專利名稱：一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其制備方法。
背景技術(shù)：
大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是臨床中常使用的一類抗生素，它們以其抗菌譜廣，抗菌效果明顯，療效確定而廣為使用，目前對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的主要研究方向有①尋找全新結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)具有更高抗菌效價，更好抗腫瘤療效，更廣譜的抗生素；②探索具有抗菌活性以外的生理活性物質(zhì)，開辟新用途如胃動素樣作用、免疫抑制劑等；③繼續(xù)修飾現(xiàn)有的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如紅霉素等的結(jié)構(gòu)，使藥物能用于耐藥菌的感染等。這其中原因之一是由于多年的臨床應(yīng)用，很多致病菌對現(xiàn)有的大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生了耐藥性，如金葡菌、鏈球菌，肺炎球菌等，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的臨床應(yīng)用受到了限制，再加上很多大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，體內(nèi)吸收、分布、代謝不盡人意，因此有必要對大環(huán)內(nèi)酯抗生素進(jìn)行深入地的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，我們命名為麥拓萊霉素，它對多種細(xì)菌有較強的抑制作用，對紅霉素耐藥的金葡菌亦有作用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它具有如下結(jié)構(gòu) 一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(I)(麥拓萊霉素)的制備方法，該方法包括下列步驟(1)菌種培養(yǎng)發(fā)酵
①培養(yǎng)基(g/l)的制備取葡萄糖2.0～8.0g、可溶性淀粉30.0～60.0g、蛋白胨2.0～6.0g、玉米漿1.0～5.0ml、K2HPO40.1～0.6g、MgSO4·7H2O 0.1～0.6g、NaCl 0.4～1.0g、加水至1000ml在pH6.0，121℃滅菌15min；②發(fā)酵把天津市英捷科技發(fā)展有限公司出售的藤黃灰鏈霉菌菌株(streptomyces luteogriseus via.099)，加到滅菌后的培養(yǎng)基中，加菌種量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10％，搖瓶發(fā)酵，150-300轉(zhuǎn)/分，28℃，發(fā)酵3～5天；(2)發(fā)酵液處理①發(fā)酵液經(jīng)3800～5000轉(zhuǎn)/分離心，15～30分；②以等體積乙酸乙酯萃取4～6次，乙酸乙酯部分經(jīng)1∶1～2∶1體積的水反萃，去除色素雜質(zhì)；③回收乙酸乙酯，得到具有活性部位的褐色油狀物；④進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇1∶0到0∶1梯度洗脫，收集二氯甲烷∶甲醇為11∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；⑤將粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素經(jīng)過制備高效液相純化，收集活性峰段，冷凍干燥，得到一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素純品。
在培養(yǎng)基的制備中最好是葡萄糖為5.0g、可溶性淀粉為40.0g、蛋白胨為4.0g、玉米漿為2.0ml、K2HPO4為0.5g、MgSO4·7H2O為0.5g、NaCl為0.5g。
搖瓶發(fā)酵時的轉(zhuǎn)數(shù)為160轉(zhuǎn)/分為宜，發(fā)酵時間以4天為宜。
發(fā)酵液分離轉(zhuǎn)速以4800轉(zhuǎn)/分為宜，所述的分離時間為20分為宜，所述的乙酸乙酯的萃取次數(shù)以5次為宜。
一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素純品經(jīng)分析型HPLC檢測，色譜柱(300×3.9mm，i.d.5μm，μBond-pakC18)；乙睛水體系，梯度洗脫，檢測波長254nm，流速0.5ml/min，證實一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素純品純度高于96％。
一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(麥拓萊霉素)經(jīng)實驗證明，它對細(xì)菌有抑制作用，并且生物效價高于同類的紅霉素、乙酰螺旋霉素、及琥乙紅霉素，同時，對耐藥金黃色葡萄球菌有抑菌活性。


圖1為紫外吸收光譜；圖2為紅外吸收光譜；圖3為1H核磁共振譜；圖4為13C核磁共振譜；圖5；為DEPT；圖6為HSQC(單核多量子相關(guān))；圖7為HMBC(異核多鍵相關(guān))；圖8為H-H COSY；圖9為NOESY差譜；圖10為快原子轟擊高分辨質(zhì)譜；圖11為一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的效價工作曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實施例1化合物(I)的制備(1)菌種培養(yǎng)發(fā)酵①培養(yǎng)基(g/l)的制備取葡萄糖5.0g、可溶性淀粉40.0g、蛋白胨4.0g、玉米漿2.0ml g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、加水至1000ml在pH6.0，121℃滅菌15min；②發(fā)酵把天津市英捷科技發(fā)展有限公司出售的藤黃灰鏈霉菌菌株(streptomyces luteogriseus via.099)加入滅菌后的培養(yǎng)基中，加菌種量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10％，搖瓶發(fā)酵，160轉(zhuǎn)/分，28℃，發(fā)酵4天；(2)發(fā)酵液處理①發(fā)酵液經(jīng)4800轉(zhuǎn)/分，離心，20分；②以等體積乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯部分經(jīng)2∶1體積的水反萃，去除色素雜質(zhì)；③回收乙酸乙酯，得到具有活性部位的褐色油狀物；④進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇1∶0到0∶1梯度洗脫，收集二氯甲烷∶甲醇為11∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；⑤將粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素經(jīng)過制備高效液相純化，收集活性峰段，冷凍干燥，得到一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素純品。
每2升的發(fā)酵液可得到0.05g的目的產(chǎn)物。
如上所得的本發(fā)明化合物，具有下述理化及生物性質(zhì)1.性狀淡黃色結(jié)晶或類白色粉末。
2.熔點123±1℃(乙睛水體系為干燥前溶劑)。
3.分子量分子量為600.3047。
4.分子式分子式為C32H44N2O9。
5.元素分析C 63.98％、H 7.38％、N 4.66％、0 23.97％。
6.紫外吸收光譜UVλmax252，337(乙醇溶劑)證明分子結(jié)構(gòu)中有α，β不飽和共軛，二烯體系。
7.紅外吸收光譜(KBr)IR(3590，3421，2990，2932，1704，1622，1568，1444，1398，1297，1239，1206，982，933，750cm-1wavelength)證明分子結(jié)構(gòu)中有羥基，羰基，酰胺基，順式雙鍵，反式雙鍵，氧雜三元環(huán)，及氧雜六元環(huán)等。
1H譜、13C譜、HSQC(異核單量子相關(guān))、HMBC(異核多鍵相關(guān))、NOESY差譜、H-H COSY(同核位移相關(guān)譜)、快原子轟擊高分辨質(zhì)譜分析(HRFAB-MS)M+Na＝623.2930。證實分子量為600.3047；分子式為C32H44N2O9鑒定該化合物為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，為一類全新的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。該抗生素可與多種酸成鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等。
實施例2實施例1中制備的化合物對枯草芽孢桿菌的抑菌活性測定。以枯草芽孢桿菌為測活菌，選取以下陽性對照藥紅霉素(天津金世制藥有限公司，批號020302)；乙酰螺旋霉素(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司新新制藥廠，批號030104)；利君沙(琥乙紅霉素，西安利君制藥股份有限公司，批號0303075-14)；根據(jù)牛津杯碟法，瓊脂膠平面擴散，24小時后，測量其抑菌圈直徑。
采用相同的欲比較樣品(2毫克/毫升)和本發(fā)明實施例1所制備的化合物(2毫克/毫升)的濃度，測其抑菌圈，本發(fā)明化合物的抑菌圈遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陽性藥材的抑菌圈。再根據(jù)本發(fā)明實施例1所制備的化合物的效價工作曲線(圖11)反推其與陽性藥材相同抑菌圈所對應(yīng)的濃度。我們測的本發(fā)明實施例1所制備的化合物的最低抑菌濃度為0.25微克/毫升。結(jié)果表明，本發(fā)明的抗生素的生物效價2倍于紅霉素效價；3倍于乙酰螺旋霉素效價；1.5倍于利君沙(琥乙紅霉素)效價。
實施例3實施例1所制備的化合物對耐藥金葡菌亦有作用。
對金黃色葡萄球菌(Staphylcoccus aureusATCC29213)的最低抑菌濃度(MIC)為12μg/ml。
對羅紅霉素抗性肺炎鏈球菌(Roxithromycin-resistant Streptococcus pneumoniae，RRSP)的最低抑菌濃度(MIC)為0.5μg/ml。
以上菌種均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所保存。
實施例4化合物(I)的制備(1)菌種培養(yǎng)發(fā)酵①培養(yǎng)基(g/l)的制備取葡萄糖2.0g、可溶性淀粉30.0g、蛋白胨2.0g、玉米漿1.0mlg、K2HPO40.1g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaCl 0.4g、加水至1000ml在pH6.0，121℃滅菌15min；②發(fā)酵把天津市英捷科技發(fā)展有限公司出售的藤黃灰鏈霉菌菌株(streptomyces luteogriseus via.099)菌加入滅菌后的培養(yǎng)基中，加菌種量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10％，搖瓶發(fā)酵，150轉(zhuǎn)/分，28℃，發(fā)酵3天；(2)發(fā)酵液處理①發(fā)酵液經(jīng)3800轉(zhuǎn)/分，離心，30分；②以等體積乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯部分經(jīng)1∶1體積的水反萃，去除色素雜質(zhì)；③回收乙酸乙酯，得到具有活性部位的褐色油狀物；④進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇1∶0到0∶1梯度洗脫，收集二氯甲烷∶甲醇為11∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；⑤將粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素經(jīng)過制備高效液相純化，收集活性峰段，冷凍干燥，得到一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素純品。
實施例5化合物(I)的制備(1)菌種培養(yǎng)發(fā)酵
①培養(yǎng)基(g/l)的制備取葡萄糖8.0g、可溶性淀粉60.0g、蛋白胨6.0g、玉米漿5.0mlg、K2HPO40.6g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 1g、加水至1000ml在pH6.0，121℃滅菌15min；②發(fā)酵把天津市英捷科技發(fā)展有限公司出售的藤黃灰鏈霉菌菌株(streptomyces luteogriseus via.099)菌加入滅菌后的培養(yǎng)基中，加菌種量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10％，搖瓶發(fā)酵，300轉(zhuǎn)/分，28℃，發(fā)酵5天；(2)發(fā)酵液處理①發(fā)酵液經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分，離心，15分；□以等體積乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯部分經(jīng)2∶1體積的水反萃，去除色素雜質(zhì)；回收乙酸乙酯，得到具有活性部位的褐色油狀物；□進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇1∶0到0∶1梯度洗脫，收集二氯甲烷∶甲醇為11∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；將粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素用經(jīng)過制備高效液相純化，收集活性峰段，冷凍干燥，得到一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素純品。
權(quán)利要求
1.一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它具有如下結(jié)構(gòu)
2.一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的制備方法，其特征是該方法包括如下步驟(1)菌種培養(yǎng)發(fā)酵①培養(yǎng)基(g/l)的制備取葡萄糖2.0～8.0g、可溶性淀粉30.0～60.0g、蛋白胨2.0～6.0g、玉米漿1.0～5.0ml、K2HPO40.1～0.6g、MgSO4·7H2O 0.1～0.6g、NaCl 0.4～1.0g、加水至1000ml，滅菌；②發(fā)酵把重量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的8～12％的藤黃灰鏈霉菌菌株加入滅菌后的培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵，150～300轉(zhuǎn)/分，25～35℃，發(fā)酵3～5天；(2)發(fā)酵液處理①發(fā)酵液經(jīng)3800～5000轉(zhuǎn)/分，離心，15～30分；②以等體積乙酸乙酯萃取4～6次，乙酸乙酯部分經(jīng)1∶1～2∶1體積的水反萃，去除色素雜質(zhì)；③回收乙酸乙酯，得到具有活性部位的褐色油狀物；④進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇1∶0到0∶1梯度洗脫，收集二氯甲烷∶甲醇為11∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；⑤將粗品一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素經(jīng)過制備高效液相純化，收集活性峰段，冷凍干燥，得到一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的制備方法，其特征是所述的葡萄糖為5.0g、可溶性淀粉為40.0g、蛋白胨為4.0g、玉米漿為2.0ml、K2HPO4為0.5g、MgSO4·7H2O為0.5g、NaCl為0.5g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的制備方法，其特征是所述的搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)為160轉(zhuǎn)/分，所述搖瓶發(fā)酵溫度為28℃，所述發(fā)酵時間為4天。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的制備方法，其特征是所述的發(fā)酵液分離轉(zhuǎn)速為4800轉(zhuǎn)/分，所述的分離時間為20分，所述的乙酸乙酯的萃取次數(shù)為5次。
全文摘要
本發(fā)明公開一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其制備方法，該方法包括如下步驟(1)菌種培養(yǎng)發(fā)酵①培養(yǎng)基的制備取葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、玉米漿、K
文檔編號C12P17/18GK1488633SQ0313057
公開日2004年4月14日 申請日期2003年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月15日
發(fā)明者元英進(jìn), 王志平, 王蕾, 李霞, 范晉勇 申請人:天津大學(xué)