三維石墨烯-細胞因子復合體系、其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三維石墨烯?細胞因子復合體系、其制備方法及應用。該復合體系包括三維石墨烯基體以及化學修飾于該基體上的細胞因子；其制備方法包括：將三維石墨烯材料以混合強酸溶液氧化處理后，再將細胞因子通過化學偶聯(lián)方法修飾到三維石墨烯表面，即得三維石墨烯?細胞因子復合體系。本發(fā)明三維石墨烯?細胞因子復合體系的制備工藝簡單、易于操作且可控性好，同時既保持了三維多孔立體結構，又提高了細胞因子的負載率，具有促進神經干細胞生長、增殖和分化的特點，還可實現(xiàn)生物學上的活性分子的緩慢釋放。
【專利說明】
三維石墨烯-細胞因子復合體系、其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種神經干細胞培養(yǎng)體系，特別是三維石墨烯-細胞因子復合體系及其制備方法和應用?！颈尘凹夹g】
[0002]神經系統(tǒng)損傷或病變，是當前嚴重危害人類健康的疾病之一。神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)是神經系統(tǒng)疾病治療的一個里程碑，近年來已成為治療神經退行性疾病和中樞神經系統(tǒng)損傷的熱點(Brain Research, 2006, 1091:258-264)。由于神經干細胞具有自我更新、多分化潛能、能誘導分化成神經元，這使得其能作為優(yōu)良的種子細胞替代神經損傷或病變中丟失的細胞，以促進神經再生及修復(Nat Neurosci，1998, 1:290-295)。 但神經系統(tǒng)疾病的治療需要有大量的神經元，因此如何得到大量的神經干細胞、并控制其定向分化為神經元顯得極其重要。
[0003]石墨烯具有優(yōu)良的物理化學性質和良好的生物相容性，它能夠支持神經干細胞很好地迀移，形成較完善的功能化神經網(wǎng)絡(B1materials，2013, 34:6402-6411)， 也能促進神經干細胞向神經元細胞和星形膠質細胞分化，尤其是向神經元分化(Sci Rep,2013,3:1604)〇[〇〇〇4]細胞因子是免疫細胞產生的一大類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調節(jié)和效應功能的蛋白質或小分子多肽，其成員包括白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)、轉化生長因子家族(TGF-0)、生長因子如表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-l)等。神經營養(yǎng)因子是一類特殊的蛋白質，它對神經元的發(fā)育、存活和凋亡起著至關重要的作用，其成員包括神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經營養(yǎng)因子3(NT-3)、神經營養(yǎng)因子4(NT-4)等。以上這些蛋白質是支持神經元生長和發(fā)展的重要因子，是治療神經損傷等疾病的潛在藥物標靶。
[0005]但現(xiàn)有的技術基本都是單方面從材料屬性上或從培養(yǎng)基配方上分析神經干細胞培養(yǎng)情況，或者只是將細胞因子與材料結合使用分析其對神經干細胞的培養(yǎng)情況，這些材料有包括石墨烯，這些細胞因子也有包括前述因子。但目前仍未有將細胞因子先修飾到石墨烯材料上，即將石墨烯和細胞因子組合成一個復合體系，然后來分析其對神經干細胞的增殖和分化情況。
【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的主要目的在于提供一種三維石墨烯-細胞因子復合體系及其制備方法， 以克服現(xiàn)有技術中的不足。
[0007]為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術方案:
[0008]—種三維石墨烯-細胞因子復合體系，包括三維石墨烯基體以及連接在所述基體上的細胞因子，所述基體具有多孔結構，其中孔的孔徑為50?500 ym、孔隙率多95%。
[0009]進一步的，所述細胞因子包括白細胞介素(IL)，干擾素(IFN)，轉化生長因子-0家族(TGF-0)，生長因子如表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-l)等，神經營養(yǎng)因子如神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經營養(yǎng)因子3(NT-3)和神經營養(yǎng)因子4(NT-4)等。
[0010]進一步的，所述細胞因子系通過化學修飾方式結合在所述基體上。
[0011]所述三維石墨烯-細胞因子復合體系的制備方法包括:將三維石墨烯材料在混合強酸溶液中氧化處理后，在三維石墨烯材料表面通過化學偶聯(lián)方法修飾偶聯(lián)基團，以及通過所述偶聯(lián)基團時細胞因子結合到三維石墨烯材料上，形成所述三維石墨烯-細胞因子復合體系。
[0012]進一步的，該制備方法包括:將三維石墨烯材料在混合強酸溶液中浸泡2h以上， 完成對三維石墨烯材料的氧化處理，其中所述混合強酸采用1^03和112304的混合溶液，優(yōu)選的，所述混合強酸包含體積比為1:3-5的HNOjP H2S04。
[0013]進一步的，該制備方法包括:將經氧化處理后的三維石墨烯材料清洗后，以含有濃度在50mM以上的EDC和濃度在50mM以上的NHS溶液浸漬30min以上，從而在三維石墨烯材料表面修飾上偶聯(lián)基團。
[0014]進一步的，該制備方法包括:將修飾有偶聯(lián)基團的二維石墨稀材料與濃度為 20ng/mL?10mg/mL的細胞因子溶液反應2h以上，形成所述三維石墨稀-細胞因子復合體系。
[0015]所述三維石墨烯-細胞因子復合體系在培養(yǎng)神經干細胞中的應用。
[0016]前述三維石墨烯材料可利用業(yè)界已知的多種途徑獲取，特別是可以通過CVD方式制備。
[0017]作為較為具體的實施方案之一，該制備方法可以包括如下步驟:
[0018](a)石墨烯預處理:用體積比為1:3的HNOjP 112304的混合溶液處理三維石墨烯材料，處理時間為2h以上，之后清洗、干燥后密封保存?zhèn)溆茫?br>[0019](b)向步驟a處理過的石墨烯加入濃度均為50mM的EDC和NHS試劑，室溫條件下反應30min，之后清洗干凈，密封保存?zhèn)溆茫?br>[0020](C)向步驟b所得的混合物中加入不同濃度的腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF，37°C條件下孵育過夜，之后清洗干凈，即得三維石墨烯-BDNF復合體系。
[0021]進一步的，在一應用方案之中，可于該復合體系中培養(yǎng)神經干細胞，觀察細胞的增殖或分化情況。
[0022]例如，一種神經干細胞的培養(yǎng)方法，包括:提供所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系，以及以所述三維石墨烯-細胞因子復合體系作為培養(yǎng)基培養(yǎng)神經干細胞，傳代2?10次。
[0023]更為具體的，該培養(yǎng)方法可以包括:至少以多聚鳥氨酸和/或層粘連蛋白孵育所述三維石墨烯-細胞因子復合體系內的小孔，并在所述小孔內接種神經干細胞，接種密度為1萬個/孔以上，傳代2?10次，并使用包含有B27、P/S、表皮生長因子EGF和堿性成纖維生長因子bFGF中一種或兩種以上的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天以上。
[0024]該神經干細胞(neural stem cells，NSCs)可來自于初生1_2天小鼠的海馬神經J L 〇
[0025]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點至少在于:該三維石墨烯_細胞因子復合體系的制備工藝簡單、易于操作且可控性好，同時既保持了三維多孔立體結構，又提高了細胞因子的負載率，可有效促進神經干細胞生長、增殖和分化，還可實現(xiàn)生物學上的活性分子的緩慢釋放?！靖綀D說明】
[0026]圖1為實施例1中三維石墨烯的掃描電子顯微鏡(SEM)照片；
[0027]圖2為實施例1中三維石墨烯經氧化試劑處理后所得的拉曼圖譜；
[0028]圖3為實施例1中BDNF化學修飾與物理吸附于三維石墨烯表面的吸附量對比圖；
[0029]圖4為實施例1中BDNF蛋白修飾在三維石墨烯表面的X射線光電子能譜圖；
[0030]圖5為實施例1中神經干細胞在三維石墨烯-BDNF復合體系中增殖情況的圖譜；
[0031]圖6為實施例2中神經干細胞在三維石墨烯-NGF復合體系中增殖情況的圖譜。【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖和若干實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0033]實施例1:
[0034]將CVD法制備的三維石墨烯泡沫(孔徑為50?500 y m、孔隙率彡95 %， 參考 Three-dimens1nal flexible and conductive interconnected graphene networks grown by chemical vapour deposit1n.Nat Mater.2011 ；advance online publicat1n.)完全浸泡于HN03:H2S04= 1:3的混合溶液中2h以上，之后用去離子水反復清洗至pH呈中性，置于烘箱中烘干；將石墨烯置入細胞培養(yǎng)皿小孔中并粘膠，等膠水干燥后，先后用清水和75%乙醇浸泡處理，之后置于超凈臺中通風干燥和紫外滅菌。
[0035]將濃度均為50mM的EDC和NHS溶液加入經預處理過的三維石墨烯泡沫的小孔內， 與石墨稀室溫條件下反應30min ;反應結束后清洗所述小孔，向其中加入濃度為100ng/mL 的BDNF溶液100 y 1，37°C條件下孵育過夜，之后吸走上液，并用PBS緩沖液清洗干凈，形成三維石墨烯-細胞因子復合體系。
[0036]先后用多聚鳥氨酸(PL0)和層粘連蛋白(LN)孵育所述小孔，最后在該孔內接種神經干細胞(傳代2?10次均可，接種密度為1萬個/孔)，使用包含有B27、P/S以及表皮生長因子EGF和堿性成纖維生長因子bFGF的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天，觀察三維石墨烯-BDNF復合體系對神經干細胞的增殖情況。
[0037]實施例2:
[0038]將CVD法三維石墨烯泡沫(同實施例1)完全浸泡于HN03:H2S04= 1:3的混合溶液中2h以上，之后用去離子水反復清洗至pH呈中性，置于烘箱中烘干；將石墨烯置入細胞培養(yǎng)皿小孔中并粘膠，等膠水干燥后，先后用清水和75%乙醇浸泡處理，之后置于超凈臺中通風干燥和紫外滅菌。
[0039]將濃度均為50mM的EDC和NHS溶液加入小孔內，與石墨烯室溫條件下反應30min ; 反應結束后清洗小孔，向其中加入濃度為100ng/mL的NGF溶液100 y 1，37°C條件下孵育過夜，之后吸走上液，并用PBS緩沖液清洗干凈。
[0040]先后用多聚鳥氨酸(PL0)和層粘連蛋白(LN)孵育小孔，最后在該孔內接種神經干細胞(傳代2?10次均可，接種密度為1萬個/孔)，使用包含有B27、P/S以及胎牛血清的培養(yǎng)基，觀察三維石墨烯-NGF復合體系對神經干細胞的分化情況。
[0041]對照例1:取Hummers法制取的氧化石墨稀加入濃度為100ng/mL的NGF溶液，37°C 條件下孵育過夜，之后吸走上液，并用PBS緩沖液清洗干凈，形成了石墨烯-細胞因子復合體系。取該石墨烯-細胞因子復合體系參照實施例1-2條件進行神經干細胞的培養(yǎng)，并觀察神經干細胞的分化情況。
[0042]對照例2:本對照例與實施例1-2基本相同，但以Hummers法制取的氧化石墨稀替代了其中的三維石墨烯泡沫，形成了石墨烯-細胞因子復合體系。取該石墨烯-細胞因子復合體系參照實施例1-2條件進行神經干細胞的培養(yǎng)，并觀察神經干細胞的分化情況。
[0043]請參照圖5、圖6可以看到，本發(fā)明的三維石墨烯-BDNF復合體系、三維石墨烯-NGF復合體系與對照例1中的BDNF、NGF單純物理吸附石墨烯比較，有明顯的促進神經干細胞增殖效應。而通過相同的測試發(fā)現(xiàn)，對照例2的BDNF-石墨烯復合體系、NGF-石墨烯復合體系對于神經干細胞的培養(yǎng)效果與對照例1的體系基本相同。由此可以說明，本發(fā)明的三維石墨烯-細胞因子復合體系對于神經干細胞有更為優(yōu)異的促進增殖效果。
[0044]應當理解，對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。 因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。
【主權項】
1.一種三維石墨烯-細胞因子復合體系，其特征在于包括三維石墨烯基體以及連接 在所述基體上的細胞因子，所述基體具有多孔結構，其中孔的孔徑為50~500 ym、孔隙率^ 95%〇2.根據(jù)權利要求1所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系，其特征在于所述細胞因子 包括白細胞介素、干擾素、轉化生長因子-P家族、生長因子或神經營養(yǎng)因子；其中所述生 長因子包括表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1， 所述神經營養(yǎng)因子包括神經生長因子、腦源性神經營養(yǎng)因子、神經營養(yǎng)因子3或神經營養(yǎng) 因子4。3.根據(jù)權利要求1或2所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系，其特征在于所述細胞 因子通過化學修飾方式結合在所述基體上。4.如權利要求1-3中任一項所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系的制備方法，其特 征在于包括:將三維石墨烯材料在混合強酸溶液中氧化處理后，在三維石墨烯材料表面通 過化學偶聯(lián)方法修飾偶聯(lián)基團，以及通過所述偶聯(lián)基團時細胞因子結合到三維石墨烯材料 上，形成所述三維石墨烯-細胞因子復合體系。5.根據(jù)權利要求4所述所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系的制備方法，其特征在 于包括:將三維石墨烯材料在混合強酸溶液中浸泡2 h以上，完成對三維石墨烯材料的氧 化處理，其中所述混合強酸采用HNOjP H #04的混合溶液。6.根據(jù)權利要求5所述所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系的制備方法，其特征在 于所述混合強酸采用體積比為1:3_5的HNOjP H2S04形成的混合溶液。7.根據(jù)權利要求4所述所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系的制備方法，其特征在 于包括:將經氧化處理后的三維石墨烯材料清洗后，以含有濃度在50 mM以上的EDC和濃度 在50 mM以上的NHS溶液浸漬30min以上，從而在三維石墨烯材料表面修飾上偶聯(lián)基團。8.根據(jù)權利要求4或7所述所述的三維石墨烯-細胞因子復合體系的制備方法，其特 征在于包括:將修飾有偶聯(lián)基團的三維石墨稀材料與濃度為20 ng/mL~10 mg/mL的細胞因 子溶液反應2 h以上，形成所述三維石墨烯-細胞因子復合體系。9.一種神經干細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括:提供權利要求1-3中任一項所述的 三維石墨烯-細胞因子復合體系，以及于所述三維石墨烯-細胞因子復合體系內接種神經 干細胞，傳代2~10次。10.如權利要求9所述的神經干細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括:至少以多聚鳥氨 酸和/或層粘連蛋白孵育所述三維石墨烯_細胞因子復合體系內的小孔，最后在所述小孔 內接種神經干細胞，接種密度為1萬個/孔以上，傳代2~10次，并使用包含有B27、P/S、表 皮生長因子EGF和堿性成纖維生長因子bFGF中一種或兩種以上的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天以上。
【文檔編號】C07K17/14GK105985440SQ201510064414
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月6日
【發(fā)明人】程琳, 程一琳, 程國勝, 王煒, 宋琴
【申請人】中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所