一種測定Kappa游離輕鏈濃度的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定Kappa游離輕鏈濃度的試劑盒及方法。該試劑盒包括反應(yīng)緩沖液和Kappa游離輕鏈抗體溶液，所述的反應(yīng)緩沖液中氯化鈉的濃度為1250～2400mmol/L。本發(fā)明的試劑盒解決了Kappa游離輕鏈比濁測定中的臨床標(biāo)本線性差的問題，為臨床醫(yī)生提供可靠的Kappa游離輕鏈測定結(jié)果作為診斷參考，以便充分發(fā)揮膠乳增強(qiáng)免疫比濁方法速度快，通量高的優(yōu)勢，縮短檢測時間，利于臨床應(yīng)用和病人診斷。
【專利說明】一種測定Kappa游離輕鏈濃度的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種測定Kappa游離輕鏈濃度的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫球蛋白(Ig)輕鏈分為K (kappa)和λ (lambda) 2個型別，每個Ig分子上只有一個型別的輕鏈，人類K (kappa)和λ (lambda)的比例為6:4。輕鏈為能自由通過腎小球基底膜的小分子蛋白質(zhì)，在腎小管被重吸收回到血液循環(huán)中，所以正常人尿中只有少量輕鏈存在。當(dāng)人體發(fā)生代謝失調(diào)和多發(fā)性骨髓瘤時，血液中出現(xiàn)大量游離輕鏈，并由尿中排出，即為Bence-Jones蛋白(本周蛋白)。在正常人體內(nèi)，血清κ型游離輕鏈為3?19mg/L, λ型游離輕鏈為6?26mg/L, κ/λ比值為0.26?1.65。異常情況的κ型游離輕鏈以及和K/λ比值、或異常λ型游離輕鏈和K /λ比值、或同時三者均異常等情況，對單克隆性Y球蛋白增多癥(monoclonal gammopathies, MGP)的敏感性為88%?98% ;對非分泌性骨髓瘤(nonsecretory myeloma, NSM)的敏感性為65%?70%,有助于單克隆輕鏈病、AL-淀粉樣變的早期診斷，也可用于化療或自身外周血干細(xì)胞移植后是否復(fù)發(fā)的監(jiān)測，如果化療或移植效果好，則病患血清K型游離輕鏈、λ型游離輕鏈以及K/λ比值均在正常水平或相比治療前有明顯改善。
[0003]膠乳增強(qiáng)比濁方法可在全自動生化儀上測定K型游離輕鏈，速度快、通量高。對于游離輕鏈的測定，國內(nèi)目前主要使用英國Binding site公司的Freelite系列測定試劑，可以通過膠乳增強(qiáng)比池方法測定Kappa游離輕鏈；但在臨床應(yīng)用中，F(xiàn)reelite系列試劑存在大量的臨床標(biāo)本稀釋不成線性問題，這些標(biāo)本測定結(jié)果明顯不符合臨床癥狀，目前在國內(nèi)醫(yī)院推廣應(yīng)用很有限。(注:稀釋成線性是指按照一定比例手工使用生理鹽水稀釋臨床標(biāo)本，測定稀釋后標(biāo)本的結(jié)果應(yīng)該與按照原始濃度和稀釋比例計算的理論結(jié)果偏差在正負(fù)20%以內(nèi)。線性也為體外診斷試劑的注冊基本要求之一，通常稀釋不成線性的標(biāo)本結(jié)果是不可靠的。造成線性問題的主要原因有試劑配方抗血液成分干擾問題、抗體特異性問題等
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[0004]同時，發(fā)明人使用按照常規(guī)方式制備的Kappa游離輕鏈試劑，在未使用該特殊發(fā)明方法時也出現(xiàn)與Freelite試劑類似的臨床標(biāo)本稀釋不成線性問題情況；由于不論是Freelite系列Kappa游離輕鏈測定試劑還是發(fā)明人自行制備的Kappa游離輕鏈試劑,均存在臨床標(biāo)本稀釋不成線性問題，因此，可以認(rèn)為臨床標(biāo)本稀釋是否成線性是Kappa游離輕鏈比濁測定試劑盒制備中一大共同難點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為了克服現(xiàn)有的Kappa游離輕鏈測定不成線性的缺陷，提供了一種測定Kappa游離輕鏈濃度的試劑盒及方法。本發(fā)明的測定方法可以得到可靠的Kappa游離輕鏈測定結(jié)果。[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:
[0007]本發(fā)明提供了一種采用膠乳增強(qiáng)比濁方法測定Kappa游離輕鏈濃度的試劑盒，其包括反應(yīng)緩沖液(Rl試劑)和Kappa游離輕鏈抗體溶液(R2試劑)，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液中氯化鈉的濃度為1250?2400mmol/L。
[0008]其中，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液中的Kappa游離輕鏈抗體較佳地為兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體,更佳地為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(即Dako 公司的 Polyclonal Rabbit Ant1-Human Kappa Free Light Chains,貨號為 A0100)。
[0009]較佳地，當(dāng)反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化鈉1250 ?2400mmol/L、吐溫-20lml/L 和防腐劑 Proclin-3000.3ml/L 時，Kappa 游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(貨號為AOlOO)0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫-20lml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L。上述組成中，膠乳微球可購于國際知名膠乳供應(yīng)商，如Bangslab公司或JSR公司。
[0010]更佳地，當(dāng)反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化鈉1250mmol/L、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L時，Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(貨號為A0100) 0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫-201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L ;或，當(dāng)反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化鈉2000mmol/L、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L時，Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(貨號為A0100) 0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L ;或，當(dāng)反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) IOOmmol/L、氯化鈉 1500mmol/L、吐溫 _201ml/L 和防腐劑 Proclin-3000.3ml/L 時，Kappa 游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(貨號為A0100) 0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫-20lml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L ;或，當(dāng)反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化鈉2400mmol/L、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L時，Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(貨號為A0100) 0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L。上述組成中，膠乳微球可購于國際知名膠乳供應(yīng)商，如Bangslab公司或JSR公司。
[0011]本發(fā)明還提供了一種測定Kappa游離輕鏈濃度的方法，其包括下述步驟:采用膠乳增強(qiáng)比濁方法，將待測樣品與上述反應(yīng)緩沖液和Kappa游離輕鏈抗體溶液混合后，計算吸光度變化ΛΑ，與標(biāo)準(zhǔn)品的工作曲線比較即可得到待測樣品的Kappa游離輕鏈濃度，其特征在于，待測樣品與反應(yīng)緩沖液和Kappa游離輕鏈抗體溶液混合后的混合體系的氯化鈉濃度為 1000 ?1600mmol/Lo
[0012]本發(fā)明中，所述的膠乳增強(qiáng)比濁方法是指一種在全自動生化儀上測定Kappa游離輕鏈濃度的常用方法，一般在相同的基本參數(shù)下(波長、方法學(xué)、樣本試劑比例、反應(yīng)時間)，先使用確定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在全自動生化儀使用對應(yīng)的測定試劑進(jìn)行校準(zhǔn)測試，得到對應(yīng)的測定試劑的校準(zhǔn)曲線(工作曲線)，然后，使用相同的測定試劑，在全自動生化儀上測試待測樣品，由全自動生化儀對照校準(zhǔn)曲線自動計算出待測樣品中被測物含量；具體操作可參見《全國臨床檢驗操作規(guī)程第三版》(東南大學(xué)出版社，書號:9787564105839，2006年11月)及各儀器使用說明書。
[0013]其中，所述的全自動生化儀較佳地為型號為Olympus AU480或Hitachi7170的全
自動生化儀。
[0014]其中，所述的反應(yīng)緩沖液可為本領(lǐng)域Kappa游離輕鏈濃度測定方法中膠乳增強(qiáng)比濁方法常用的反應(yīng)緩沖液(Rl試劑);所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液可為本領(lǐng)域Kappa游離輕鏈濃度測定方法中膠乳增強(qiáng)比濁方法常用的Kappa游離輕鏈抗體溶液(R2試劑)。
[0015]其中，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液中的Kappa游離輕鏈抗體較佳地為兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體,更佳地為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(即Dako 公司的 Polyclonal Rabbit Ant1-Human Kappa Free Light Chains,貨號為 A0100)。
[0016]較佳地，當(dāng)反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸(Hepes) 100mmol/L、氯化鈉1250 ?2400mmol/L、吐溫 _201ml/L、防腐劑 Proclin-3000.3ml/L 時，Kappa 游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體(貨號為AOlOO)0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫-201ml/L、防腐劑Proclin-3000.3ml/L。上述組成中，膠乳微球可購于國際知名膠乳供應(yīng)商,如Bangslab公司或JSR公司。
[0017]其中，所述的吸光度變化ΛΑ可由下述方法得到:將待測樣品與反應(yīng)緩沖液混合后，37°C恒溫5分鐘，再加入Kappa游離輕鏈抗體溶液，30秒后測定吸光度為A1 ;37°C恒溫4分30秒，測定吸光度為A2,計算吸光度變化Λ A=A2-Ap
[0018]其中，所述的工作曲線可由下述方法得到:將確定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與反應(yīng)緩沖液混合后，37°C恒溫5分鐘，再加入Kappa游離輕鏈抗體溶液，30秒后測定吸光度為Atll ;37°C恒溫4分30秒，測定吸光度為Atl2，計算吸光度變化AAci=Aci2-Atll,以AAtl與標(biāo)準(zhǔn)品的確定濃度作圖，即可。
[0019]其中，所述的混合體系的氯化鈉濃度較佳地為1300mmol/L。
[0020]其中，所述的待測樣品較佳地為血清和/或骨髓分離血清。
[0021]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0022]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0023]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0024](I)本發(fā)明解決了 Kappa游離輕鏈比濁測定中的臨床標(biāo)本線性差的問題，為臨床醫(yī)生提供可靠的Kappa游離輕鏈測定結(jié)果作為診斷參考，以便充分發(fā)揮膠乳增強(qiáng)免疫比濁方法速度快，通量高的優(yōu)勢，縮短檢測時間，利于臨床應(yīng)用和病人診斷。
[0025](2)該發(fā)明使用的方法簡單有效，原料無毒且方便購買，利于生產(chǎn)放大和推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為Α-a試劑盒的工作曲線。
[0027]圖2為Α-b試劑盒的工作曲線。
[0028]圖3為Β-a試劑盒的工作曲線。
[0029]圖4為Β-b試劑盒的工作曲線。
[0030]圖5為A試劑盒的工作曲線?！揪唧w實施方式】
[0031]下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0032]下述實施例中的全自動生化儀為型號為Olympus AU480的全自動生化儀。
[0033]本發(fā)明采用膠乳增強(qiáng)比濁方法在全自動生化儀上測定K型游離輕鏈濃度的操作可參見《全國臨床檢驗操作規(guī)程第三版》(東南大學(xué)出版社，書號:9787564105839，2006年
11月)。
[0034]A試劑盒(購于上海艾柯特醫(yī)療產(chǎn)品有限公司)中的反應(yīng)緩沖液(Rl試劑)和Kappa游離輕鏈抗體溶液(R2試劑)的組成如下:
[0035]A試劑盒中反應(yīng)緩沖液(Rl試劑)的組成
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種采用膠乳增強(qiáng)比濁方法測定Kappa游離輕鏈濃度的試劑盒，其包括反應(yīng)緩沖液和Kappa游離輕鏈抗體溶液，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液中氯化鈉的濃度為1250~2400mmol/Lo
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液中的Kappa游離輕鏈抗體為兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液中的Kappa游離輕鏈抗體為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，當(dāng)所述的反應(yīng)緩沖液的組成為4-羥乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化鈉1250~2400mmol/L、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L時，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫-20lml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，當(dāng)所述的反應(yīng)緩沖液的組成為4-羥乙基哌嗪乙磺酸 100mmol/L、氯化鈉 1250mmol/L、吐溫 _201ml/L 和防腐劑 Proclin_3000.3ml/L時，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體 0.5mg/ml、膠乳微球 3mg/ml、吐溫 _201ml/L 和防腐劑 Proclin-3000.3ml/L ;或，當(dāng)所述的反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化鈉2000mmol/L、吐溫-201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L時，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L ;或，當(dāng)所述的反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸 100mmol/L、氯化鈉 1500mmol/L、吐溫 _201ml/L 和防腐劑 Proclin-3000.3ml/L 時，所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L ;或，當(dāng)所述的反應(yīng)緩沖液的組成為4-輕乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化鈉2400mmol/L、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L時,所述的Kappa游離輕鏈抗體溶液的組成為Dako公司的兔抗人多克隆Kappa游離輕鏈抗體0.5mg/ml、膠乳微球3mg/ml、吐溫_201ml/L和防腐劑Proclin-3000.3ml/L。
6.一種測定Kappa游離輕鏈濃度的方法，其包括下述步驟:采用膠乳增強(qiáng)比濁方法，將待測樣品與如權(quán)利要求1~5中任一項所述的反應(yīng)緩沖液和Kappa游離輕鏈抗體溶液混合后，計算吸光度變化ΛΑ，與標(biāo)準(zhǔn)品的工作曲線比較即可得到待測樣品的Kappa游離輕鏈濃度，其特征在于，待測樣品與反應(yīng)緩沖液和Kappa游離輕鏈抗體溶液混合后的混合體系的氯化鈉濃度為1000~1600mmol/L。
7.如權(quán)利要求6所述的測定Kappa游離輕鏈濃度的方法，其特征在于，所述的吸光度變化ΛΑ由下述方法得到:將待測樣品與反應(yīng)緩沖液混合后，37°C恒溫5分鐘，再加入Kappa游離輕鏈抗體溶液，30秒后測定吸光度為A1 ;37°C恒溫4分30秒，測定吸光度為A2,計算吸光度變化AA=A2-A115
8.如權(quán)利要求6所述的測定Kappa游離輕鏈濃度的方法，其特征在于，所述的工作曲線由下述方法得到:將確定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與反應(yīng)緩沖液混合后，37°C恒溫5分鐘，再加入Kappa游離輕鏈抗體溶液，30秒后測定吸光度為A01 ;37°C恒溫4分30秒，測定吸光度為AQ2，計算吸光度變化Λ Aci=Aci2-Atll，以AAtl與標(biāo)準(zhǔn)品的確定濃度作圖，即可。
9.如權(quán)利要求6所述的測定Kappa游離輕鏈濃度的方法，其特征在于，所述的混合體系的氯化鈉濃度為1300mmol/L。
10.如權(quán)利要求6所述的測定Kappa游離輕鏈濃度的方法，其特征在于，所述的待測樣品為血清和/或骨髓分離血`清。
【文檔編號】G01N33/68GK103728455SQ201310396461
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】王金鳳, 蔣欣 申請人:柏榮診斷產(chǎn)品（上海）有限公司