）：每瓶多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液lml， 蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50ng/ml。同時(shí)準(zhǔn)備7 個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個(gè)EP管中加入500yL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，依次倍比稀釋成25ng/ml， 12· 5ng/ml，6· 25ng/ml，3 · 12ng/ml，1 · 56ng/ml，0· 78ng/ml，0 · 39ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（Ong/ ml)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0160] (3)辣根過氧化物酶標(biāo)抗體：用辣根過氧化物酶標(biāo)抗體稀釋液將10μ1辣根過氧化 物酶標(biāo)抗體稀釋成20ml，進(jìn)行2000倍稀釋。
[0161] (4)濃縮洗滌緩沖液：用380ml蒸餾水或去離子水將20ml濃縮洗滌緩沖液稀釋至 400ml，進(jìn)行20倍稀釋，得到洗滌液。
[0162] 3、操作步驟：
[0163] (1)加樣:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100yL不同 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（見試劑準(zhǔn)備⑵），空白孔加l〇〇yL(見試劑準(zhǔn)備⑵），余孔加待測樣品100yL， 37°C溫育2小時(shí)，多克隆抗體和待測樣品中的CCNY抗體將于酶標(biāo)板上的CCNY蛋白結(jié)合。
[0164] (2)棄去液體，甩干，每孔用350yL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板 壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕 拍將孔內(nèi)液體拍干），洗板3次，最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機(jī) 亦可。
[0165] (3)每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)抗體100μ1，37°C溫育1小時(shí)，辣根過氧化物酶標(biāo)抗 體將與酶標(biāo)板捕獲的多克隆抗體和待測樣品中的CCNY抗體結(jié)合。
[0166] (4)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟(2)。
[0167] (5)將底物顯色液A和底物顯色液B等體積充分混勻后，每孔90yl，37°C避光顯色， 10-20分鐘，不要超過30分鐘，孔內(nèi)液體在辣根過氧化物酶的催化下，轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔 的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止，
[0168](6)每孔加終止溶液50yL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色，顏色的深淺與樣品中 CCNY抗體的含量呈正相關(guān)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn) 顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。
[0169] (7)在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔 的光密度(0D值）。
[0170] 4、結(jié)果計(jì)算：
[0171]各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本0D值扣除空白孔0D值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo)），0D值為橫坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo)），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn) 曲線可參考圖3,（最佳方程式應(yīng)依回歸方程計(jì)算的R2值來定，以R2值越趨近于1為好）。推薦 使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curveexpert1.30,根據(jù)樣品0D值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出 相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與0D值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣 品的0D值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
[0172]在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不 一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何 的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0173] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種引物對，其特征在于，所述引物對具有SEQIDNO:1和2所示的核苷酸序列。2. -種制備細(xì)胞周期因子Y的方法，其特征在于，包括： 采用權(quán)利要求1所述的引物對，擴(kuò)增細(xì)胞周期因子Y編碼基因； 將所得到的細(xì)胞周期因子Y編碼基因亞克隆至質(zhì)粒中，以便獲得重組質(zhì)粒； 利用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并對所得到的轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，其中，在 所述培養(yǎng)過程中通過添加IPTG誘導(dǎo)所述細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)；以及 純化所述細(xì)胞周期因子Y。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 利用PCR擴(kuò)增細(xì)胞周期因子Y編碼基因，其中，反應(yīng)體系:A549肺腺癌細(xì)胞的cDNA2μ1，2υ/μ1pfuDNA聚合酶 1μ1，10πιΜdNTP1μ1、10πιΜ上游引物和下游引物各lyl，10XPCR buffer5μ1，補(bǔ)水至50μ1;反應(yīng)條件:熱啟動95°C5min;循環(huán)參數(shù)為:變性94°C30s、退火溫度 62.5°C45s、延伸72°Clmin共30個(gè)循環(huán);72°C延伸10min，4°C終止反應(yīng)，以便得到擴(kuò)增后的細(xì) 胞周期因子Y編碼基因； 利用Ncol/Xhol酶切體系將所述擴(kuò)增后的細(xì)胞周期因子Y編碼基因雙酶切后克隆至pET30a(+ )質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒； 利用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21大腸桿菌，并對轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng) 所述轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌的培養(yǎng)液的0D600為0.6時(shí)，向所述轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌培養(yǎng)液中加入 IPTG，其中，IPTG的濃度為0.4mM/L，以便得到所述細(xì)胞周期因子Y，其中，所述細(xì)胞周期因子 Y是以組氨酸-細(xì)胞周期因子Y重組蛋白的形式存在；以及 利用鎳離子親和層析柱純化所述細(xì)胞周期因子Y。4. 一種用于檢測所述細(xì)胞周期因子Y抗體的試劑盒，其特征在于，包括： 固相載體，所述固相載體上攜帶有權(quán)利要求2或3所述的方法制備的所述細(xì)胞周期因 子； 辣根酶標(biāo)記抗體； 辣根酶標(biāo)記抗體稀釋液； 洗滌濃縮液； 底物顯色液；以及 終止液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括： 標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為識別所述細(xì)胞周期因子Y的多克隆抗體;和 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的成份為:基于20ml所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，含有0.08-0 · 12g的NaCl，0 · 002-0 · 008g的KC1，0 · 002-0 · 008g的KH2P〇4和0 · 02-0 · 5g的Na2HP〇4。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述多克隆抗體為兔源性多克隆抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述辣根酶標(biāo)記抗體的成份:0.2μg/ml 辣根酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白G溶液和0.2yg/ml辣根酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G溶液； 所述辣根酶標(biāo)記抗體稀釋液的成份:基于20ml所述辣根酶標(biāo)記抗體稀釋液，含有0.05-0 · 15g的NaCl，0 · 002-0 · 008g的KC1，0 · 002-0 · 008g的KH2P〇4和0 · 02-0 · 05g的Na2HP〇4; 所述洗滌濃縮液的成份:基于20ml所述洗滌濃縮液，含有l(wèi)-3g的NaCl，0.05-0.15g的KC1，0·05-0·15g的KH2P〇4，0·5-1·0g的Na2HP〇4 和200-600μ1的吐溫-20; 所述底物顯色液包括底物顯色液A和底物顯色液B，其中，所述底物顯色液A的成份:基 于5ml所述底物顯色液A，含有0.10-0.158的醋酸鈉，0.01-0.028的檸檬酸和1-5以1體積百分 濃度為30 %的H2〇2;所述底物顯色液B的成份:基于5ml所述底物顯色液B，含有0.001-0.003g 的EDTA-鈉，0.005-0.015g的檸檬酸，0.3-0.8ml的丙三醇和0.001-0.003g的四甲基聯(lián)苯胺； 以及 所述終止液的成份：l-3mol/LH2S〇4溶液。8. -種用于檢測所述細(xì)胞周期因子Y抗體的方法，其特征在于，包括： (1) 包被所述細(xì)胞周期因子Y至試劑板，4°C過夜后洗板，以便得到包被所述細(xì)胞周期因 子Y的固相載體； (2) 向所述包被細(xì)胞周期因子Y的固相載體中加入2-10%胎牛血清封閉液，4°C封閉過 夜后洗板，以便得到封閉后的固相載體； (3) 將識別所述細(xì)胞周期因子Y的多克隆抗體和待檢測的血清進(jìn)行梯度稀釋，加入到所 述封閉后的固相載體中，孵育后洗板； (4) 向步驟(3)得到的固相載體中加入辣根酶標(biāo)記抗體，孵育后洗板； (5) 向步驟(4)得到的固相載體中加入底物顯色液；以及 (6) 向步驟（5)得到的固相載體中加入終止液，終止反應(yīng)，檢測0D450的值，通過分析 0D450值的大小，判斷血清中所述細(xì)胞周期因子Y抗體濃度。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述多克隆抗體為兔源性細(xì)胞周期因子Y 多克隆抗體， 任選地，所述辣根酶標(biāo)記抗體為辣根酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白G和羊抗兔免疫球蛋 白G混合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是利用權(quán)利要4-7任一項(xiàng)所述的 試劑盒進(jìn)行的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了引物對、制備細(xì)胞周期因子Y的方法以及用于檢測細(xì)胞周期因子Y抗體的試劑盒和方法，其中，引物對具有SEQ？ID？NO：1和2所示的核苷酸序列。利用本發(fā)明的引物對擴(kuò)增細(xì)胞周期因子Y的編碼基因，進(jìn)而合成細(xì)胞周期因子Y，并利用細(xì)胞周期因子Y包被試劑板得到固相載體，制備檢測血清中細(xì)胞周期因子Y抗體試劑盒，或檢測血清中細(xì)胞周期因子Y抗體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法，靈敏度高、準(zhǔn)確性好、成本低，操作簡單，可應(yīng)用于血清和血漿中細(xì)胞周期因子Y抗體的檢測。
【IPC分類】G01N33/68, C12N15/11, G01N33/531, C12N15/70
【公開號】CN105462966
【申請?zhí)枴緾N201510809761
【發(fā)明人】岳文濤, 馬麗, 滕宇, 張麗娜, 顧勐, 王玥
【申請人】首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院, 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年11月20日