專利名稱：青菜雜交種dna指紋圖譜的建立方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青菜種子鑒定技術(shù)，具體地說是青菜雜交種DNA指紋圖譜的建立方法 和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，我國生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的青菜(Brassic campestris L. ssp. Chinensis (L.) Makino)品種許多為雜種一代。雜種一代能綜合親本的許多優(yōu)良性狀，經(jīng)濟效益較好。但是在制種過程中會由于管理措施不當和自交不親和性本身的缺陷而常常產(chǎn)生 自交種子，即假雜種，導(dǎo)致種子純度下降。因此，提高雜交種純度是雜種優(yōu)勢利用研究領(lǐng)域 的重要課題。目前，品種鑒定和種子純度分析方法大致有三種，即大田形態(tài)、生化標記和DNA 指紋圖譜鑒定法。傳統(tǒng)的大田鑒定法以種子、幼苗、葉、花、果實、花粉等組織器官的顏色、形 態(tài)等農(nóng)藝性狀作為鑒定的觀測指標，在生產(chǎn)實踐中雖然是一種較為可行的方法，但大田鑒 定需要額外占用土地，周期長、花費大，不僅受季節(jié)限制，而且很多性狀的表現(xiàn)受栽培措施 及環(huán)境因子的影響，鑒定者的觀察經(jīng)驗也制約著鑒定的準確性。大田鑒定最大的缺陷是不 能及時提供種子純度信息，不能在種子大量交易前提供有關(guān)種子的質(zhì)量信息，對種子質(zhì)量 不能起到預(yù)先監(jiān)督的作用。生化鑒定方法包括蛋白質(zhì)電泳和同工酶電泳，已得到日益廣泛 的應(yīng)用，但不能完全顯示品種間的多態(tài)性，難以對親緣關(guān)系較近的品種進行有效的區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種青菜雜交種DNA指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn) 有技術(shù)存在的不足。本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的DNA指紋圖譜鑒定法是以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標記方法，可以彌補和克服 在種子純度的形態(tài)學鑒定及同工酶、種子蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題。本發(fā)明利用 ISSR、SRAP技術(shù)構(gòu)建了青菜雜交種與其親本的DNA指紋圖譜，可以為青菜雜交種的鑒定和 純度檢測提供科學依據(jù)，進而保護生產(chǎn)者和使用者的合法權(quán)益。本發(fā)明的青菜雜交種及其親本的DNA指紋圖譜，是由“1”和“0”組成的數(shù)據(jù)。 使用引物S306，青菜雜交種母本、Fl和父本的擴增數(shù)據(jù)分別為101111111,101101111和 111110111。使用引物 S334，數(shù)據(jù)分別為 1011111111,1111111011 和 1011111010。使用引 物 UBC810，數(shù)據(jù)分別為 1101001111,1101111111 和 1011011111。使用引物 UBC812，數(shù)據(jù)分 別為 10101111111011,11010111111111 和 11010111111110。使用引物 UBC834,數(shù)據(jù)分另Ij 為 101110011101011,101110101011111 和 110111101010011。使用引物 M1-E4，數(shù)據(jù)分別為 111001011111011101101111、111101111111101111011011 和 111111011110011111011011。 使用引物 M4-GA18，數(shù)據(jù)分別為 10110111111111111111111101111、 10111111111111111111110111111 和 11111111110111111111100101011。其中所述數(shù)字“1” 表示圖譜中某個位置上有擴增帶存在，數(shù)字“0”表示在某個位置上沒有擴增條帶存在。
所說的青菜雜交種和親本可以采用上海市農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所公開銷售的產(chǎn)
品 ；青菜DNA指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟1)提取及純化青菜基因組的DNA ；2)用獲得的青菜DNA為模板進行RAPD、ISSR、SRAP分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性擴增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無構(gòu)建供試材料DNA 指紋圖譜。其中所述青菜雜交種及其親本都有其特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開來。所 述RAPD、ISSR、SRAP擴增中采用的引物是由上海生工生物工程有限公司合成的寡核 苷酸引物。RAPD擴增采用的引物為S306 :ACGCCAGAGG, S334 :TCGGAGGTTC。ISSR擴增 中采用的引物為 UBC810 :GAGAGAGAGAGAGAGAT, UBC812 :GAGAGAGAGAGAGAGAA，UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT(Y = C，Τ)。SRAP 擴增采用的引物為 Ml :TGAGTCCAAACCGGATA，E4 GACTGCGTACGAATTTGA, M4 :TGAGTCCAAACCGGACC, EA18 :GGCTTGAACGAGTGACTGA。本發(fā)明的DNA指紋圖譜可以應(yīng)用于青菜雜交種種子純度的鑒定。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明創(chuàng)建了青菜雜交種及其親本的DNA指紋圖譜，公開了用DNA指紋分析技 術(shù)對青菜種子鑒定的研究結(jié)果，其建立方法能從遺傳本質(zhì)上對青菜種子進行鑒定，因此準 確、可靠。2、采用本發(fā)明，在對青菜種子樣品進行真實檢測時，用目前廣泛應(yīng)用的快速、微量 DNA提取法提取待測樣品的DNA，用提取的DNA作為模板，進行RAPD、ISSR、SRAP分析，在幾 個小時內(nèi)就可以知道該樣品的DNA指紋，因此，就能迅速判斷出它的真實性。3、由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表示，看起來比較直觀、易懂；并由于轉(zhuǎn) 換成了數(shù)碼形式，便于計算機識讀和分析。


附圖為本發(fā)明建立的RAPD、ISSR、SRAP指紋圖譜，其中M為DGL2000DNA標識；4 為青菜雜交種母本；5為青菜雜交種；6為青菜雜交種父本；箭頭標出的為互補型特征片段。 引物順序從 A G 依次為M1-E4、M4-GA18、S306、S334、UBC810、UBC812 和 UBC834。
具體實施例方式實施例1本實施例采用SDS法提取青菜品種“新綠”及其親本的基因組DNA，通過RAPD、 ISSR、SRAP分子標記方法構(gòu)建其DNA指紋圖譜用于種子純度鑒定。具體操作如下1、選用的試驗材料材料為青菜雜交種“新綠”及其親本。2、青菜DNA的提取及純化按如下程序提取各個青菜材料的基因組DNA 取新鮮組織2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml離心管，加入8ml提取液(IOOmM Tris pH 8. 0,50mM EDTA, 500mM NaCl，1. 5% SDS)，65°C情況下 30 分鐘，不時顛倒混勻，加2.5ml 5M乙酸鉀冰浴10分鐘，加· 5ml氯仿，顛倒混勻，IOOOOrmp離心8分鐘，取上清移入 新管，加2/3體積預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，-20°C置1-2小時，挑出絮狀白色DNA，70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于IOOul (或適量)TE中，并在1 %瓊脂糖凝膠上電泳，用標準λ DNA作對照， 估算青菜DNA樣品的濃度，獲得高純度青菜DNA。3、用獲得的高純度青菜DNA為模板進行分子標記分析RAPD 擴增反應(yīng)采用 20yL 的反應(yīng)體系，其中 25mmol/L MgC12 2. 0 μ 1,10XPCR Buffer 2. 0μ 1, lOmmol/L dNTP 0. 5 μ l,5U/y 1 Taq E 0. 2 μ 1，0. 1 μ mol/L 引物 3 μ 1， lOng/μ 1模板DNA 3 μ 1，滅菌雙蒸水9. 3 μ 1。擴增程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 lmin，37°C退火 lmin，72°C延伸 1.5min，40 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin 后 4°C保存。PCR 產(chǎn)物 在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳1.5h，EB染色，Gel DocTM EQ 170-8060凝膠成像儀進行觀察并 拍照分析。ISSR 擴增反應(yīng)采用 20μ L 的反應(yīng)體系，其中 25mmol/L MgC122. 0 μ L, 10XPCR Buffer 2. 0μ L, lOmmol/L dNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，0· 1 μ mol/L 弓 |物
3.OyL, IOng/ μ L模板DNA 3. 0 μ L,滅菌雙蒸水9. 4 μ L，加蓋一滴礦物油進行擴增。擴增程 序為 94°C 預(yù)變性 5min ；94°C 變性 lmin，52°C 退火 lmin，72°C 延伸 1. 5min，;35 個循環(huán)；72°C 延 伸IOmin后4°C保存。擴增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。PCR結(jié)果檢測方法同 RAPD。SRAP 擴增反應(yīng)采用 20μ L 的反應(yīng)體系，其中 25mmol/L MgC122. 0 μ L, 10XPCR Buffer 2. 0μ L, lOmmol/L dNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，0· 1 μ mol/L 弓 |物 各3. 0 μ L，IOng/ μ L模板DNA 3. 0 μ L,滅菌雙蒸水6. 4 μ L，加蓋一滴礦物油進行擴增。擴增 程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，5個循環(huán)；94°C 變性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，35個循環(huán)；72°C延伸IOmin后4°C保存。擴增 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物使用6%聚丙烯酰胺膠電 泳1. 5小時，采用快速銀染法染色定影后拍照。4、引物篩選使用150個RAPD引物、100個ISSR引物和30對SRAP引物對樣品DNA進行PCR擴 增，其中有107個RAPD引物、52個ISSR引物和全部的30對SRAP弓丨物能擴增出清晰的條帶， 但大多數(shù)引物的擴增結(jié)果在雙親及雜交種之間是一致的，不能起到鑒別的作用。最終篩選 出 3 個 ISSR 引物(UBC810、UBC812 和 UBC834)和 2 對 SRAP 引物(M1-E4 和 M4-GA18)可擴 增出雙親的互補特征帶，將雙親和Fl區(qū)分出來，另外還有2個RAPD引物(S306和S334)可 以將“新綠”的雙親和Fl區(qū)分開(見圖)。其中引物組合M1-E4在約1400bp、700bp、500bp 和370bp四處共擴增出4條雙親的互補特征帶；引物組合M4-GA18在約1300bp、700bp和 150bp處分別擴增出1條互補特征帶；引物UBC810在約1400bp和800bp處擴增出2條互 補帶特征帶；引物UBC812在約1000bp、450bp和400bp處共擴增出3條互補帶特征帶；引物 UBC834在約1500bp和800bp兩處擴增出互補帶特征帶，并在750bp左右擴增出1條親本一 的特異帶，在約1600bp和IOOObp擴增出2條親本二的特異帶，3條親本特異帶在Fl中均沒 有出現(xiàn)；引物S306在600bp左右擴增出1條親本一的特異帶，在Fl中也擴增出同樣條帶， 在800bp左右同時在雙親中擴增出1條多態(tài)帶，但在Fl中未見擴增；引物S334在約500bp 處擴增出1條親本一的特異帶，在Fl中有同樣的表現(xiàn)，另外在約600bp處僅于親本一中擴增出1條特異帶，在約1600bp處擴增出Fl特異帶。由此可見，7個(對)引物均能對“新 綠”的雙親和Fl進行有效鑒別。5、數(shù)字指紋的建立根據(jù)上述三種分子標記指紋圖譜，以1和0分別代表某個等位基因位點擴增 DNA條帶的有無，按照從上到下即由大片段向小片段的讀帶方向，將分子標記指紋圖譜 轉(zhuǎn)換為由1和0組成的字符串，即構(gòu)成數(shù)字指紋，是由“1”和“0”組成的數(shù)據(jù)。使用引 物S306，“新綠”青菜的母本、雜交種和父本的擴增數(shù)據(jù)分別為101111111、101101111和 111110111。使用引物 S334，數(shù)據(jù)分別為 1011111111,1111111011 和 1011111010。使用引 物 UBC810，數(shù)據(jù)分別為 1101001111、1101111111 和 1011011111。使用引物 UBC812，數(shù)據(jù)分 別為 10101111111011,11010111111111 和 11010111111110。使用引物 UBC834,數(shù)據(jù)分另Ij 為 101110011101011,101110101011111 和 110111101010011。使用引物 M1-E4，數(shù)據(jù)分別為 111001011111011101101111、111101111111101111011011 和 111111011110011111011011。 使用引物 M4-GA18，數(shù)據(jù)分別為 10110111111111111111111101111、 10111111111111111111110111111 和 11111111110111111111100101011。實施例2本發(fā)明的DNA指紋圖譜用于“新綠”種子純度的鑒定從制種基地生產(chǎn)的“新綠”雜交種中隨機抽取50-80個單株，用微量DNA提取法提 取各單株樣品的DNA，用提取的DNA作為模板，用相應(yīng)的引物對其進行PCR擴增和電泳分析。 如利用UBC812引物分析查出的單株DNA指紋是“11010111111111”即為“新綠”真雜種株， DNA指紋是“10101111111011”或“11010111111110”即為“新綠”親本自交株，也就是假雜種 株。再如利用M1-E4引物分析查出的單株DNA指紋是“111101111111101111011011”即為“新 綠，，真雜種株，DNA 指紋是 “111001011111011101101111” 或 “111111011110011111011011” 即為“新綠”親本自交株，也就是假雜種株。然后用假雜種株數(shù)除以總分析的株數(shù)，即可獲 得制種基地生產(chǎn)的青菜雜交種的純度，較大田種植調(diào)查純度既省時又便捷，可以為這些青 菜雜交種子的銷售及時提供純度信息。如果鑒定的純度低于85%，就不能夠作為種子進行 銷售，以避免假種子傷農(nóng)事件的發(fā)生。如果鑒定的種子純度高于95%以上，就可以作為精品 種子銷售，優(yōu)質(zhì)優(yōu)價，使農(nóng)民和種子經(jīng)銷商均獲得好的經(jīng)濟效益。
權(quán)利要求
1.青菜DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟1)提取及純化青菜基因組的DNA；2)用獲得的青菜DNA為模板進行RAPD、ISSR、SRAP分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性擴增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無構(gòu)建供試材料DNA指紋 圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，青菜雜交種及其親本的DNA指紋圖譜， 是由“ 1”和“0”組成的數(shù)據(jù)，使用引物S306，青菜雜交種母本、雜交種和父本的擴增數(shù)據(jù) 分別為 101111111,101101111 和 111110111。使用引物 S334,數(shù)據(jù)分別為 1011111111、 1111111011 和 1011111010。使用引物 UBC810,數(shù)據(jù)分別為 1101001111,1101111111 和 1011011111。使用引物 UBC812,數(shù)據(jù)分別為 10101111111011、11010111111111 和 11010111111110。使用引物 UBC834,數(shù)據(jù)分別為 101110011101011、101110101011111 和 110111101010011。使用引物 M1-E4,數(shù)據(jù)分別為 111001011111011101101111、 111101111111101111011011 和 111111011110011111011011。使用引物 M4-GA18，數(shù) 據(jù)分別為 10110111111111111111111101111,10111111111111111111110111111 和 11111111110111111111100101011。其中所述數(shù)字“1”表示圖譜中某個位置上有擴增帶存 在，數(shù)字“0”表示在某個位置上沒有擴增條帶存在。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RAPD擴增采用的引物為S306 ACGCCAGAGG, S334 :TCGGAGGTTC。ISSR 擴增中采用的引物為 UBC810 :GAGAGAGAGAGAGAGAT， UBC812 :GAGAGAGAGAGAGAGAA, UBC834 :AGAGAGAGAGAGAGAGYT (Y = C，Τ)。SRAP 擴增采用的 引物為 Ml :TGAGTCCAAACCGGATA, E4 :GACTGCGTACGAATTTGA, M4 :TGAGTCCAAACCGGACC，EA18 GGCTTGAACGAGTGACTGA。
4.權(quán)利要求2所述的方法建立的DNA指紋圖譜的應(yīng)用，其特征在于，用于青菜雜交種種 子純度的鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種青菜雜交種及其親本DNA指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。建立方法包括1)青菜DNA的提取及純化；2)用獲得的高純度青菜DNA為模板進行RAPD、ISSR、SRAP分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性擴增條帶構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜；在DNA指紋圖譜中青菜雜交種及其親本都有特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開來。由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表示，看起來比較直觀、易懂；并將其轉(zhuǎn)換成數(shù)碼表示形式，便于計算機識讀和分析。本發(fā)明能從遺傳本質(zhì)上對青菜雜交種的種子純度鑒定，結(jié)果準確、可靠，檢測迅速。
文檔編號C12Q1/68GK102108393SQ20091020062
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者朱玉英, 繆體云, 薄天岳, 陳錦秀, 馬金駿 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院, 上?？屏⑻剞r(nóng)科(集團)有限公司