本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

胃癌是我國(guó)乃至全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年新發(fā)胃癌患者近40萬(wàn)人，死亡約30萬(wàn)人，約占全部腫瘤死亡病例的1/5。早期診斷和早期治療是提高胃癌療效的重要因素之一，雖然診斷技術(shù)和醫(yī)療技術(shù)在不斷提高，但胃癌的治療效果和臨床預(yù)后仍然不是很理想，臨床診治的胃癌病例大多數(shù)均是進(jìn)展期，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜種植或血液轉(zhuǎn)移，致使過(guò)去幾十年來(lái)胃癌患者的五年生存率難以有顯著的提高。眾所周知以?shī)W沙利鉑為主的方案是進(jìn)展期胃癌化療的主流。研究發(fā)現(xiàn)：雖然含有奧沙利鉑的mFOLFOX的化療方案在胃癌新輔助化療使多數(shù)患者受益，但是約有38.9%患者對(duì)奧沙利鉑耐藥，也就意味著，對(duì)于耐藥的患者，新輔助化療有可能增加患者的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，甚至延誤了寶貴的手術(shù)時(shí)機(jī)。然而目前尚缺乏有效的預(yù)后判斷及化療療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前臨床上主要依據(jù)基于臨床病理指標(biāo)(如腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分級(jí)等)的AJCC分期作為疾病預(yù)后的判斷及指導(dǎo)臨床治療，但根據(jù)此分期判斷患者預(yù)后存在較大的異質(zhì)性，亦不能預(yù)測(cè)腫瘤患者對(duì)化療的反應(yīng)。

人類基因組大部分為非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)，廣泛參與人體生理、病理活動(dòng)，與眾多腫瘤密切相關(guān)。大量研究顯示，人類基因組中僅有2％產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是可編碼RNA，剩余98％均為非編碼RNA。這類非編碼RNA通常被分為管家ncRNAs和調(diào)節(jié)性ncRNAs兩類。在調(diào)節(jié)性ncRNAs中，至少存在著兩種類型：短鏈非編碼RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)。miRNA已經(jīng)被證明參與了一系列重要的生物過(guò)程并且在人類疾病的發(fā)生發(fā)展中其重要作用。然而，事實(shí)上miRNAs僅僅占了非編碼RNA中的很小一部分，而lncRNA 占了ncRNA 的80%。與具有高度保守性miRNA相比，lncRNA在不同物種間的保守性差，其主要由RNA聚合酶Ⅱ所轉(zhuǎn)錄，起先被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，其生物學(xué)功能一直未受重視。然而近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明lncRNA能夠廣泛地參與基因組調(diào)節(jié)，如X染色體失活、基因組印跡、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、降解、轉(zhuǎn)運(yùn)等，從而廣泛參與調(diào)控個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育以及細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生命活動(dòng)，并與包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，還沒(méi)有能夠通過(guò)對(duì)lncRNA進(jìn)行研究來(lái)預(yù)測(cè)患者胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型及其構(gòu)建方法，不僅能夠?qū)ξ赴┗颊哳A(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)并劃分高低危人群，同時(shí)可預(yù)測(cè)患者對(duì)于鉑類化療的敏感性從而減少過(guò)度治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型，該模型包括SEQIDNo.1-11中的lncRNA序列。

在上述的本發(fā)明一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型中，所述lncRNA序列的表達(dá)量均與胃癌患者復(fù)發(fā)具有相關(guān)性。

本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：

一、相關(guān)性分析：通過(guò)COX回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)多組lncRNA序列進(jìn)行分析，確定SEQ ID No.1-11中的lncRNA序列均與胃癌患者復(fù)發(fā)呈顯著相關(guān)性；

二、重要度確定：利用隨機(jī)森林算法確定該11個(gè)lncRNA序列的重要度均大于0；

三、計(jì)算患者RFS風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)：計(jì)算上述11個(gè)lncRNA序列的表達(dá)權(quán)重，通過(guò)COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算公式計(jì)算每個(gè)患者RFS（無(wú)復(fù)發(fā)生存率）的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)；

四、判斷風(fēng)險(xiǎn)：根據(jù)計(jì)算得出的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值，將患者劃分為高危和低危，判斷患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大小，并依該指標(biāo)預(yù)測(cè)患者對(duì)于鉑類為基礎(chǔ)化療的敏感性；

五、預(yù)測(cè)效能評(píng)價(jià)：通過(guò)COX 多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型及ROC 曲線對(duì)所構(gòu)建lncRNA 模型的預(yù)測(cè)效能進(jìn)行評(píng)價(jià)；

六、效果驗(yàn)證：獲取獨(dú)立的另組患者的癌組織，經(jīng)過(guò)組織RNA提取并質(zhì)檢后，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)表達(dá)量，并利用GAPDH作為內(nèi)部參照進(jìn)行校正；依據(jù)表達(dá)水平對(duì)每個(gè)RNA 進(jìn)行賦值后帶入風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算公式內(nèi)，計(jì)算每位患者的RS 值；判斷每位患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)預(yù)測(cè)其對(duì)鉑類為基礎(chǔ)化療的敏感性。

在上述的本發(fā)明一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型的構(gòu)建方法中，步驟三中所述的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算公式為:

；

其中，為每個(gè)RNA 在兩分類方法中的賦值，為每個(gè)lncRNA序列 的權(quán)重系數(shù)。

在上述的本發(fā)明一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型的構(gòu)建方法中，步驟六中所述采用的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法中，采用的預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的產(chǎn)品中含有針對(duì)SEQ ID No.1-11中一對(duì)或多對(duì)lncRNA 特異性引物。

進(jìn)一步地，所述特異性引物為特異性探針核苷酸。

進(jìn)一步地，所述預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的產(chǎn)品通過(guò)以下方法預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)：檢測(cè)癌組織樣品中SEQ ID No. 1-11中一個(gè)或多個(gè)lncRNA序列的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)及對(duì)鉑類化療藥物的敏感性。

基于上述技術(shù)方案，相比于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

一、在預(yù)測(cè)2年的RFS中，本發(fā)明能夠呈現(xiàn)出較好的預(yù)測(cè)效能，且明顯優(yōu)于常見的臨床病理指標(biāo)；

二、本發(fā)明可以預(yù)測(cè)以鉑類為基礎(chǔ)的化療療效；

三、與其他己知與療效相關(guān)的臨床病理因素相比，本發(fā)明為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素。

四、本發(fā)明能夠?yàn)槟[瘤患者治療提供一定的指導(dǎo)，為醫(yī)生治療選擇提供參考，進(jìn)而減少過(guò)度或者不必要治療，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，提高患者術(shù)后生存率。

五、臨床治療中，在胃癌患者診斷明確后，即可通過(guò)本發(fā)明，快速判斷患者復(fù)發(fā)危險(xiǎn)度及對(duì)于化療的敏感性，并跟據(jù)結(jié)果選擇合適的治療方案，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的工作流程示意圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中l(wèi)ncRNA 模型以及其他臨床病理信息等因素對(duì)于預(yù)測(cè)胃癌患者RFS的ROC 曲線圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中l(wèi)ncRNA預(yù)測(cè)模型及其他臨床病信息等因?qū)ξ赴┗颊哂笊娣治鰣D。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例中用實(shí)時(shí)定量PCR方法及其他臨床病信息對(duì)胃癌患者愈后生存分析圖。

圖5是 RS score預(yù)測(cè)胃癌患者鉑類為基礎(chǔ)化療敏感性的ROC曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型及其構(gòu)建方法作進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，以求更為清楚明了地理解其結(jié)構(gòu)類型和使用方式，但不能以此來(lái)限定本發(fā)明專利的保護(hù)范圍。

一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型，該模型包括SEQIDNo.1-11中的lncRNA序列，所述lncRNA序列的表達(dá)量均與胃癌患者復(fù)發(fā)具有相關(guān)性。

如圖1所示，本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：

一、相關(guān)性分析：通過(guò)COX回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)多組lncRNA序列進(jìn)行分析，確定SEQ ID No.1-11中的lncRNA序列均與胃癌患者復(fù)發(fā)呈顯著相關(guān)性；

二、重要度確定：利用隨機(jī)森林算法確定該11個(gè)lncRNA序列的重要度均大于0；

三、計(jì)算患者RFS風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)：計(jì)算上述11個(gè)lncRNA序列的表達(dá)權(quán)重，通過(guò)COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算公式計(jì)算每個(gè)患者RFS（無(wú)復(fù)發(fā)生存率）的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)，所述風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算公式為:

；

其中，為每個(gè)RNA 在兩分類方法中的賦值，為每個(gè)lncRNA序列 的權(quán)重系數(shù)。；

四、判斷風(fēng)險(xiǎn)：根據(jù)計(jì)算得出的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值，將患者劃分為高危和低危，判斷患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大小，并依該指標(biāo)預(yù)測(cè)患者對(duì)于鉑類為基礎(chǔ)化療的敏感性；

五、預(yù)測(cè)效能評(píng)價(jià)：通過(guò)COX 多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型及ROC 曲線對(duì)所構(gòu)建lncRNA 模型的預(yù)測(cè)效能進(jìn)行評(píng)價(jià)；

六、效果驗(yàn)證：獲取獨(dú)立的另組患者的癌組織，經(jīng)過(guò)組織RNA提取并質(zhì)檢后，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)表達(dá)量，并利用GAPDH作為內(nèi)部參照進(jìn)行校正；依據(jù)表達(dá)水平對(duì)每個(gè)RNA 進(jìn)行賦值后帶入風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算公式內(nèi)，計(jì)算每位患者的RS 值；判斷每位患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)預(yù)測(cè)其對(duì)鉑類為基礎(chǔ)化療的敏感性。

在上述的本發(fā)明一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型的構(gòu)建方法中，步驟六中所述采用的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法中，采用的預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的產(chǎn)品中含有針對(duì)SEQ ID No.1-11中一對(duì)或多對(duì)lncRNA 特異性探針核苷酸。

所述預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的產(chǎn)品通過(guò)以下方法預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)：檢測(cè)癌組織樣品中SEQ ID No.1-11中一個(gè)或多個(gè)lncRNA序列的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)及對(duì)鉑類化療藥物的敏感性。

實(shí)施例

Ⅰ、建立預(yù)測(cè)模型

一.實(shí)驗(yàn)對(duì)象:

本實(shí)施例的研究對(duì)象選擇2009年1月至2010年12月間組織庫(kù)保存的胃癌組織180例，構(gòu)成訓(xùn)練集。

納入及排除標(biāo)準(zhǔn)為:

(1)新發(fā)胃癌患者，經(jīng)病理確診為胃癌

(2) 確診時(shí)無(wú)轉(zhuǎn)移病灶；無(wú)其他腫瘤病史；

(3) 排除其他原位癌。

二.實(shí)驗(yàn)方法

采集上述訓(xùn)練集180例患者的手術(shù)切除癌組織標(biāo)本:利用Qiagen 公司的Rneasy Plus Mini Kit，按照試劑盒說(shuō)明，抽提RNA樣本。抽提后的RNA，利用NanoDrop 2000 光譜儀定量檢測(cè)提取的總RNA 的濃度及質(zhì)量；所提取的RNA樣本凍存于-80℃的深低溫冰箱中。

用美國(guó)Affymetrix公司的GeneChip Human Transcriptome Array 2.0 (HTA2.0) 芯片檢測(cè)胃癌的轉(zhuǎn)錄組，該芯片可檢測(cè)出超過(guò)285000個(gè)轉(zhuǎn)錄本；按照Affymetrix HTA2.0芯片操作說(shuō)明規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，對(duì)所提取的RNA 樣本進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的檢測(cè)。

讀取芯片數(shù)據(jù)后，將原始信號(hào)值小于1的都以1替代，以芯片內(nèi)部參考基因表達(dá)為參照對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)化處理；將獲得的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和患者的臨床隨訪信息相關(guān)聯(lián)，利用COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(BRB-Array Tools) 計(jì)算每個(gè)lncRNA 與RFS的相關(guān)性。

將上述的lncRNA通過(guò)COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型，得出RS 計(jì)算公式: ，其中，為每個(gè)RNA 在兩分類方法中的賦值，為每個(gè)lncRNA序列 的權(quán)重系數(shù)。

根據(jù)計(jì)算得出的RS 值，將患者劃分為高危和低危，進(jìn)而判斷患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大小。通過(guò)COX 多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型及ROC曲線對(duì)所構(gòu)建RNA 模型的預(yù)測(cè)效能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

共檢測(cè)了訓(xùn)練集180例胃癌組織。

其中11個(gè)lncRNA序列基本信息如表1 所示：

表1.納入模型的lncRNA 基本信息。

<110> 上海厚承醫(yī)學(xué)科技有限公司

<120> 一種預(yù)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)和鉑類藥物反應(yīng)的lncRNA模型及其構(gòu)建方法

<130> （編號(hào)：）

<160> 11

<210> 1

<211> 616

<212> DNA

<213> BF238392

<400> 1

gaccctatttccttatgcatactgctaactgccaaaatattctctctctgtccacctgaccctccattcctgcttcctgtgacctgggaatggagaattaccctctgactccttgtgccctccctgctcaggatatcagcacagagggacgaaggcaatgtgcctaccctgcttgagagatgcagaggcctggtgtggagttagcagtattatgagatggggatcagcctggatcactgaatcactgcatgtaggacacactatggagagtttctgtgtgccaagatcagacatggtatatgcaagaataaatgtgtgcgtgaatcaaaccagaggtggtgtttattttttaattactatatggtattctgtgctaacctgactaatccagccagcaaccttacaattctaattatcttgactgtagatcctcccaggtgtgtctatgtacataaactgtgtccctcacttgtgcaaaagctaactatctgtgtttcttttttttccaatcatgtcaacttaatttgtggcttattgtgttatttatggcacgtgaatgttgaattgaagagatatggtgacaatattttacttgcttttgatttcgaaaggaaaagctcttaaaatttactattcactggattattattggcaggttttataaataaggaattacttgtgtcatcctatttaagatcctttcaatggtcatgcctggttttggacatattcttataa.

<210> 2

<211> 443

<212> DNA

<213> AA463827

<400> 2

gttgtatgaggccctgtcttaacagaaatagtgatgtcatcatcatcctctcttatttggtcttgaattgccaccaatcggataaaacctttgaattatttaactcaatatatgttaagtttctactatgtgctgtgtattggtactataaatatgaataagacataagatattacattcaaaaacatcagaatacatgttcttttaaagtataccccaaaacatttaccatgtgttctggggcgcatgttaggctggatcacaaatcaagtctcaagaaatttcaaaagattgaaatcatatagagtatgaattaaaccagaaatcaagtacataaaggtaacaaaaaatttccaaaatgcattaatttaaggaacatacacctcatgacccatgagccaaaaaataaatcacggcaaaattgcaaaaatattttgaaatgaattttaagaaaatacttagcatattaaatac

<210> 3

<211> 338

<212> DNA

<213> H04858

<400> 3

gatttactctcaaacctcctccacccattcccctccatctataacgctttctgcacatctgtaaaaggtatgacttagtgtttggtctgtgaaataaggttaaaaaggaagcatttctttttacattctagctaatgttgatatttttctcatgcttctattagcacataattcagatacattagttttgaagttttgaatcttctctgcttcttgagggctctctgttctagatcaacatgatctgtggaacaccagccaagtcctggggcagaaccctccccgttgtccaaatattactgaatcagttgagttttctctgttgtcaatggaattattccacatgtttctttggctacattttttttgggnttctgttcacagtaantttggccttgtttttaaaaacttctattagga

<210> 4

<211> 471

<212> DNA

<213> AA041523

<400> 4

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<210> 5

<211> 674

<212> DNA

<213> BE621082

<400> 5

ggctttgccaggcccaccggagaaaactgacgacccgtttctgtaatccttatgggagaccaaccttgtgcctccgggagatccactctcccacctggaaacgcacgggaagccaagcctccaaaaaagcgctgcctcctcgctccgcgttgggattatccggaaggaactcccaacggaggtagtaccactctaccctccgcacctcctcctgcatcagccggcctgaagtcgcaccctcctcctccggagaagtagagaaataaatttctcccaccctaaaccagtctttgagtgattgcagtatgactccatttccctggtgcattcatataatagttcacctggtgaaaacaatgaagattatttacaatgctaccctgctttttctggtgtcctgaacctggaagttgtgctttttaagtcttatgatgtaatcagcgcgatttcacttcctgaatttcgatgaattctaagacatgggcaagatcgggttgtaagacctctgagatttaaggccatgccctggatcatggtgaacttaccaaagcaaacaatgcctgtgagatggtcctgcagcagacaacccagtgaactctttggtgacatcctgttctgtgtataactttatattcctattaatccattaaggcccaataagttgtctctaaaaaaacacaaacacacaaaggggggggctaaagtacccggagggccagtacctacccgtttctggcaagggcccaatggagggaataagacagcggcgcgcacacggtcggcgcgcaatgcctgggttggagactctcgggggcctgggccaccaataccggaaatagttggcaccagggaagtgtta

<210> 6

<211> 1950

<212> DNA

<213> BC035722

<400> 6

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