抗人激肽原酶抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗人激肽原酶抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明制備了多種單克隆抗體，并進(jìn)行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的抗體組合(A24及A32)；同時其方便大量生產(chǎn)，可滿足日后大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。對上述抗體組合進(jìn)行檢測體系的調(diào)試優(yōu)化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關(guān)檢測性能可滿足人血漿樣本檢測的人激肽原酶的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒、人激肽原酶的膠體金免疫層析定量檢測卡及人激肽原酶的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡。
【專利說明】
抗人激肽原酶抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及抗人激肽原酶抗體及其制備方法以及 上述抗體在人激肽原酶檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的主要慢性非傳染性疾病。其中冠心病及腦卒 中是世界上最常見的死亡原因。在我國，隨著人口的老齡化，以冠心病，腦卒中為代表的心 腦血管疾病的發(fā)病率，致死率及致殘率呈逐年上升的趨勢。但是，80%的腦卒中是可以預(yù)防 的。糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重危害糖尿病患者的生命質(zhì)量和醫(yī)療消費質(zhì) 量。若不從循證醫(yī)學(xué)的高度采取積極的干預(yù)措施，糖尿病腎病就會在較短的時間內(nèi)發(fā)展為 不可逆轉(zhuǎn)的終末期腎病，嚴(yán)重威脅患者的生存壽命。因此，積極尋找有效的方法，早期診斷 腦卒中、糖尿病腎病以進(jìn)行有效的防護(hù)直接關(guān)系著患者的生命質(zhì)量及生存壽命。
[0003] 激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS)又稱激肽系統(tǒng)，廣泛存 在于動物體內(nèi)的多個系統(tǒng)，尤其是在心血管系統(tǒng)內(nèi)分布更為密集。該系統(tǒng)有廣泛生物學(xué)活 性，并且和凝血系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)以及多種血管活性因子系統(tǒng)等存在密切的聯(lián) 系和交叉對話，共同維護(hù)人體多器官正常的生理機(jī)能和參與各種復(fù)雜的病理生理過程，具 有調(diào)節(jié)心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)和葡萄糖代謝，舒張血管、參與炎癥反應(yīng)、疼痛刺激和休克反 應(yīng)。近年來關(guān)于激肽系統(tǒng)的臨床研究主要集中在心血管、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作 用。
[0004] 人組織激肽釋放酶是激肽系統(tǒng)最重要的組成部分，是一組分泌型絲氨酸蛋白酶， 包含15個成員。在所有已知的組織激肽釋放酶中，只有人組織激肽釋放酶1 (胰/腎激肽 釋放酶，此11^111?11111〇^;[111，111(1，1(]^(1，又稱激肽原酶，1(;[11；[11(^6仙86)能有效水解低分子 量激肽原（LMWK)，釋放具有活性的激肽，進(jìn)而發(fā)揮心血管系統(tǒng)及腎臟功能的調(diào)節(jié)作用?；A(chǔ) 研究表明，在多種高血壓動物模型中已證實，hKl具有降低血壓，減輕腎臟和心臟肥大及纖 維化的作用；其在進(jìn)行心臟重塑，減輕腎臟損害，降低腦梗死發(fā)生率以及降低神經(jīng)損傷危害 等方面的作用。同時，通過外源性給藥的方法，亦證明了 hKl在防止中風(fēng)，心腦血管以及腎 臟疾病方面的作用。近些年來，進(jìn)一步的研究表明，hKl水平在人的心腦血管疾病的發(fā)生發(fā) 展的過程中具有重要的臨床意義，可能作為預(yù)測腦卒中發(fā)病率的指標(biāo)。hKl水平可預(yù)測腦卒 中的發(fā)病及五年無事件性生存率，可讓患者早期預(yù)防并采取相應(yīng)的措施，從而一定程度上 降低腦卒中的發(fā)生概率。另外，hKl較尿微量白蛋白排泄率可更早的診斷早期糖尿病腎病。 綜上可見，hKl的水平對于人的心腦血管疾病及糖尿病腎臟疾病具有重要的預(yù)測價值。因 此，準(zhǔn)確測定hKl的水平，在臨床及科研中均具有重要的意義。
[0005] 鑒于hKl在心腦血管疾病及糖尿病腎臟疾病中的治療及預(yù)測作用，制備hKl定量 檢測試劑盒具有重要臨床的應(yīng)用價值。國內(nèi)外已有hKl科研用定量檢測試劑盒：其中部分 試劑盒采用競爭法，抗體為多克隆抗體，其操作繁雜，計算繁瑣且易出現(xiàn)非特異性結(jié)合而導(dǎo) 致檢測結(jié)果誤差較大；部分試劑盒采用多克隆抗體的夾心法檢測模式，亦存在非特異性結(jié) 合的影響；另外一些試劑盒采用多克隆抗體及單克隆抗體的雙抗體夾心的模式，其檢測性 能有待進(jìn)一步驗證。雙抗體夾心法的檢測模式可有效避免上述問題。因此，多表位，高靈敏 度，特異性的抗體的制備是高質(zhì)量的人激肽原酶定量檢測試劑盒的關(guān)鍵因素之一。天然hKl 存在多個糖基化位點，因而重組表達(dá)hKl在糖基化位點等其他構(gòu)象方面可能與天然蛋白存 在較大的差異。在特異性抗體篩選時采用重組hKl進(jìn)行篩選就會出現(xiàn)篩選的特異性抗體不 能有效識別天然hKl的問題。本發(fā)明采用人天然hKl進(jìn)行抗體的篩選工作，可有效避免上 述情況的發(fā)生，且已證實其與天然hKl的結(jié)合力。
[0006] 同時，為滿足市場的不同應(yīng)用需求，本發(fā)明制備了三種hKl定量檢測試劑盒：人激 肽原酶ELISA定量檢測試劑盒，可滿足一般小型綜合醫(yī)院的應(yīng)用需求，且日后可發(fā)展升級 為化學(xué)發(fā)光法定量檢測（全自動），滿足大型綜合醫(yī)院的全自動檢測的應(yīng)用需求。人激肽原 酶膠體金定量檢測試紙卡及人激肽原酶熒光定量檢測試紙卡，均可滿足快速檢測及床邊檢 測的需求。其中膠體金定量檢測法靈敏度和準(zhǔn)確度雖不如熒光定量檢測法，但其使用方便 易于推廣且成本較低，可基本滿足疾病指標(biāo)的定量檢測，適合于基層醫(yī)療系統(tǒng)中的即時檢 測。熒光定量具備更高的檢測靈敏度，適用于檢測要求較高的檢驗中心或大型醫(yī)院臨床科 室的床邊診斷的應(yīng)用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供能有效的、特異性結(jié)合人激肽原酶的抗體。更具 體地說：
[0008] 本發(fā)明的第一目的在于提供兩種抗人激肽原酶抗體。
[0009] 第一種抗人激肽原酶抗體（A24)，
[0010] 其重鏈可變區(qū)含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID N0 :1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0 :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0 :3所示的HCDR3 ;
[0011] 以及其輕鏈可變區(qū)序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID N0 :4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0012] 優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體A24的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示， 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0013] 第二種抗人激肽原酶抗體（A32)，
[0014] 其重鏈可變區(qū)含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID N0 :9所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0 :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0 :11所示的HCDR3 ;
[0015] 以及其輕鏈可變區(qū)序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID N0: 12所示的IXDR1、如序列SEQ ID NO :13所示的IXDR2和/或如序列SEQ ID NO :14所示的 LCDR3。
[0016] 優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體A32的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示， 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0017] 本發(fā)明第二個目的是提供兩種單鏈抗體，所述單鏈抗體A24的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；所述單鏈抗體A32的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。優(yōu)選的，所述單鏈 抗體A24、A32中不含由六個組氨酸構(gòu)成的HIS標(biāo)簽。
[0018] 本發(fā)明第三個目的是提供兩種編碼上述單鏈抗體的核苷酸序列，編碼單鏈抗體 A24的核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示，和編碼單鏈抗體A32的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
[0019] 本發(fā)明第四個目的是提供一種含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體。
[0020] 本發(fā)明第五個目的是提供一種含有上述表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。所屬宿主細(xì)胞 可以是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選為畢赤酵母。
[0021] 本發(fā)明第六個目的是提供一種生產(chǎn)上述單鏈抗體的方法，包括：
[0022] 1)在合適的條件下培養(yǎng)上述重組宿主細(xì)胞表達(dá)抗體；
[0023] 2)然后從宿主細(xì)胞中純化、收集抗體。
[0024] 本發(fā)明的第七個目的在于提供上述抗人激肽原酶抗體在檢測人激肽原酶含量中 的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明的第八個目的在于提供一組可進(jìn)行配對并檢測人激肽原酶的抗體對組合； 該抗體對組合的檢測靈敏度高，特異性好。
[0026] 本發(fā)明的第九個目的在于提供一種利用所述抗人激肽原酶抗體檢測人激肽原酶 的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒，包括包被了 A24或A32抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、含 有酶標(biāo)抗體A32或A24的檢測液、洗滌液、顯色液及終止液。其檢測步驟主要包括：
[0027] (1)向包被A24或A32抗體的酶標(biāo)板中加入樣本稀釋液后，再加入樣本稀釋液稀釋 的標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照及血清或血漿等待檢樣本；
[0028] (2)加入樣本稀釋液稀釋的檢測液；
[0029] (3)加入顯色液
[0030] (4)加入終止液并讀取0D值。
[0031] 所述酶標(biāo)抗體A32或A24是辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體A32或A24 (A32-HRP或 A24-HRP)或者堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體A32或A24 (A32-AP或A24-AP);所述標(biāo)準(zhǔn)品為中國倉 鼠卵巢細(xì)胞（CH0)表達(dá)重組人激肽原酶的純化蛋白。
[0032] 本發(fā)明的第十個目的在于提供一種利用所述抗人激肽原酶抗體檢測人激肽原酶 的膠體金免疫層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水墊；所述金標(biāo)墊噴 涂有膠體金顆粒標(biāo)記的抗體A32或A24,所述反應(yīng)膜上有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被 有抗體A24或A32,質(zhì)控帶位置包被抗His標(biāo)簽抗體或Protein L。
[0033] 本發(fā)明第十一個目的在于提供一種利用所述抗人激肽原酶抗體檢測人激肽原酶 的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、熒光微球墊、反應(yīng)膜和吸水墊；所 述熒光微球墊噴涂有熒光微球標(biāo)記的上述所述抗體A32或A24,所述反應(yīng)膜上有檢測帶和 質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有上述所述抗體A24或A32,質(zhì)控帶位置包被抗His標(biāo)簽抗體或 Protein L〇
[0034] 所述反應(yīng)膜優(yōu)選硝酸纖維素膜。所述抗His標(biāo)簽抗體優(yōu)選鼠抗His抗體。
[0035] 本發(fā)明制備了多種抗體，并進(jìn)行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的 抗體組合（A24及A32);同時其方便大量生產(chǎn)，可滿足日后大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。對上述 抗體組合進(jìn)行檢測體系的調(diào)試優(yōu)化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關(guān)檢測性能可 滿足臨床樣本檢測的人激肽原酶的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒、人激肽原酶的膠體金免疫層 析定量檢測卡及人激肽原酶的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡。
【附圖說明】
[0036] 圖1.抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因電泳圖。Lane 1為標(biāo)準(zhǔn)DNA，Lane 2為抗體A24 重鏈可變區(qū)DNA，Lane 3為抗體A24輕鏈可變區(qū)DNA，Lane 4為抗體A32重鏈可變區(qū)DNA， Lane 5為抗體A32輕鏈可變區(qū)DNA。
[0037] 圖2.單鏈抗體結(jié)構(gòu)示意圖。VH表示重鏈可變區(qū)序列，表示輕鏈可變區(qū)序列，His 標(biāo)簽為六個組氨酸。
[0038] 圖3.單鏈抗體表達(dá)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖（a)為A24基因 PCR產(chǎn)物； 圖（b)為A32基因 PCR產(chǎn)物。
[0039] 圖4.重組畢赤酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清培養(yǎng)液鑒定圖。圖4(a)為抗體A24重組畢 赤酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清培養(yǎng)液鑒定圖；圖4(b)為抗體A32重組畢赤酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)上 清培養(yǎng)液鑒定圖。上述左圖為SDS-PAGE電泳鑒定圖、右圖為Western blot鑒定圖。
[0040] 圖5.單鏈抗體純化效果圖（SDS-PAGE)。圖（a)為抗體A24,圖（b)為抗體A32。
[0041] 圖6.抗體A24及A32的Western Blot鑒定圖。泳道1為尤瑞克林（UK);泳道2 為酵母表達(dá)hKl ;泳道3為大腸桿菌表達(dá)hKl ;泳道4為CH0表達(dá)hKl。圖（a)為A32抗體 Western Blot 結(jié)果；圖（b)為 A24 抗體 Western Blot 結(jié)果。
[0042] 圖7.本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)為蛋白濃度（ng/mL);縱 坐標(biāo)為檢測0D450 ;r表示檢測相關(guān)系數(shù)，為0. 99980322。
[0043] 圖8.本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測特異性。橫坐標(biāo)為檢測物濃度（ng/mL);縱 坐標(biāo)為檢測0D值。UK表示尤瑞克林，是從人尿液中提取的人激肽原酶；KLK2表示人組織激 肽釋放酶2 ;KLK3表示人組織激肽釋放酶3。
[0044] 圖9.本發(fā)明膠體金免疫層析定量檢測卡及時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡結(jié) 構(gòu)示意圖。1為樣品墊、2為反應(yīng)膜、3為吸收墊、4為質(zhì)控線（C線）、5為檢測線（T線）、6 為金標(biāo)墊或熒光結(jié)合墊、7為PVC片材。
[0045] 圖10.本發(fā)明膠體金免疫層析定量檢測卡標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)為蛋白濃度（ng/ mL);縱坐標(biāo)為T/C值；r2為0. 992。
[0046] 圖11.本發(fā)明時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)為蛋白濃 度（ng/mL);縱坐標(biāo)為檢測值；r2為0. 9952。
[0047] 圖12.時間分辨免疫熒光層析定量檢測與酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果相關(guān)性
【具體實施方式】
[0048] 定義
[0049] "抗體"又稱免疫球蛋白，是一類由B淋巴細(xì)胞分泌的大型Y形蛋白質(zhì)，能夠通過 Y形的其中兩個分叉頂端的互補(bǔ)位點（抗原結(jié)結(jié)合位）特異性結(jié)合靶抗原的免疫球蛋白分 子，所述靶抗原如蛋白質(zhì)、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。
[0050] "單鏈抗體"（scFv)指的是抗體的重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（\)通過15~ 20個氨基酸短肽（linker)連接形成的單一鏈融合蛋白，用于連接的linker通常富含甘氨 酸和絲氨酸，以利于單鏈抗體的穩(wěn)定性與柔韌性。連接方式可將\的N端連接至V "的C末 端，或者相反。盡管去除了恒定區(qū)并引入linker，單鏈抗體依然保留了抗體對抗原的特異 性，且其具有分子量小、穿透力強(qiáng)和抗原性弱等特點。
[0051] 互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region, CDR)，也叫做高變區(qū)。成型 于抗體單體氨基酸的末端，是靶抗原與抗體結(jié)合的最關(guān)鍵區(qū)域，在免疫網(wǎng)絡(luò)理論中，每個抗 體的互補(bǔ)決定區(qū)又被稱為獨特型或者基因型。
[0052] 以下實施例中所用標(biāo)準(zhǔn)品均為CH0系統(tǒng)表達(dá)重組hKl (lmg/mL，制備方法見專利 201310746269. X)
[0053] 實施例1.抗人激肽原酶雜交瘤細(xì)胞株的制備
[0054] 1.動物免疫
[0055] 以重組人激肽原酶（中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)，制備方法見專利201310746269. X) 按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠（購自常州卡文斯實驗動物有限公司）。具體免疫 情況參見《抗體制備與使用實驗指南》。采用間接ELISA法跟蹤免疫小鼠血清滴度，選取血 清效價最高的免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合實驗。
[0056] 2.細(xì)胞融合
[0057] (1).脾臟細(xì)胞的制備
[0058] 將免疫小鼠，摘眼球取血，經(jīng)斷頸椎處死后置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分鐘， 于無菌操作臺中取出其脾臟，置于細(xì)胞篩網(wǎng)中，充分研磨細(xì)胞，過篩網(wǎng)，用無菌1640培養(yǎng)基 (購自Gibco公司）離心洗滌數(shù)次后，重懸細(xì)胞以制成單細(xì)胞懸液，并計數(shù)，備用。
[0059] (2).飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
[0060] 取8~10周齡的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球獲取陰性血清，經(jīng)斷頸椎處死后置 75% (v/v)酒精中浸泡10分鐘；無菌揭開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器將約10mL 1640HT 培養(yǎng)基（購自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，輕輕按摩腹部并吹打數(shù)次。吸取含有巨噬細(xì)胞 的培養(yǎng)基注入20% 1640HAT培養(yǎng)基中備用；
[0061] 取2~3周齡的雌性BALB/c小鼠一只，經(jīng)斷頸椎處死后置于75% (v/v)酒精中浸 泡10分鐘；無菌取胸腺于細(xì)胞篩網(wǎng)中，研磨，過篩網(wǎng)，獲得胸腺細(xì)胞置于上述含有巨噬細(xì)胞 的20 % 1640HAT培養(yǎng)基中，備用。
[0062] (3).細(xì)胞融合
[0063] 選擇處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0,收集并計數(shù)。取約10s個上述脾 細(xì)胞與2 X 107個上述SP2/0細(xì)胞株加入融合管中混合，lOOOrpm離心10分鐘后棄上清（盡 量棄凈），將融合管置手掌上來回輕輕摩擦以使沉淀松散。60秒內(nèi)先慢后快地加入lmL預(yù)熱 的PEG1450(聚乙二醇1450,購自SIGMA公司），加入1640HT培養(yǎng)基30mL終止，lOOOrpm離 心10分鐘，去上清，輕輕摩擦使沉淀松散，加入步驟2所獲得的20%的1640HAT培養(yǎng)基中。
[0064] 將上述HAT培養(yǎng)基充分混勻后，以200 μ L/孔分裝至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37°C， 5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周后用10% 1640HT培養(yǎng)基替換20% 1640HAT培養(yǎng)基，3 天后取上清進(jìn)行檢測。
[0065] 3.抗人激肽原酶特異性雜交瘤細(xì)胞株篩選
[0066] (1).檢測板的準(zhǔn)備：用CB包被液稀釋尤瑞克林（UK，購買于廣東天普生化醫(yī)藥公 司）至1 μ g/mL，包被96孔ELISA酶標(biāo)板，100 μ L/孔，2~8°C包被過夜，洗滌一次拍干；含 2%酪蛋白的PBST緩沖液封閉（200uL/孔），37°C封閉2小時；拍干，備用。
[0067] (2).陽性克隆的篩選：將待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清100μL7孔加入上述檢測板中，于 37°C作用30分鐘后洗滌并拍干，加入lOOyL/孔的HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，于37°C作用 30分鐘后洗滌并拍干，加入100 μ L/孔的TMB顯色液，于37°C避光顯色15分鐘，每孔加入 50 μ L的2M H2S0j#止反應(yīng)，并于0D450處讀取數(shù)值。陽性孔確定原則：0D450值/陰性對 照值>2.1。選取陽性克隆株進(jìn)行細(xì)胞克隆化篩選。經(jīng)過三至四輪的克隆化篩選后，單克 隆細(xì)胞株陽性率100%即確定為穩(wěn)定細(xì)胞株，對細(xì)胞株進(jìn)行定株。雜交瘤細(xì)胞株C24及C32 均具有較高的效價，遂后續(xù)進(jìn)一步對上述雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體可變區(qū)序列測序分析。
[0068] 實施例2.雜交瘤細(xì)胞株抗體可變區(qū)序列的測定 [0069] 對上述雜交瘤細(xì)胞株C24及C32抗體可變區(qū)序列進(jìn)行測定。
[0070] a. RNA的提?。簠⒄占?xì)胞總RNA抽提試劑盒（購自Roche公司）說明書對上述雜 交瘤細(xì)胞株C24及C32進(jìn)行總RNA提取并立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
[0071] b. RNA 反轉(zhuǎn)錄成為 DNA :參照 Thermo Scientific Reverted First strand cDNA Synthesis Kit(購自Thermo公司）對上一步驟中所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得cDNA, 凍存于_20°C備用；
[0072] c.可變區(qū)序列的PCR擴(kuò)增及回收：以上一步驟中所得cDNA為模板，以鼠 IgG亞型 單克隆抗體可變區(qū)序列通用引物為引物，對重鏈及輕鏈的可變區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒（購自TIANGEN公司）進(jìn)行回收，見附圖1 ;
[0073] d.可變區(qū)序列的克隆和序列測定：按照克隆載體pMD18_T kit (購自Takara公 司）說明書，將重鏈和輕鏈可變區(qū)基因分別與PMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a， 挑取陽性克隆，交由Invitrogen?公司進(jìn)行測序。
[0074] 測序得到雜交瘤細(xì)胞株C24的抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示、 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。Vbase2數(shù)據(jù)庫分析上述序列，其重鏈可變區(qū) 的各互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID N0:1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ;其輕鏈可變區(qū)的各互補(bǔ)決定 區(qū)的氨基酸序列是：如序列SEQ ID N0:4所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2 和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3。
[0075] 測序得到雜交瘤細(xì)胞株C32的抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示、 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :16所示。Vbase2數(shù)據(jù)庫分析上述序列，其重鏈可變 區(qū)的各互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID N0:9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :11所示的HCDR3 ;其輕鏈可變區(qū)的各互補(bǔ)決 定區(qū)的氨基酸序列是：如序列SEQ ID N0:12所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:13所示的 LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :14所示的LCDR3。
[0076] 實施例3.單鏈抗體的重組表達(dá)及純化
[0077] 根據(jù)實施例2中測序結(jié)果，分別將雜交瘤細(xì)胞株C24及C32的抗體重鏈及輕鏈可 變區(qū)之間加入連接肽（GGGGS)3，引入六個組氨酸，并將其全基因按照畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的 偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化的方法，進(jìn)行單鏈抗體的重組表達(dá)。所表達(dá)得到的抗體分別命名為 抗體A24和抗體A32,其結(jié)構(gòu)組成如附圖2所示。上述單鏈抗體的重組表達(dá)具有如下： [0078] 1.融合蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0079] 密碼子優(yōu)化后的抗體A24的基因序列如SEQ ID N0:19所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:17所示；密碼子優(yōu)化后的抗體A32的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示、氨基酸 序列如SEQ ID N0:18所示。將優(yōu)化后的抗體A24及A32全基因合成的片段上游引入 pPICZ α A載體中Xhol序列后DNA序列，下游引入Xbal酶切位點，構(gòu)建到pMD19-T Simple Vector質(zhì)粒（購自Invitrogen公司）中，得到一種長期保存質(zhì)粒，質(zhì)粒記為pMD19-A24、 PMD19-A32。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中上游引物P1為CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC ;下游引物 P2為：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。常規(guī)PCR程序后，瓊脂糖凝膠電泳分析（附圖3)，顯 示兩種產(chǎn)物大小與預(yù)期大小（790bp、800bp) -致。將PCR獲得基因產(chǎn)物回收純化后，采 用 Xhol (#R0146S,購自 New England Biolabs 公司）和 Xbal (#R0145V,購自 New England Biolabs公司）雙酶切，用T4連接酶連接到pPICZ a A (V19520,購自Invitrogen)質(zhì)粒中， 轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Zeocin(R250-01，購自Invitrogen公司）的LB平板中 37°C培養(yǎng)過夜。第二天篩選陽性克隆菌測序，比對，與預(yù)期序列完全一致，即得到抗體A24 及A32的表達(dá)質(zhì)粒，分別記為pPICZ a -A24、pPICZ a -A24。
[0080] 2.融合蛋白基因在畢赤酵母宿主工程菌株的構(gòu)建、篩選及表達(dá)
[0081] 畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞、YPDS固體培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基：均購自 Invitrogen 公司。
[0082] 將pPICZ a -A24及pPICZ a -A32質(zhì)粒，用SacI限制性內(nèi)切酶酶切線性化。乙醇沉 淀后將線性化載體，分別電轉(zhuǎn)化進(jìn)入到X-33感受態(tài)酵母細(xì)胞，分別涂布到含有Zeocin的 YPDS固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3-5天，就有陽性克隆產(chǎn)生。
[0083] 挑取上述獲得的單克隆于5mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至0D6QQ= 2. 0~6. 0時， 取lmL保存菌種，并將剩余菌液重懸后轉(zhuǎn)移到BMMY中小量誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h補(bǔ)加甲醇至 終濃度為1% (v/v)。一周后，離心收集菌液上清，通過SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白免疫印跡 分析（Western blot)，觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況（附圖4) Jestern blot中一抗為抗HIS-Tag 抗體（His-Tag(2A8)Mouse mAb，M20001，購于艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司）。
[0084] 將上述獲得的A24及A32重組融合蛋白基因工程菌株分別接種于BMGY培養(yǎng)基中， 30°C，220rpm培養(yǎng)至菌體密度到0D 6QQ= 2. 0~6. 0,每隔24小時補(bǔ)加甲醇至終濃度為1. 0% (v/V)。一周后，收集發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0085] 3.融合蛋白純化
[0086] 采用組氨酸標(biāo)簽親和柱純化抗體A24及抗體A32融合蛋白，預(yù)裝柱子選擇為 HisTrap HP，具體步驟如下：
[0087] (1)發(fā)酵液的除雜預(yù)處理：將上述表達(dá)得到抗體A24及A32融合蛋白發(fā)酵液 上清，離心收集上清，并加入結(jié)合緩沖液，使得上清終濃度為300mM NaCl，20mM NaH2P04， lOmMImidazole，調(diào) ρΗ7· 5,0· 45 μ m 濾膜過濾。
[0088] (2)HisTrap HP親和柱純化：運(yùn)用全自動智能蛋白純化系統(tǒng)（AKTA avantl50,購自 GE healcare公司）對預(yù)處理獲得的抗體A24及抗體A32融合蛋白發(fā)酵液進(jìn)行親和純化， 柱子為 HisTrap HP(17-5248-02,購自 GE healcare 公司）。結(jié)合緩沖液為 300mM NaCl， 20mM NaH2P04，10mM Imidazole，ρΗ7· 5,洗脫緩沖液為 300mM NaCl，20mM NaH2P04,500mM Imidazole，pH7. 5。洗脫時進(jìn)行線性洗脫，并收集各個洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳鑒定純 度，由附圖5可知，兩種純化后的蛋白純度均達(dá)到95%以上；合并符合要求的收集管，更換 緩沖液為PBS溶液并超濾濃縮（lmg/ml)，過濾除菌于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0089] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，重組蛋白可以不帶標(biāo)簽，也可帶其他標(biāo)簽，也可加入其他形 式的連接肽。無論是否帶標(biāo)簽或者帶不同形式的標(biāo)簽都可采用Capto L純化。
[0090] 實施例4.抗體的性能評價
[0091] 1.抗體 Α24 及 Α32 的 Western blot 鑒定
[0092] a.聚丙烯酰胺凝膠電泳：配置12%分離膠、5%濃縮膠，分別上樣標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、尤 瑞克林（UK)、畢赤酵母表達(dá)hKl、大腸桿菌表達(dá)hKl以及CH0系統(tǒng)表達(dá)hKl，恒壓下電泳1小 時；
[0093] b.轉(zhuǎn)膜：恒流（35mA/膜）條件下轉(zhuǎn)膜1小時，將兩塊聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì) 分別轉(zhuǎn)移至兩張硝酸纖維素膜上?？捡R斯亮藍(lán)G250對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色， 觀察蛋白的殘留情況；
[0094] c.封閉：含5%脫脂奶的TBST緩沖液封閉（封閉液），4°C過夜；封閉后洗滌液 (TBST，詳見 TaKaRa 公司 TBST buffer)洗滌一次，10 分鐘；
[0095] d.抗原抗體反應(yīng)：封閉液稀釋（按1:400體積比）辣根過氧化物酶標(biāo)記 A24(A24-HRP，lmg/mL，本公司采用經(jīng)典過碘酸鈉法標(biāo)記，下同）及辣根過氧化物酶標(biāo)記 A32 (A32-HRP，lmg/mL，本公司采用經(jīng)典過碘酸鈉法標(biāo)記，下同），分別加入上述兩張硝酸纖 維素膜中，室溫反應(yīng)1小時；TBST洗滌5次，每次10分鐘；
[0096] e.顯色及拍照：吸干硝酸纖維素膜上殘留液體，每張硝酸纖維素膜分別加入2mL 穩(wěn)定型過氧化物酶溶液（lmL)與魯米諾/增強(qiáng)劑溶液（lmL)的混合液（購買于Thermo公 司），均勻潤濕硝酸纖維素膜的表面，室溫避光反應(yīng)一分鐘后于凝膠成像系統(tǒng)（購買于GE公 司）拍照，留取結(jié)果。
[0097] 實驗結(jié)果（附圖6)表明，本發(fā)明兩種抗體均可與四種來源的hKl反應(yīng)，證明了本 發(fā)明兩種抗體的反應(yīng)性，且證明其與天然hKl均有較好的反應(yīng)。另外，實驗結(jié)果可見，四種 來源hKl的分子量均與理論值相符：UK為天然hKl，糖基化程度最高，故其分子量最大；大 腸桿菌表達(dá)hKl糖基化程度最低，故分子量最??；CH0系統(tǒng)表達(dá)hKl糖基化程度稍低于天然 蛋白但高于酵母表達(dá)hKl，故其分子量介于UK及酵母表達(dá)hKl之間。
[0098] 2.抗體A24及A32在ELISA檢測平臺的性能評價
[0099] 將上述制備例中抗體進(jìn)行配對組合，分別作為包被抗體或標(biāo)記抗體進(jìn)行配對檢測 標(biāo)準(zhǔn)品，檢測步驟如下：
[0100] 1)采用20mM PH7. 4的PB緩沖液將Y0 (非相關(guān)單鏈抗體，作為陰性對照，制備方法 參加
【申請人】在先申請：201410020156. 6)、A24或A32 (作為包被抗體）分別稀釋至8ug/mL， 分裝至酶標(biāo)板中（100uL/孔），4°C，過夜（16小時）；
[0101] 2)卩851'(含0.05%了￥6611-20的201111?87.4，下同）洗滌一次（2001117孔）后拍 干；
[0102] 3)封閉液（含質(zhì)量體積比為2% BSA的PBST)封閉（200uL/孔），37°C，2小時；棄 去封閉液后拍干；
[0103] 4)樣本稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，至濃度（ng/mL)為200、100及0。分別將上述濃度溶 液加入至步驟3)獲得的包被有A24及A32的酶標(biāo)板中（100uL/孔），37°C反應(yīng)1小時；PBST 洗滌5次（200uL/孔）后拍干；
[0104] 5)按照1:2000體積比稀釋HRP標(biāo)記A24 (A24-HRP)或A32 (A32-HRP)(作為標(biāo)記抗 體）；向步驟4)所獲酶標(biāo)板中分別加入稀釋的A32-HRP或A24-HRP，37°C反應(yīng)30分鐘；PBST 洗滌5次后拍干；
[0105] 6)加入TMB顯色液（購買于湖州英創(chuàng)公司），100uL/孔，37°C反應(yīng)15分鐘；
[0106] 7)加入2M H2S04終止液，50uL/孔，立即于酶標(biāo)儀（購買于Thermo公司）讀取 0D450。
[0107] 結(jié)果如下表：
[0108]
[0109] 由上述結(jié)果可知，A32、A24組成的雙抗體夾心檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于酶聯(lián)免疫檢測平 臺，且A24 (包被）-A32 (標(biāo)記），A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）兩種配對均有較好的檢測效果。 與非相關(guān)抗體無非特異性反應(yīng)。
[0110] 3.抗體A24及A32在膠體金檢測平臺的評價
[0111] 用樣本稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至濃度為200ng/ml，100ng/ml，將這兩個濃度和 0. 025mol/L pH7. 5的PBS分別添加50uL到膠體金檢測卡中（A24包被-A32標(biāo)記或A32包 被-A24標(biāo)記，具體制備參見實施例6)，10-15min內(nèi)將檢測卡放在讀數(shù)儀上進(jìn)行檢測。檢測 結(jié)果如下：
[0112]
[0113] 上述結(jié)果可見，A32、A24組成的雙抗體夾心檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于膠體金檢測平臺，且 A24 (包被）-A32 (標(biāo)記），A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）兩種配對均有較好的檢測效果。
[0114] 4.抗體A24及A32在時間分辨熒光檢測平臺的評價
[0115] 用0· 025mol/L ρΗ7· 5的PBS將A24或A32稀釋至lmg/ml，劃線于硝酸纖維素膜 上；用0. 05mol/L pH8. 0的硼酸緩沖液將時間分辨熒光微球標(biāo)記的A32或A24稀釋20倍， 噴點于結(jié)合墊上；按附圖9所示貼膜、切條、裝卡（具體制備參見實施例7)。將檢測卡分別 檢測濃度含量為200、100ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品和0. 025mol/L pH7. 5的PBS，檢測結(jié)果如下：
[0116]
[0117] 由上述結(jié)果可知，A32、A24組成的雙抗體夾心檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于時間分辨熒光檢 測平臺，且A24 (包被）-A32 (標(biāo)記），A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）兩種配對均有較好的檢測效 果。
[0118] 實施例5.抗體A24及A32在酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒中的應(yīng)用
[0119] 本檢測方法采用雙抗體夾心法的原理。
[0120] 1.材料：
[0121] 包被緩沖液：0. 02M PH7. 4的PB緩沖液；封閉液：含2% BSA(質(zhì)量體積比，下同） 的PBST緩沖液；洗滌液：PBST緩沖液；樣本稀釋液：含1% BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血 清、0· 02% Procline 300及0· 05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PH7. 4);標(biāo)準(zhǔn)品：CH0系統(tǒng) 表達(dá)重組hKl (lmg/mL，制備方法見專利201310746269. X);顯色液：TMB (購買于湖州英創(chuàng)公 司）；終止液：2M H2S04。
[0122] 2.儀器：
[0123] 酶標(biāo)儀（購買于Thermo公司），通用型微生物培養(yǎng)箱（購買于Thermo公司），全 自動洗板機(jī)（購買于深圳匯松公司）
[0124] 3.方法：
[0125] (1)檢測板的制備：包被緩沖液將抗體A24稀釋至8ug/mL，100uL/孔加入至酶標(biāo) 板中，4°C放置過夜（16小時）；PBST洗滌一次后拍干；200uL/孔封閉液封閉，37°C放置2小 時后拍干，抽干過夜（16小時），鋁箔袋真空包裝，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0126] (2)樣本稀釋液的制備：含1%BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血清、0. 02%Procline 300及0. 05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（20mM，PH7. 4)，按照上述成分比例配置樣本稀釋 液，于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0127] (3)標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將10uL標(biāo)準(zhǔn)品加入至19. 99mL樣本稀釋液中，充分混勾后于 4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0128] (4)檢測液的制備：將辣根過氧化物酶（HRP)偶聯(lián)至抗體A32 (A32-HRP，lmg/ml); 將5uL A32-HRP加入至9. 995mL的樣本稀釋液中，充分混勻后于4°C保存?zhèn)溆?
[0129] 4.人激肽原酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法
[0130] (1)于4°C取出真空包裝的檢測酶標(biāo)板及相關(guān)試劑于室溫平衡后備用；
[0131] (2)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將10uL標(biāo)準(zhǔn)品加入至490uL樣本稀釋液中，充分混勻后即得 10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液；將10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液倍比稀釋，分別獲得終濃度（ng/mL)為5、2. 5、 1.25、0. 625、0. 3125、0. 15625及0. 078125的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；以樣本稀釋液為陰性對照，即 0ng/mL ；
[0132] (3)酶標(biāo)板中分別加入50uL/孔的樣本稀釋液；再向酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對 照以及待檢樣本（50ul/孔）；37°C放置60分鐘；PBST洗滌5次后拍干；
[0133] (4)檢測孔中加入檢測液，100uL/孔，37°C放置30分鐘；PBST洗滌5次后拍干；
[0134] (5)檢測孔中加入顯色液，100uL/孔，37°C放置15分鐘；
[0135] (6)檢測孔中加入終止液，50uL/孔，立即于酶標(biāo)儀讀取0D450。
[0136] 按照標(biāo)準(zhǔn)品各濃度對應(yīng)的0D450讀值，采用CurveExpert 1. 3軟件以濃度為橫坐 標(biāo)，0D值為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；將檢測樣本的0D值代入標(biāo)準(zhǔn) 曲線方程后計算出待檢樣本的濃度（ng/mL)。
[0137] 5.檢測性能評價：
[0138] 根據(jù)上述檢測條件進(jìn)行本發(fā)明所述檢測方法的性能評價。
[0139] (1)添加回收率：
[0140] 回收率是驗證檢測準(zhǔn)確性的指標(biāo)，遂本發(fā)明對基于A24及A32的檢測試劑盒進(jìn)行 添加回收率的驗證。
[0141] 將20份血漿混合后獲得混合血漿，采用本發(fā)明的方法測量混合血漿B中的hKl含 量為C。;將濃度分別為5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL以及0· 625ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品（A液）加 入到混合血漿B中，所加入A液與血漿B之間的體積比為1:9,根據(jù)公式（1)計算出各個添 加量的回收率。
[0143] 式中：R為回收率；
[0144] V為加入A液的體積；
[0145] V。為混合血漿樣本B的體積；
[0146] C為混合血漿樣本B加入A液后的檢測濃度；
[0147] C。為血漿樣本B的檢測濃度；
[0148] (；為A液的濃度。
[0149] 本發(fā)明檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線（附圖7)可見，該檢測具有良好的線性關(guān)系（r = 0. 99)且 具有高靈敏度（156pg/mL)及陰性本底值（0D = 0. 0525)。根據(jù)上述添加回收率計算方法， 計算結(jié)果見下表：
[0150]
[0151] 表中可見，上述四個濃度添加回收率平均值為101. 17%，各濃度添加回收率與回 收率均值相差小于等于8. 29%，證明本檢測方法準(zhǔn)確性高。
[0152] (2)特異性：
[0153] 經(jīng)蛋白序列比對可見，人激肽原酶與人組織激肽釋放酶家族中的人組織激肽釋放 酶2(KLK2)及人組織激肽釋放酶3(KLK3)的同源性分別達(dá)到66%及60%，遂本實驗主要考 察本發(fā)明所建立的檢測方法對KLK2及KLK3的檢測特異性。檢測方法如上所述，分別加入 樣本稀釋液梯度稀釋后的尤瑞克林（UK)，KLK2 (購買于R&D公司）及KLK3 (購買于R&D公 司），最終檢測該檢測方法的特異性。檢測結(jié)果（附圖8)可見，本發(fā)明所述的人激肽原酶酶 聯(lián)免疫定量檢測法特異性好。
[0154] (3)重復(fù)性
[0155] 將三份具有代表性的血漿樣本分別重復(fù)檢測10次，計算10次測量結(jié)果的平均值 1和標(biāo)準(zhǔn)差50，根據(jù)公式(^ = 50/^\100%得出變異系數(shù)(^，結(jié)果如下：
[0156]
[0157] 上述結(jié)果可見，三份血漿檢測CV〈10%，本發(fā)明ELISA檢測試劑盒具有較好的重復(fù) 性。
[0158] 6.本發(fā)明嘗試多種試劑盒制備方法，下表展示幾種不同制備方式（表中未列出的 步驟、參數(shù)等同本實施例所述）及相應(yīng)試劑盒的檢測性能。
[0159]
[0160] 實施例6.抗人激肽原酶的膠體金免疫檢測卡的制備
[0161] 1.膠體金的標(biāo)記
[0162] 抗體A32的膠體金標(biāo)記：用K2C03調(diào)節(jié)膠體金pH值（每1ml膠體金中加入5uL 0. 2M K2C03)，向膠體金溶液中緩慢加入以0. 2M的PBS稀釋的抗體A32 (每lml膠體金中加 入30ug抗體A32)，低速攪拌30分鐘；加入封閉液（1%BSA)至其終濃度為10% (質(zhì)量百 分比），攪拌20分鐘；靜置30min后12000rpm離心30min ;去上清用金標(biāo)抗體復(fù)溶液0. 01M 卩8?!17.4+1%854+0.025%了￥661120+5%蔗糖）復(fù)溶即得膠體金標(biāo)記的432抗體。
[0163] 2.金標(biāo)墊及反應(yīng)膜制備
[0164] 將A32金標(biāo)抗體稀釋好后，噴涂在金標(biāo)墊6上，干燥備用；將抗體A24和抗His標(biāo) 簽抗體分別用包被抗體稀釋液（3%甲醇+25mM PBS緩沖液（pH7. 5))稀釋好后，分別包被在 反應(yīng)膜2 (硝酸纖維素膜）的T線5, C線4位置，干燥后備用。
[0165] 3.貼膜、切膜、組裝
[0166] 將樣品墊1、金標(biāo)墊6、包被有抗體的硝酸纖維素膜2、吸水墊3從左至右依次設(shè)置 (如圖9所示），且兩兩之間應(yīng)少許接觸，所述包被有抗體的硝酸纖維素膜的T線5在左、C 線4在右，并根據(jù)外殼大小進(jìn)行切割，裝入外殼，完成檢測卡制備。
[0167] 4.試劑盒組裝
[0168] 將組裝好的檢測卡，干燥劑，滴管裝入鋁箔袋中，熱封機(jī)封口，貼標(biāo)簽。
[0169] 5.抗人激肽原酶的膠體金免疫檢測卡的使用方法
[0170] 1)樣本稀釋液（10mM PH7. 4的PB緩沖液）恢復(fù)至室溫，震蕩混勻備用；
[0171] 2)檢測樣本稀釋：在潔凈的離心管加入lmL樣本稀釋液，再精確吸取10 μ L血清/ 血漿樣本，加入到離心管中，振蕩充分混勻。
[0172] 3)加樣及判讀：用移液槍吸取50yL稀釋后的樣本慢慢加入加樣孔中，開始計時， 10~15分鐘內(nèi)將檢測卡放置在讀數(shù)儀上進(jìn)行檢測，儀器將對檢測卡進(jìn)行掃描，并將結(jié)果顯 示在讀數(shù)儀的屏幕上。超過15min鐘判定，結(jié)果無效。
[0173] 6.抗人激肽原酶的膠體金免疫檢測卡檢測效果評估
[0174] 1)線性范圍檢測
[0175] 測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（0. 125,0. 25,0. 5，1，2,4,8，161^/1111)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線 性檢測范圍，結(jié)果如附圖10所示。檢測卡靈敏度為0. 125ng/ml。
[0176] 2)重復(fù)性檢測
[0177] 同一批次檢測卡對lng/ml、4ng/ml樣本進(jìn)行重復(fù)檢測10次，計算變異系數(shù)CV，
[0178] CV =標(biāo)準(zhǔn)差SD/平均數(shù)MX 100%
[0179]
[0180] 3)準(zhǔn)確度檢測（添加回收率）
[0181] 用于評估該檢測試劑盒準(zhǔn)確測定加入純分析物的能力。將混合血清分為體積相同 的3份，在其中2份中加入標(biāo)準(zhǔn)品，制成5ng/ml，1. 25ng/ml濃度的回收樣本，在另一份樣本 中加入同樣量的無被測物的PH7. 4的PB緩沖液，制成基礎(chǔ)樣本。
[0182]
[0183] 7.除上述最優(yōu)制備方式外，本發(fā)明還嘗試了多種制備方案，例如下表的4種制備 例：
[0184]
[0185] 實施例7.人激肽原酶的時間分辨熒光免疫檢測卡的制備
[0186] 本檢測方法采用雙抗體夾心免疫層析法的原理。
[0187] 1、溶液配制
[0188] 0· 05mol/L ρΗ8· 0 的硼酸緩沖液制備：取 0· lmol/L 的 H3B0370ml，用 0· 025mol/L 的 Na2B407 · 10H20調(diào)節(jié)pH至8. 0,并定容至100ml，置于4°C備用，有效期3個月。
[0189] 1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，購自SIGMA公司）溶液制備： 1. 5gEDC加入100ml去離子水，配成水溶液置于4°C備用，有效期3個月。
[0190] 封閉液的制備：含10% BSA(所述百分比均為質(zhì)量體積比），0. 05mol/L pH8. 0的 硼酸緩沖液，用〇. 22um濾膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0191] 熒光抗體稀釋液制備：含1%834，10%蔗糖，0.025%吐溫-20,0.05111〇1/1?!18.0 的硼酸緩沖液，用〇. 22um膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0192] 包被抗體稀釋液制備：含1%蔗糖，3%甲醇0. 025mol/L pH7. 5的PBS，用0. 22U膜 過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0193] 樣本稀釋液：含0· 1 % BSA，0. 025 %吐溫-20,0· 01 %安替比林，0· 02 % proclin300,0. 05mol/L ρΗ8· 0的硼酸緩沖液，10-30°C保存有效期1年。
[0194] 2、人激肽原酶熒光檢測卡制備
[0195] 1)時間分辨突光微球標(biāo)記
[0196] A32抗體標(biāo)記方法如下（以500uL反應(yīng)體系為例）：加400uL硼酸緩沖溶液于2ml 離心管中，加入100uL濃度1 %粒徑200nm的空載熒光微球（購自Thermo公司），漩渦振蕩 混勻。再加入lOuLEDC溶液，室溫振蕩15min。14000rpm 10°C離心10min，去上清，沉淀用 0. 5ml硼酸緩沖液溶解，超聲分散，功率100W，時間lmin (超聲3s間隔3s)。
[0197] 活化后的微球中加入濃度lmg/ml的A32抗體50uL，250r/min2(TC恒溫震蕩反應(yīng) 2h ;加入55uL封閉液，恒溫震蕩反應(yīng)4h。14000rpm 10°C離心15min，洗滌2次，去上清，沉 淀用0. 5ml硼酸緩沖液溶解，最后一次離心后沉淀用熒光抗體稀釋液溶解并超聲分散，置 于4 °C恒溫保存。
[0198] 2)熒光結(jié)合墊的噴點
[0199] A32抗體熒光結(jié)合墊噴點方法如下：用熒光抗體稀釋液將上述制備的A32熒光抗 體稀釋20倍，噴點于整條結(jié)合墊上。
[0200] 3)硝酸纖維素膜的包被
[0201] 硝酸纖維素膜包被方法如下：取0. 5ml濃度4mg/ml的A24抗體，加到5ml刻度離 心管中，加包被抗體稀釋液至lml，包被于硝酸纖維素膜2的T線5位置。取0. 5ml濃度為 4mg/ml抗HIS抗體，加到離心管中，加包被抗體稀釋液至lml，包被于硝酸纖維素膜2的C 線4位置。
[0202] 4)貼膜、切條、裝卡
[0203] 樣品墊1、熒光結(jié)合墊6、包被有A24抗體的硝酸纖維素膜（反應(yīng)膜）2、將吸水墊3 從左至右依次設(shè)置，且兩兩之間少許接觸，所述硝酸纖維素膜的T線5在左、C線4在右（如 附圖9所示），并根據(jù)卡殼大小進(jìn)行切割，裝入卡殼，完成檢測卡制備。
[0204] 5)試劑盒組裝
[0205] 取鋁箔袋和干燥劑；打開熱封機(jī)，預(yù)熱；將檢測卡、干燥劑裝入鋁箔袋中；用熱封 機(jī)封好鋁箔袋；貼上標(biāo)簽。
[0206] 同時，
【申請人】也采用A24抗體做熒光標(biāo)記、采用A32抗體包被在硝酸纖維素膜（反 應(yīng)膜）2T線處，其余步驟、參數(shù)不變，進(jìn)行熒光檢測卡制備。
[0207] 3、人激肽原酶熒光檢測卡的使用方法
[0208] 1)稀釋待測樣本：在潔凈的離心管加入lmL樣本稀釋液，再精確吸取10 μ L血清/ 血漿樣本，加入到離心管中，振蕩充分混勻。
[0209] 2)加樣及判讀：用移液槍吸取50yL稀釋后的樣本慢慢加入加樣孔中，開始計時， 10~15分鐘內(nèi)用熒光免疫層析儀定量判定結(jié)果。超過15分鐘判定，結(jié)果無效。
[0210] 4、人激肽原酶熒光檢測卡檢測效果評估
[0211] 1)精密性：將A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）檢測卡檢測0· 25、l、4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品各25 次重復(fù)測定，剔除離群值后計算檢測卡精密度。實驗結(jié)果顯示三個濃度檢測結(jié)果變異系數(shù) CV〈15%〇
[0212]
[0213] 將A24(包被）_A32(標(biāo)記）檢測卡重復(fù)上述實驗，結(jié)果如下表，
[0214]
[0215] 2)檢測線性：將A32(包被）-A24(標(biāo)記）檢測卡檢測不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：0.0625、 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、321^/1111，標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系（如附圖11)。檢測卡檢測靈 敏度為 〇· 〇625ng/ml。
[0216] A24(包被）-A32(標(biāo)記）檢測卡靈敏度為0· 0625ng/ml。
[0217] 3)準(zhǔn)確度一回收率：將A32(包被）_A24(標(biāo)記）檢測卡檢測添加量分別為1、5、 20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測結(jié)果如下表。
[0218]
[0219] 將A24(包被）_A32(標(biāo)記）檢測卡重復(fù)上述實驗，結(jié)果如下表，
[0220]
[0221] 5、準(zhǔn)確度方法學(xué)比對：
[0222] 上述結(jié)果顯示A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）的檢測卡性能較優(yōu)，因此將其作方法學(xué)比 對驗證。選擇20份臨床病人標(biāo)本，按1到20的順序編號，用ELISA(實施例5制備）和熒 光檢測法同時進(jìn)行實驗，按照1，2, 3...... 18,19, 20, 20,19,18...... 3, 2,1的樣本順序進(jìn) 行測定。ELISA和熒光檢測法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2= 0. 98,說明熒光檢測法與ELISA檢 測結(jié)果有較好的相關(guān)性（如附圖12)。
[0223] 6、配方的對比：
[0224] 除上述最優(yōu)制備例1外，
【申請人】還嘗試多種制備方案，例如下面5組檢測卡制備及 應(yīng)用結(jié)果如下表：
[0225]
[0226] 在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的 而非限制性的。
【主權(quán)項】
1. 抗人激肽原酶抗體A24包括： 重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ; 以及其輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :4所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO :5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3。2. 權(quán)利要求1所述的抗人激肽原酶抗體A24,其特征是重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。3. 權(quán)利要求1所述的抗人激肽原酶抗體A24,其特征是氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所 /_J、1 ο4. 權(quán)利要求3所述的抗人激肽原酶抗體Α24的氨基酸序列中不含有由六個組氨酸構(gòu)成 的HI S標(biāo)簽。5. 編碼權(quán)利要求3所述抗體的核苷酸序列，如SEQ ID NO: 19所示。6. 含有權(quán)利要求4所述核苷酸序列的表達(dá)載體。7. 含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。8. 生產(chǎn)權(quán)利要求3所述抗體的方法，包括： 1) 在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求6所述重組宿主細(xì)胞表達(dá)抗體； 2) 然后從宿主細(xì)胞中純化、收集抗體。9. 權(quán)利要求1-3任一項抗人激肽原酶抗體在檢測人激肽原酶含量中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K16/40GK105985436SQ201510051431
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】馬永, 趙利利, 付紅, 楊蕓, 王安良, 范宇, 徐春林, 陳飛, 陳一飛
【申請人】江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司