1特異性抗體溶液，樣本中殘留的黃曲霉毒素B1藥物與酶標(biāo)板 上包被的黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原競爭黃曲霉毒素B1特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光 值與黃曲霉毒素B1藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素B1 的殘留含量。同時根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色 的比較可粗略判斷樣品中黃曲霉毒素B1殘留量的濃度范圍。
[0027] 當(dāng)在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗抗體時，加入黃曲霉毒素B1抗體解育后，加入樣本溶液或 標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原溶液，樣本中殘留的黃曲霉毒素B1藥 物與酶標(biāo)記黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原競爭黃曲霉毒素B1特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸 光值與黃曲霉毒素B1藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素 B1的殘留含量。同時根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏 色的比較可粗略判斷樣品中黃曲霉毒素B1殘留量的濃度范圍。
[0028] 6.本發(fā)明還提供了一種檢測辣椒中黃曲霉毒素B1含量的方法，它包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用前述試劑盒進(jìn)行檢測； (3) 分析檢測結(jié)果。
[0029] 樣品的前處理主要是為了提取辣椒中黃曲霉毒素B1溶液，從而用于后續(xù)的檢測。
[0030] 本發(fā)明中用試劑盒檢測時：當(dāng)包被原為黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔 中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液，加入酶標(biāo)二抗，再加入抗體，溫育后洗涂，甩掉孔中液體，并 W吸水紙吸除殘余水分，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為黃曲霉毒素B1偶 聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗涂，甩 掉孔中液體，并W吸水紙吸除殘余水分，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為 黃曲霉毒素B1特異性抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記 黃曲霉毒素B1半抗原，溫育后洗涂，甩掉孔中液體，并W吸水紙吸除殘余水分，顯色、終止， 用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入黃曲霉毒素B1抗體， 再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)黃曲霉毒素B1半抗原，溫育后洗涂，甩掉孔中液 體，并W吸水紙吸除殘余水分，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
[0031]本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為：用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均 值度）除W第一個標(biāo)準(zhǔn)溶液（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值度。）再乘W100%，即百分吸光度值。計(jì) 算公式為： 百分吸光度值（％ )=度/B。）X100% W黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（yg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度 則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中黃曲霉毒素B1的殘留量。
[0032]本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可W采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。
【附圖說明】
[003引圖1潰曲霉毒素B1結(jié)構(gòu)式； 圖2 :黃曲霉毒素B1半抗原合成技術(shù)路線； 圖3 :試劑盒柄；準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035] 實(shí)施例1試劑盒組分的制備 1.抗原的合成 a.半抗原的合成 將黃曲霉毒素B1與鹽酸徑胺縮合反應(yīng)，引入一個新的徑基，再與班巧酸酢反應(yīng)得到具 有簇基官能團(tuán)的半抗原。
[0036]半抗原的具體步驟：將250mg黃曲霉毒素B1和168mg鹽酸徑胺置于8ml化晚溶液 中室溫攬拌12-24小時，旋蒸去化晚和未反應(yīng)的鹽酸徑胺，得到粗產(chǎn)物，將得到的粗產(chǎn)物加 入8ml化晚和160mg班巧酸酢，60°C反應(yīng)10-20小時，旋蒸出去化晚，加入10ml水，乙酸乙 醋萃取，蒸干后在乙醇和水混合體系中重結(jié)晶，得到黃曲霉毒素B1半抗原。
[0037] b.免疫原合成 將黃曲霉毒素B1半抗原與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
[00測具體操作如下： 稱取lOOmgBSA溶于9. 5mlPBS(0. 0111101/1，抑5. 0)溶液中，稱取50mgEDC加入，得到I液；稱取半抗原15mg用0. 5mlDMF溶解后加入I液，室溫攬拌反應(yīng)比，再加50mg邸C，暗處 攬拌反應(yīng)并過夜；用0.Olmol/LPBS透析3d每天換3次透析液。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0039] c.包被原黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原的制備 將黃曲霉毒素B1半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原。
[0040] 具體操作如下： 取半抗原15mg用1.OmlDMF溶解，取氯甲酸異下醋15μ1加入，10°C攬拌反應(yīng)30min， 即可得到反應(yīng)液A;稱取OVA50mg，使之充分溶解在6.OmL50mmol/L碳酸鋼溶液中得B液； 將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到反應(yīng)液B中，10°C反應(yīng)地，然后4°C過夜；用0.Olmol/LPBS透析 3d每天換3次透析液。分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 2.單克隆抗體的制備 a.動物免疫 選取6-8周齡健康Ba化/c小鼠，按照免疫劑量為100μg/只進(jìn)行免疫。首次免疫時取 等量弗氏完全佐劑（購自Sigma公司，貨號巧881)與免疫原均勻混合，后續(xù)免疫時與等量 弗氏不完全佐劑（購自Sigma公司，貨號巧506)混合。
[0042]b.細(xì)胞融合和克隆化 小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按9 : 1比例（數(shù)量比）與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞 融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克 隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。其分泌的抗體特異性良好（如表1)，靈敏 度能達(dá)到0. 05μg/L。
[0043] 表1細(xì)胞株單克降抗體特異性測定結(jié)果_
C.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 將黃曲霉毒素B1的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成IX1〇9個/ml的細(xì)胞懸液，在 液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離屯、去除凍存液后，移入 培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0044]d.單克隆抗體的生產(chǎn)與純化 取6-8周齡Ba化/c小鼠若干只，腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后腹腔注射黃曲 霉毒素B1的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X1〇7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸錠法 進(jìn)行腹水純化，-20°C保存。
[0045] 2.多克隆抗體的制備 采用新西蘭大白兔作為免疫動物，W黃曲霉毒素B1半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為 免疫原，免疫劑量為1. 5mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐（來源同上）混合制成 乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3~4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑（來 源同上）混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后 采血，測定血清抗體效價，屯、臟采血，用辛酸-飽和硫酸錠法純化得到多克隆抗體。
[0046] 3.羊抗鼠抗抗體的制備過程：W羊作為免疫動物，W鼠源抗體為免疫原對無病原 體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備羊作為免疫動物，W兔源抗體 為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
[0047] 4.酶標(biāo)板的制備 用包被緩沖液將黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原、抗體或抗抗體稀釋成0. 02μg/ml，每孔加入 100μ1，37°C溫育化或4°C過夜，傾去包被液，用稀釋的濃縮洗涂液洗涂2次，每次30秒，甩 掉孔中液體，W吸水紙吸除殘余水分后，向每孔中加入200μ1封閉液，37°C溫育化，傾去孔 內(nèi)液體，干燥后用侶膜真空密封，4°C干燥處保存?zhèn)溆谩?br>[0048] 包被液為為抑值為9. 6,0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液。
[0049] 封閉液為含有8%脫脂奶粉，抑值7. 4、0. 2mol/L的憐酸鹽緩沖液，所述百分比為 重量體積比。
[0050] 5.酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的制備 將抗抗體與辣根過氧化物酶（HR)采用改良后的過艦酸鋼法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過艦 酸鋼法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4 : 1;由于辣根過氧化物酶在強(qiáng)氧化 的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，