專利名稱:一種用于核酸分離的磁性納米粒子復合物及其制法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬納米材料領域，更具體地，是涉及應用于生物技術領域：
的納米材料。
背景技術：
核酸提取特別是mRNA提取技術不僅是分子生物學技術的重要組成部分，也是功能基因組學科研技術的重要基礎。隨著后基因組時代的到來，尋求一種有效的提取核酸特別是mRNA的方法成為迫切需要解決的問題。mRNA即信使核糖核酸(messenger RNA)。它是存在于生物細胞內將遺傳信息從DNA上轉移到功能蛋白上的信使，或稱模板。通過研究基因表達譜分析來闡釋基因的功能和基因表達調控機制已成為目前研究的熱點。然而，進行基因表達譜分析的一個最大挑戰(zhàn)就是mRNA的提取和特異性標記。這也是原核生物的基因表達譜分析比真核生物落后得多的一個原因。因此，mRNA提取技術不僅是分子生物學技術的重要組成部分，也是功能基因組學科研技術的重要基礎。由于mRNA在細胞內半衰期很短，直到20多年前，人類才首次將這一重要物質從真核細胞中分離出來。近幾年來，隨著科學技術的不斷進步，細菌mRNA的提取也有所突破。
在mRNA提取過程中，如何快速地穩(wěn)定樣品中mRNA群體使細胞保持原有的表達模式至關重要。傳統(tǒng)的從總RNA中分離mRNA是用帶Oligo(dT)的纖維素或者瓊脂糖親和層析柱，用傳統(tǒng)方法從細菌中分離RNA，有兩個主要因素會導致細菌表達模式的改變，影響基因表達分析。一是由于RNA酶的降解導致一些轉錄本的損失甚至丟失，這一點對細菌mRNA的影響尤為嚴重，因為細菌mRNA的半衰期很短，往往只有幾分鐘。二是某些基因在操作過程中(裂解前)被誘導表達，導致這些基因表達增高。
而現(xiàn)在的生物磁珠分離法則更加有效、方便。先用生物素標記的Oligo(dT)和mRNA雜交，再由包被親和素或抗生物素的磁珠捕獲雜交復合物，在外磁場作用下收集磁性粒子，然后將分離的mRNA洗脫下來。除此以外，還可用磁珠法分離特定的mRNA，即以生物素標記的單鏈DNA為探針和目的mRNA雜交，再用帶親和素或抗生物素的磁珠捕獲雜交復合物。這與傳統(tǒng)的選擇雜交法、多聚體核糖免疫沉淀法相比，更加快速、簡便、捕獲率高。所分離的mRNA可用于Nothern印跡、cDNA的合成、RT-PCR和體外翻譯等許多分子生物學的后繼實驗。磁珠法也應用于DNA的分離，區(qū)別只是以生物素標記的DNA探針和目標DNA雜交。
納米粒子以其獨特的性質在生物技術領域：
中的應用前景日益受到人們的關注。磁性納米粒子被用作生物樣品磁場分離介質，在分子生物學、臨床診斷、醫(yī)療等領域中的應用日益廣泛，由于粒徑在納米尺度，粒子具有超順磁性和巨大表面積。普通的磁珠不具備納米粒子的超順磁性和表面效應，將其應用于復雜體系中生物樣品的分離可以分離速度慢、分離效率低、反應專一性受到影響，最為致命的缺陷是不能確保分離樣品的生物活性，而且不能進行微量樣品的分離。
目前尚未見到有在磁性納米粒子的表面修飾能特異性結合生物素的親和素或抗生物素，然后向含有目的核酸特別是mRNA的體系中加入修飾有生物素的探針。待探針與目的核酸或mRNA形成雜交復合物后，加入包覆有親和素或抗生物素的粒子去捕獲雜交復合物，再在外磁場的作用下分離、洗脫DNA或mRNA的技術。

發(fā)明內容所要解決的技術問題本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種用于核酸分離的磁性納米粒子復合物及其制備方法和應用，以克服現(xiàn)有技術中僅以普通粒徑的磁性顆粒來進行核酸分離，由于顆粒表面積小，無法使目標核酸在短時間內高效地獲得分離的缺陷。
技術方案本發(fā)明的技術方案之一是提供一種用于核酸分離的磁性納米粒子復合物，具備內核和外殼的核殼型結構，包括如下的結構(1)由具有超順磁性的磁性納米粒子構成的內核層；(2)包覆內核層的生物學惰性外殼層；(3)外殼層表面為親和素或抗生物素的修飾層。
優(yōu)選其外殼層包覆的修飾層為鏈酶親和素。
上述的用于核酸分離的磁性納米粒子復合物的優(yōu)選技術方案之一為，所說的生物學惰性外殼層的成分為二氧化硅、瓊脂糖、殼聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或者其組合；最優(yōu)選為二氧化硅。
上述的用于核酸分離的磁性納米粒子的優(yōu)選技術方案之二為，所說的內核層的成分為鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或者其組合；最優(yōu)選的成分為鐵的氧化物。
該磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物可以與標記有生物素并且可以特異性識別、結合目的核酸分子的探針一起形成磁性納米粒子生物分子分離系統(tǒng)。
本發(fā)明的技術方案之二是提供一種上述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物的制備方法，包括以下步驟(1)在含內核層和外殼層的形成劑的微乳液體系中，通過油包水型反相微乳液法，形成核殼型磁性納米粒子；(2)用固化劑或交聯(lián)劑對核殼型磁性納米粒子的表面進行修飾；(3)將親和素或抗生物素對步驟(2)中修飾好的磁性納米粒子進行反應。
上述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物的制備方法的優(yōu)選技術方案之一為，步驟(2)所說的固化劑或交聯(lián)劑為聚乙二醇或者戊二醛、甲醛、乙二醛、或冠醚交聯(lián)劑。
11.上述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物的制備方法的優(yōu)選技術方案之一為，步驟(1)所說的形成劑為正硅酸乙酯、瓊脂糖、殼聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烴化合物、丙稀腈、環(huán)氧化合物等。
適用于本發(fā)明的親和素或抗生物素沒有特別的限制。只需能結合修飾在可以特異性識別并結合目的核酸特別是mRNA的探針上的生物素。
核殼型磁性納米粒子內核層的外殼成分除了二氧化硅等無機包裹層以外，還有瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物等有機包裹層。對于選定的外殼成分，可根據(jù)現(xiàn)有技術選用合適的內核層外殼形成劑。例如當外殼成分為二氧化硅時，可選用正硅酸乙酯或其它合適的內核層外殼形成劑。
本發(fā)明的技術方案之三是提供一種上述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物在核酸分離中的應用，包括如下步驟(1)將標記有生物素的核酸探針與含有目標核酸的溶液混合，形成雜交復合物；
(2)加入磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物，與雜交復合物進行反應；(3)在磁場的引導下分離磁性納米粒子，并洗脫目標核酸；或者，包括如下步驟(1)將磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物與標記有生物素的核酸探針溶液混合，形成探針復合物；(2)加入目標核酸溶液，與探針復合物進行反應；(3)在磁場的引導下分離磁性納米粒子，并洗脫目標核酸；上述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物在核酸分離中的應用的優(yōu)選技術方案為，其特征在于，所說的目標核酸為來自于動物、植物或微生物細胞、病毒、人體組織、動物或人全血中的mRNA、DNA、rRNA或者tRNA。
有益效果(1)本發(fā)明使用的磁性納米粒子是單分散性的，不產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，磁性納米粒子的形狀和直徑易于控制。
(2)由于粒徑在納米尺度，粒子具有超順磁性和巨大表面積。利用納米粒子的超順磁性和表面效應，可以大大提高分離速度、分離效率和專一性，確保分離樣品的生物活性，而且可以進行微量樣品的分離。
(3)生物素標記對探針影響較少，探針可以充分、高效地與體系中的目的DNA或mRNA雜交。
(4)親和素和生物素的結合反應呈高度特異性，生物素和親和素一旦結合，則很難分離，這種高度穩(wěn)定的特異結合，可明顯降低或避免反應中可能發(fā)生的非特異性作用。另外，親和素具有四個相同亞基，可以同時以多價橋連結生物素化的探針及其標記物。這種多價放大作用賦予親和素極高的靈敏度。
(5)親和素和生物素間非共價的相互作用很強，親和常數(shù)為1015/mol，結合快，呈不可逆反應，并且對各種試劑的環(huán)境因素不敏感，以致產(chǎn)物可保持高度穩(wěn)定。
(6)操作簡單，整個分離過程約不超過30min，分離得到DNA或者mRNA能很好地用于后繼的實驗。
如本文所用，術語“反相微乳液法”指微乳液法是利用兩種互補相溶的溶劑在表面活性劑的作用下形成一個均勻的乳液，從乳液中析出固體，這樣可使成核、成長、聚結和團聚等過程局限在一個微小的球形液滴內，從而形成球形顆粒。微乳液通常由表面活性劑、助表面活性劑(通常為醇類)、油(通常為碳氫化合物)和水(或電解質的水溶液)組成的透明的各向同性的熱力學穩(wěn)定性體系。其中反相微乳液是指油包水(W/O)型乳液，即水相分散在油相而形成微小的不連續(xù)的“水池”，其大小可控制在幾十到幾百個埃之間。納米粒子的微乳液制備方法正是利用微乳液的“水池”作為“微反應器”，從而達到控制納米粒子的粒徑和形狀。
圖1表面修飾有氨基的磁性粒子的紅外譜圖。3440處的峰對應為N-H伸縮振動峰，1660處對應的是N-H彎曲振動。該圖表明在磁性納米粒子表面已被修飾上了氨基。
圖2表面連接鏈酶親和素的磁性粒子的拉曼圖譜。圖中標出了鏈酶親和素的特征峰，表明磁性納米粒子的表面已被連有鏈酶親和素。
圖3分離出的mRNA的RT-PCR電泳圖。圖中M、a、b分別為分子量標記和兩條擴增產(chǎn)物電泳道，箭頭所指的P條帶為目的基因擴增產(chǎn)物片斷。
具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求
書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如化工產(chǎn)品手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑或者試劑購自上?；瘜W試劑廠，電泳分子量標記購自上海Sangon公司。
實施例1制備磁性納米粒子用二次蒸餾水分別配制FeSO4.7H2O和FeCl3.6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在鐵鹽的混合溶液中Fe2+離子的濃度為0.1～0.2mol/L，F(xiàn)e3+離子的濃度為0.1～0.3mol/L，NaOH溶液的濃度為2～3mol/L。在劇烈攪拌下將體積為混合鹽溶液體積一半的NaOH溶液緩慢地滴加到混合鹽溶液中。將所得到的固體沉淀在40℃～60℃下陳化12h，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數(shù)次，過濾后再在40℃～80℃的條件下干燥24h，在瑪瑙研缽中研磨后即得產(chǎn)物。
實施例2二氧化硅在γ-Fe2O3表面的修飾將TritonX-1 00、正己醇、環(huán)己烷按1∶(1～3)∶(4～6)的比例均勻混合，形成透明穩(wěn)定的微乳液體系。將上述微乳液體系置于超聲波中處理5-60分鐘，再向其中加入0.01～1g的γ-Fe2O3(磁性納米粒子)，用超聲波處理1-30分鐘后取出上層液倒入三頸燒瓶中，攪拌30～60分鐘使之均勻。取1-10mL一定濃度的濃氨水用1-20mL二次蒸餾水稀釋，將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續(xù)攪拌10～60分鐘使氨水均勻分散在微乳液中。1小時后，向微乳液中滴加1～5mL的正硅酸乙酯(內核層外殼形成劑)，同時不斷地攪拌10小時，并將體系的溫度保持在15～40℃之間。向體系中加入丙酮使粒子沉淀，或者將體系靜置過夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。將清洗后的粒子置于300～700℃的條件下鍛燒1～5個小時，收集核殼型磁性納米粒子。
實施例3用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷](AEAPS)修飾磁性納米粒子表面取15mg磁性納米粒子加入10～100mL的甲醇和丙三醇的混合液(甲醇∶丙三醇的體積比為2∶3-2∶1)中，用超聲波處理5～60分鐘；稱取0.01～1gAEAPS([N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷])，用超聲波處理5～60分鐘；將這兩種溶液混合均勻，在10～95℃的條件下反應1-10小時，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接著在100-300℃真空干燥，收集粒子(FSM)。
實施例4
親和素或抗生物素在磁性納米粒子表面的修飾取實施例3中制備的粒子，用磷酸鹽緩沖液(pH為7.0-8.0)洗滌約1-10次(更佳地2-5次)，加至pH為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖體系中。所述的混合溶液用超聲波處理5-60分鐘。
然后取一定量的親和素或抗生物素(與磁性納米粒子的濃度比通常為1∶6-1∶1)，加入到上述粒子的混合溶液中。在0-30℃的反應溫度下反應12-48小時，加入交聯(lián)劑(或固化劑)聚乙二醇、戊二醛、甲醛、乙二醛、或冠醚交聯(lián)劑在體系中的濃度約為0.5％-5％，形成混合溶液，從而將親和素或抗生物素在固定劑的作用下與中間層上的氨基反應，使親和素或抗生物素通過席夫鍵直接連接于中間層。反應結束后，磁性分離所述的粒子，用磷酸鹽緩沖液洗滌約2-3次。這樣得到的包覆有親和素或抗生物素的磁性納米粒子置于磷酸鹽緩沖液中保存?zhèn)溆谩?br> 實施例5將磁性納米粒子應用于mRNA的抽提，并將得到的mRNA進行RT-PCR從1×106-5×106個培養(yǎng)的動物細胞中抽提出約10-100μg的總RNA。將所得的總RNA溶解在500-1000μL無RNase水中，60-70℃加熱1-10min，向其中加入生物素化的Oligo(dT)探針和15-30mL雜交緩沖溶液，冷卻至室溫，在冷卻過程中每隔1-2min輕敲管子底部振蕩一次。然后將混合溶液放置在磁力架上，在外磁場作用下收集磁性納米粒子，再用500-300μL的緩沖溶液洗滌粒子1-5次。向清洗好的粒子中加入50-200μL 60-70℃的去RNase水，粒子重新分散后放置在磁力架上，1-5min后取出清夜，即為含mRNA的水溶液。
對所得的mRNA進行了RT-PCR，擴增片斷為β-actin基因，所選引物序列為上游引物5’GCC TTC GCC TTT GCC GAT CC 3’下游引物5’GGATCC TTC ATG AGG TAG TCA GTC 3’實驗結果如圖3所示。
實施例6將磁性納米粒子應用于DNA的抽提，并將得到的DNA進行PCR從1×106-5×106個培養(yǎng)的動物細胞中抽提出約100μg的總DNA。將所得的總DNA溶解在500-1000μL無DNase水中，60-70℃加熱1-10min，向其中加入生物素化的DNA探針和15-30mL雜交緩沖溶液，冷卻至室溫，在冷卻過程中每隔1-2min輕敲管子底部振蕩一次。然后將混合溶液放置在磁力架上，在外磁場作用下收集磁性納米粒子，再用500-300μL的緩沖溶液洗滌粒子1-5次。向清洗好的粒子中加入50-200μL 60-70℃的去DNase水，粒子重新分散后放置在磁力架上，1-5min后取出清夜，即為含DNA的水溶液。
對所得的DNA進行了PCR，獲得陽性的擴增片斷p53基因，所選引物序列為上游引物5’TCC GAG TGG AAG GAA AT 3’下游引物5’TCC GAG TGG AAG GAA AT 3’
序列表<110>上海師范大學<120>一種用于核酸分離的磁性納米粒子復合物及其制法和應用<140>2006100231444<141>2006-04-13<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>β-actin基因片斷<222>(1)..(20)<400>1gccttcgcct ttgccgatcc 20<210>2<211>24<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>β-actin基因片斷<222>(1)..(24)<400>2ggatccttca tgaggtagtc agtc 24<210>3<211>17<212>DNA
<213>Homo sapiens<220>
<221>p53基因片斷<222>(1)..(17)<400>3tccgagtgga aggaaat 17<210>4<211>17<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>p53基因片段<222>(1)..(17)<400>4tccgagtgga aggaaat 17
權利要求
1.一種用于核酸分離的磁性納米粒子復合物，具備內核和外殼的核殼型結構，包括如下的結構(1)由具有超順磁性的磁性納米粒子構成的內核層；(2)包覆內核層的生物學惰性外殼層；(3)外殼層表面為親和素或抗生物素的修飾層。
2.根據(jù)權利要求
1所述的用于核酸分離的磁性納米粒子，其特征在于，所說的生物學惰性外殼層的成分為二氧化硅、瓊脂糖、殼聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或者其組合。
3.根據(jù)權利要求
2所述的用于核酸分離的磁性納米粒子，其特征在于，所說的生物學惰性外殼層成分為二氧化硅。
4.根據(jù)權利要求
1所述的用于核酸分離的磁性納米粒子，其特征在于，所說的內核層的成分為鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或者其組合。
5.根據(jù)權利要求
4所述的用于核酸分離的磁性納米粒子，其特征在于，所說的內核層的成分為鐵的氧化物。
6.一種權利要求
1所述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物的制備方法，包括以下步驟(1)在含內核層和外殼層的形成劑的微乳液體系中，通過油包水型反相微乳液法，形成核殼型磁性納米粒子；(2)用固化劑或交聯(lián)劑對核殼型磁性納米粒子的表面進行修飾；(3)將親和素或抗生物素對步驟(2)中修飾好的磁性納米粒子進行反應。
7.根據(jù)權利要求
6所述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物的制備方法，其特征在于，步驟(2)所說的固化劑或交聯(lián)劑為聚乙二醇或者戊二醛、甲醛、乙二醛、或冠醚交聯(lián)劑。
8.根據(jù)權利要求
6所述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物的制備方法，其特征在于，步驟(1)所說的形成劑為正硅酸乙酯、瓊脂糖、殼聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烴化合物、丙稀腈、環(huán)氧化合物等。
9.一種權利要求
1所述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物在核酸分離中的應用，包括如下步驟(1)將標記有生物素的核酸探針與含有目標核酸的溶液混合，形成雜交復合物；(2)加入磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物，與雜交復合物進行反應；(3)在磁場的引導下分離磁性納米粒子，并洗脫目標核酸；或者，包括如下步驟(1)將磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物與標記有生物素的核酸探針溶液混合，形成探針復合物；(4)加入目標核酸溶液，與探針復合物進行反應；(5)在磁場的引導下分離磁性納米粒子，并洗脫目標核酸。
10.權利要求
9所述的磁性納米粒子—親和素或抗生物素復合物在核酸分離中的應用，其特征在于，所說的目標核酸為來自于動物、植物或微生物細胞、病毒、人體組織、動物或人全血中的mRNA、DNA、rRNA或者tRNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種用于核酸分離的磁性納米粒子復合物及其制備方法和應用，該復合物具有如下的三層結構(1)由具有超順磁性的磁性納米粒子構成的內核層；(2)包覆內核層的生物學惰性外殼層；(3)外殼層表面為親和素或抗生物素的修飾層。本發(fā)明還提供該復合物分離核酸特別是mRNA的方法。本發(fā)明的磁性納米粒子分離系統(tǒng)可簡單、有效、方便、快捷地分離微量核酸。
文檔編號C07H21/00GK1995052SQ200610023144
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日
發(fā)明者沈鶴柏, 徐文濤, 周海清 申請人:上海柏匯申生物科技有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan