來(lái)回振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘，4℃15,000rpm離心10分鐘，將上清移入新的離心管。
7.加入等體積異內(nèi)醇，旋渦振蕩5秒，室溫沉淀10分鐘，4℃15,000rpm離心5分鐘，棄上清。
8.加入500μL預(yù)冷的75％乙醇洗滌，上下顛倒10次，4℃10,000rpm離心5分鐘，吸干上清，沉淀室溫干燥10-20分鐘，加入20μL無(wú)RNA酶水稀釋混勻，立即使用或-70℃保存。
二、RT-PCR
將裝有BCR-ABL RT-PCR反應(yīng)液、內(nèi)參TBP(TATA盒結(jié)合蛋白)RT-PCR反應(yīng)液、BCR-ABL融合基因探針、TBP管家基因探針、混合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品的離心管從-20℃中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，低速離心，用移液器將上述試劑分別配制目的基因(BCR-ABL融合基因)和管家基因(TBP:TATA盒結(jié)合蛋白)RT-PCR反應(yīng)液，混勻，低速離心，置于冰盒上備有。
按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)液(30μL體系)
RT-PCR反應(yīng)條件37℃ 30分鐘；95℃ 5分鐘；(95℃ 10秒，60℃ 45秒，40個(gè)循環(huán))。
三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)品貯存液(6*107copies/μL)梯度稀釋為6*106，6*105，6*104，6*103，6*102copies/μL，取4μL為模板，同待測(cè)樣品一同進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)定量曲線。
結(jié)果判斷
1.使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件進(jìn)行文件保存及閾值的設(shè)定。
2.選中不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)信息。
3.選中樣品所對(duì)應(yīng)有目的基因和管家基因檢測(cè)孔，應(yīng)用相應(yīng)的軟件進(jìn)行分析，得出待測(cè)樣品目的基因和管家基因的起始拷貝數(shù)( 即[Copy]sample和[Copy]IPC)。
4.根據(jù)檢測(cè)樣本目的基因和管家基因的起始拷貝數(shù)，計(jì)算基因表達(dá)率，即Expression Ratio＝[Copy]sample/[Copy]IPC。
有益效果本發(fā)明的試劑盒通過(guò)對(duì)新鮮抗凝外周血有核細(xì)胞提取總RNA，為了排除不同標(biāo)本以及因提取時(shí)造成在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，選擇以中等豐度表達(dá)，在細(xì)胞標(biāo)本間變異較低的TBP作為內(nèi)參照基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量Rt-PCR檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)標(biāo)本中P210BCR/ABL和P190BCR/ABL的mRNA的表達(dá)水平，為慢性粒細(xì)胞性白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病的早期診斷、復(fù)發(fā)、治療方案的確定以及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。
本發(fā)明建立了利用TaqMan技術(shù)檢測(cè)BCR-ABL融合基因mRNA表達(dá)的方法，并且經(jīng)過(guò)對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，表明該法切實(shí)可行。由于本方法采用了熒光定量PCR，使得BCR-ABL融合基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)敏感性和特異性大大的提高，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽(yáng)性率，從而使得本發(fā)明可以在極少量的標(biāo)本中獲得足夠的信息。同時(shí)為了排除不同標(biāo)本以及因提取時(shí)造成在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，通過(guò)篩選確定以中等豐度表達(dá)，在細(xì)胞標(biāo)本間變異較低的TBP(即TATA盒結(jié)合蛋白)作為內(nèi)參照基因(也稱管家基因)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。
在本檢測(cè)項(xiàng)目中，本發(fā)明采用了目前最為先進(jìn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，在保持高敏感性的前提下，盡量減少假陽(yáng)性的干擾。在實(shí)量熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對(duì)PCR模板的定量都要通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理，根據(jù)電泳條帶的高度來(lái)確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)?biāo)記的PCR產(chǎn)物以ELISA的方式進(jìn)行檢測(cè)，再由此推測(cè)出起始模板的量，但這些方法實(shí)際上都有屬于半定量水平，因?yàn)榧词筆CR條件已最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會(huì)給結(jié)果的分析帶來(lái)影響，從而影響定量這一目的。隨著本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，可以真正地做到對(duì)PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高敏靈性，而且由于特異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得被子檢測(cè)基因的特異性大大提高。
本發(fā)明的引物、探針和試劑盒采用熒光定量RT-PCR方法，該方法靈敏、特異、重復(fù)性好，結(jié)果用拷貝數(shù)表示，準(zhǔn)確可靠，利于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。方法靈敏，重組質(zhì)粒定量模板，按10倍梯度稀釋，可檢出10個(gè)拷貝，并由此制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍寬(0～107拷貝)，方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)為0.997。熒光定量RT-PCR方法在CML、ALL診斷、療效和預(yù)后判斷及MRD的動(dòng)態(tài)觀察等方面有廣泛的應(yīng)用前景。由于幾乎所有的CML患者都能查出bcr/abl融合基因，檢測(cè)bcr/abl融合基因有助于CML、ALL的診斷，而且bcr/abl融合基因陰轉(zhuǎn)已成為CML、ALL療效和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。
圖1為樣本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)圖。
圖2為樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例儀用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。所有無(wú)機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠，Trizol試劑購(gòu)自上海生工公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自上海申能博彩生物公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT)15-18均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，引物和探針均由上海生工公司合成。Eppendorf梯度式PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，iCycle熒光PCR儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品。
實(shí)施例1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)人BCR-ABL融合基因mRNA的表達(dá)及應(yīng)用一、引物及探針設(shè)計(jì)與合成以BCR-ABL融合基因其中一種b3a2亞型全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank登錄號(hào)HSA131466)為模板，使用Oligo軟件分析TaqMan引物和探針的位點(diǎn)，并根據(jù)同時(shí)考慮BCR和ABL兩基因組DNA序列的情況，從中選擇最佳組合。
標(biāo)準(zhǔn)品PCR上游引物序列為5’-TGT GAA ACT CCA GAC TGT CC-3’；下游引物序列為5’-ACG AAA AGG TTG GGG TCA TT-3’；檢測(cè)用PCR上游引物序列為5’-CCG CTG ACC ATC AAT AAG G-3’和5’-ACT GCC CGG TTG TCG TGT-3’；下游引物序列為5’-GTT CCA ACGAGC GGC TTC A-3’；熒光探針序列為5’-FAM-TCT TCC CAG CCC ACC ATCCC-TAMRA-3’；二、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品制備取患者新鮮外周血，分離外周血有核細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，取1μgRNA，在25μL總反應(yīng)體系中用Oligo(dT)15-18為引物對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用標(biāo)準(zhǔn)品上、下游引物在Eppendorf梯度式PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃變性5分鐘，再按95℃20秒、58℃20秒、72℃45秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后于72℃延伸7分鐘后置于4℃。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送上海閃晶生物公司進(jìn)行克隆(質(zhì)粒由應(yīng)公司提供)，并將陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證(由上海基康公司測(cè)序)。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，即為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。
三、標(biāo)本檢測(cè)取5例經(jīng)病理確定的白血病患者和2例正常人外周血標(biāo)本1.5ml，分離外周外有核細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，取4μL RNA提取液，在30μL總反應(yīng)體系中，用檢測(cè)用上、下游引物以及管家基因上、下游引物同時(shí)在iCycle熒光PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件均為37℃保溫30分鐘，95℃變性5分鐘，再按95℃20秒、58℃20秒、72℃45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)標(biāo)本的BCR-ABL融合基因和TBP的拷貝數(shù)，再根據(jù)兩者的拷貝數(shù)計(jì)算BCR-ABL融合基因表達(dá)率。
五、結(jié)果(一)標(biāo)準(zhǔn)品的制備經(jīng)測(cè)序，上述設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)品完全與預(yù)期相符，回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下5’-TGTGAAACTC CAGACTGTCC ACAGCATTCC GCTGACCATCAATAAGGAAG ATGATGAGTC TCCGGGGCTC TATGGGTTTCTGAATGTCAT CGTCCACTCA GCCACTGGAT TTAAGCAGAGTTCAAAAGCC CTTCAGCGGC CAGTAGCATC TGACTTTGAGCCTCAGGGTC TGAGTGAAGC CGCTCGTTGG AACTCCAAGGAAAACCTTCT CGCTGGACCC AGTGAAA-3’(二)樣品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。
5例患者和2例正常人外周血標(biāo)本熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如下患者 性別 年 標(biāo)本 融合基因 TBP 表達(dá)率(Ratio)
編號(hào) 齡 (copies/mL) (copies/mL) (CopyPML-RARa/CopyTBP)1 男 43 外周血 1.192*1022.185*1015.462 女 51 外周血 5.866*1005.894*1001.003 女 62 外周血 1.164*1021.099*10110.604 男 68 外周血 3.254*1012.032*1011.605 女 36 外周血 9.240*1011.324*1016.986 女 38 外周血 - - -7 男 57 外周血 - - -采用同樣的檢測(cè)PCR上、下游引物以及同樣的7例樣本進(jìn)行原位直接原位RT-PCR檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)方案如下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系20μL.含200μmol/L dNTPs.1μmoI/L下游引物，RNA酶抑制劑40U和Mo-MLV 20U，反應(yīng)液經(jīng)一個(gè)基因框(GeneFrame，購(gòu)于Advanced Biotechnologies公司)密封在上述玻片中心附有細(xì)胞的區(qū)域，玻片在原位PCR儀(Genius，英國(guó)Techne公司)中42℃反應(yīng)30min，結(jié)束后去除基因框，甩棄反應(yīng)液。
原位PCR反應(yīng)體系25μL，含200μmol/L dNTPs，1μmol/L上、下游引物，4.5mmol/L MgCl2，10μmol/L地高辛標(biāo)記的dUTP和Taq酶5U。反應(yīng)液同樣密封在上述部位，反應(yīng)條件為95℃變性5min后，以94℃變性，58℃退火和72℃延伸各1min，在原位PCR儀上，總共進(jìn)行25循環(huán)。
擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)①洗片2×SSC洗片3次，含0。1％吐溫-20的Buffer I(0.1mol/L Tris-HCI pH7.5，0.15M MgCl2)洗2次，每次5min；含5％牛血清白蛋白(BSA)和3％綿羊血清的Buffer II室溫孵育30min，再用抗地高辛抗體滴片，濕盒內(nèi)37℃孵育2h；②再洗片含0.1％葉溫-20的Buffer I洗3次，Buffer II洗1次，Buffer III(0.1mol/L Tris-HCl pH9.5，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2)洗1次，每次5min；NBT/BCIP避光染色約30min，光鏡下觀察，待顯色適度后水洗終止，蓋上蓋玻片，甘油明膠封片；③結(jié)果判斷細(xì)胞漿中出現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒物質(zhì)為陽(yáng)性，陰性者胞漿內(nèi)無(wú)藍(lán)紫色顆粒。
5例患者和2例正常人外周血標(biāo)本原位RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如下編號(hào) 性別 年齡 標(biāo)本 檢測(cè)結(jié)果1 男 43 外周而 陽(yáng)性2 女 51 外周血 陽(yáng)性3 女 62 外周血 陽(yáng)性4 男 68 外周血 陽(yáng)性5 女 36 外周血 陽(yáng)性6 女 38 外周血 陰性7 男 57 外周血 陰性雖然，原位RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，但其操作過(guò)程過(guò)余復(fù)雜，結(jié)果判斷受主觀因素的影響，而且只能作定性檢測(cè)，不能為臨床治療提供CML、ALL早期診斷、復(fù)發(fā)、治療方案的確定以及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。
核苷酸序列表SEQUENCE LISTING<110>上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司<120>BCR-ABL基因熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒<130>060802<140>CN<141>2006-08-10<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>BCR-ABL融合基因P210上游引物<222>(1)..(19)<400>1
ccgctgacca tcaataagg 19<210>2<211>18<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>BCR-ABL融合基因P190上游引物<222>(1)..(18)<400>2actgcccggt tgtcgtgt 18<210>3<211>19<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>BCR-ABL融合基因P210/P190下游引物<222>(1)..(19)
<400>3gttccaacga gcggcttca 19<210>4<211>22<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>BCR-ABL融合基因檢測(cè)探針<222>(1)..(20)<223>n＝FAM，y＝TAMRA<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<400>4ntcttcccag cccaccatcc cy 22
<210>5<211>19<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>TATA盒結(jié)合蛋白內(nèi)參基因上游引物<222>(1)..(19)<400>5gtgcccgaaa cgccgaata 19<210>6<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>TATA盒結(jié)合蛋白內(nèi)參基因下游引物<222>(1)..(20)<400>6
ctggactgtt cttcactctt 20<210>7<211>24<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>TATA盒結(jié)合蛋白內(nèi)參基因檢測(cè)探針<222>(1)..(22)<223>n＝FAM，y＝TAMRA<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<400>7naatcccaag cggtttgctg cggy 24<210>8<211>227<212>DNA
<213>Homo sapiens<220>
<221>標(biāo)準(zhǔn)品DNA序列<222>(1)..(227)<400>8tgtgaaactc cagactgtcc acagcattcc gctgaccatc aataaggaag atgatgagtc 60tccggggctc tatgggtttc tgaatgtcat cgtccactca gccactggat ttaagcagag 120ttcaaaagcc cttcagcggc cagtagcatc tgactttgag cctcagggtc tgagtgaagc 180cgctcgttgg aactccaagg aaaaccttct cgctggaccc agtgaaa 227
權(quán)利要求
1.一組BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，包括如下序列BCR-ABL融合基因上、下游引物P210BCR/ABL上游引物SEQ ID NO15’-CCG CTG ACC ATC AATAAG G-3’P190BCR/ABL上游引物SEQ ID NO25’-ACT GCC CGG TTG TCGTGT-3’P190BCR/ABL、P210BCR/ABL下游引物SEQ ID NO35’-GTT CCA ACGAGC GGC TTC A-3’BCR-ABL融合基因檢測(cè)探針為SEQ ID NO45’-FAM-TCT TCC CAG CCC ACC ATC CC-TAM RA-3’或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求
所述的一組BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，其序列組還包括內(nèi)參基因TBP基因的引物和探針TBP內(nèi)參基因上、下游引物上游引物SEQ ID NO55’-GTG CCC GAAACG CCG AATA-3’，下游引物SEQ ID NO65’-CTG GAC TGT TCT TCA CTC TT-3’TBP內(nèi)參基因檢測(cè)探針為SEQ ID NO75’-FAM-AAT CCC AAG CGG TTT GCT GCG G-TAMRA-3’或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
3.一種含有權(quán)利要求
1所述序列的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其組成為細(xì)胞裂解液、水、含有權(quán)利要求
1所述引物序列SEQ ID NO1-3的BCR-ABL RT-PCR反應(yīng)液、內(nèi)參TBP RT-PCR反應(yīng)液、含有權(quán)利要求
1所述探針序列SEQ ID NO4的BCR-ABL融合基因檢測(cè)探針、TBP基因探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3所述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的內(nèi)參TBP RT-PCR反應(yīng)液中的引物序列為SEQ ID NO5和6，且所說(shuō)的TBP基因探針序列為SEQ ID NO7。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的標(biāo)準(zhǔn)品為如下DNA序列SEQ ID NO85’-TGTGAAACTC CAGACTGTCC ACAGCATTCC GCTGACCATCAATAAGGAAG ATGATGAGTC TCCGGGGCTC TATGGGTTTCTGAATGTCAT CGTCCACTCA GCCACTGGAT TTAAGCAGAGTTCAAAAGCC CTTCAGCGGC CAGTAGCATC TGACTTTGAGCCTCAGGGTC TGAGTGAAGC CGCTCGTTGG AACTCCAAGGAAAACCTTCT CGCTGGACCC AGTGAAA-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的水為無(wú)RNA酶的水。
7.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的陰性對(duì)照為無(wú)BCR-ABL融合基因的正常細(xì)胞樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照為含有BCR-ABL融合基因的白血病細(xì)胞樣本。
9.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的細(xì)胞裂解液由細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的BCR-ABL融合基因mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，每盒中各組分的量為細(xì)胞裂解液I1瓶24mL、細(xì)胞裂解液II1瓶6mL、無(wú)RNA酶的水1瓶2mL、BCR-ABL RT-PCR反應(yīng)液1管210μL、TBP RT-PCR反應(yīng)液1管210μL、BCR-ABL基因探針1管30μL、TBP內(nèi)參基因探針30μL、標(biāo)準(zhǔn)品1管1μL、和陰性對(duì)照品1管1μL。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種BCR－ABL融合基因mRNA熒光定量RT－PCR引物和探針及試劑盒，BCR－ABL融合基因引物和探針序列為SEQ ID NO1－4，內(nèi)參基因引物和探針序列為SEQ ID NO5－7，試劑盒包含細(xì)胞裂解液、水、RT－PCR反應(yīng)液、內(nèi)參TBP RT－PCR反應(yīng)液、BCR－ABL融合基因檢測(cè)探針、TBP內(nèi)參基因檢測(cè)探針、混合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品。可同時(shí)、迅速、準(zhǔn)確地檢測(cè)標(biāo)本中P210
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1995386SQ200610030294
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年8月22日
發(fā)明者沈維祥, 吳大治, 夏懿 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan