一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11?氧化?羅漢果醇的方法，屬于藥物前體或保健品技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括如下步驟：步驟一：酶水解羅漢果皂苷V；步驟二：smith降解：(1)高碘酸鈉氧化開裂；(2)硼氫化鈉還原；(3)水解。本發(fā)明聯(lián)用酶水解和氧化裂解兩種方法，首先利用酶水解掉羅漢果皂苷V的部分糖殘基，降低糖鏈的復(fù)雜度，再用氧化裂解的方法最終制備羅漢果醇和11?氧化?羅漢果醇兩種羅漢果皂苷元。本發(fā)明的方法，適用于大量樣品的制備，產(chǎn)率高，而且可以同時獲得羅漢果醇和11?氧化?羅漢果醇兩種苷元。
【專利說明】
一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11 -氧化-羅漢果 醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇的方 法，屬于藥物前體或保健品技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 羅漢果是萌蘆科藤本植物羅漢果（Siraitia grosvenorii)的果實，具有清熱潤 肺，利咽開音，滑腸通便的功效。羅漢果的主要有效成分為羅漢果皂苷(mogroside)，成熟羅 漢果主要富含苷元連接5個糖的羅漢果皂苷V(M 〇gr〇Side V)，其甜度為蔗糖的300倍以上， 而熱量幾乎為零。日本學(xué)者研究報道，羅漢果皂苷V有抗促癌作用，可作為癌癥的化學(xué)預(yù)防 劑。其苷元為萌蘆燒型的四環(huán)三砲羅漢果醇(mogrol)及11-氧化-羅漢果醇（ll-0-mogrol)， 結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0004] 本
【申請人】通過前期試驗，發(fā)現(xiàn)羅漢果皂苷除了少數(shù)以一糖苷和二糖苷的形式進入 血液，絕大部分是以苷元的形式進入血液，可見羅漢果皂苷元是其藥用活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。為 了進一步對其作用機理進行研究并高效的開發(fā)利用，需要大量制備羅漢果皂苷元。
[0005] 制備皂苷苷元的方法通常包括:氧化裂解、酸水解以及酶解法，但是直接應(yīng)用在羅 漢果皂苷上卻各自存在不足。傳統(tǒng)的氧化裂解方法(smith法）因為氧化劑高碘酸鈉與鄰羥 基反應(yīng)后生成碘離子，而碘離子又會與未反應(yīng)的高碘酸鈉發(fā)生復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致氧 化劑大量消耗，因此反應(yīng)必須在較低的溫度下進行以抑制該副反應(yīng)，對于含有較長或復(fù)雜 糖鏈的底物要達到完全反應(yīng)所需的時間非常長，不適合大量樣品的制備。使用酶水解法，則 因為產(chǎn)物溶解度的原因，只能部分水解羅漢果皂苷的糖鏈，無法達到獲得苷元的目的。酸水 解法則因為對苷元的破壞太強，產(chǎn)率過低同樣不適于制備羅漢果皂苷元。
[0006] 鑒于此，有必要開發(fā)一種新的方法，來解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢 果醇和11-氧化-羅漢果醇的方法。本發(fā)明聯(lián)用酶水解和氧化裂解兩種方法，首先利用酶水 解掉羅漢果皂苷V的部分糖殘基，降低糖鏈的復(fù)雜度，再用氧化裂解的方法最終制備羅漢果 醇和11-氧化-羅漢果醇兩種羅漢果皂苷元。本發(fā)明的方法，適用于大量樣品的制備，產(chǎn)率 高，而且可以同時獲得羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇兩種苷元。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢 果醇和11-氧化-羅漢果醇的方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟一:酶水解羅漢果皂苷V
[0010] 取水解酶，溶于水中，所述水解酶與水的質(zhì)量比例為1:100，取上清液，調(diào)節(jié)PH=2-6，得到酶解液;取羅漢果皂苷V，采用所述酶解液溶解，所述羅漢果皂苷V與所述酶解液的質(zhì) 量比例為1:50-100，反應(yīng)12-24h，加乙醇終止反應(yīng)，過濾后，得到混合皂苷溶液；
[0011]步驟二：smith 降解 [0012] (1)高碘酸鈉氧化開裂
[0013] 在步驟一得到的混合皂苷溶液中，加入混合皂苷溶液體積1-3%的醋酸，攪拌下緩 慢加入高碘酸鈉溶液，所述羅漢果皂苷V與所述高碘酸鈉摩爾比例為1:2-5,避光在20_80°C 下攪拌反應(yīng)，得到高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液；
[0014] (2)硼氫化鈉還原
[0015] 蒸干步驟（1)得到的高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液，殘渣中加入乙醇，過濾溶液， 濾液中緩慢加入硼氫化鈉固體，所述羅漢果皂苷V與硼氫化鈉的摩爾量比例為1:5-10,攪拌 反應(yīng)5-12h，得到硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液；
[0016] (3)水解
[0017] 在步驟(2)得到的硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液中，加入水稀釋，所述反應(yīng)液與水的體 積比例為1:0.5-1:2，加酸調(diào)節(jié)pH = 1，20-60 °C水浴攪拌2-8h，加堿調(diào)節(jié)pH=6-7，蒸出乙醇， 用乙酸乙酯萃取，萃取次數(shù)多1次，合并乙酸乙酯相，蒸干乙酸乙酯后，采用硅膠柱柱層析分 離，分別得到所述羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇。
[0018] 本發(fā)明的方法，適用于大量樣品的制備，產(chǎn)率高，而且可以同時獲得羅漢果醇和 11-氧化-羅漢果醇兩種苷元。
[0019] 本發(fā)明的原理：
[0020]步驟一的酶水解羅漢果皂苷V，目的是減少羅漢果皂苷V的葡萄糖殘基數(shù)量，通常 情況下使混合皂苷中三糖苷成為主要產(chǎn)物有利于隨后的反應(yīng)。
[0021 ]步驟二的Smith反應(yīng)，包括三步：（1)高碘酸鈉氧化葡萄糖殘基使之開環(huán)；（2)硼氫 化鈉還原前一步氧化生成的醛基為醇；（3)酸存在下水解脫除前一步生成的多元醇獲得苷 元。其中第一步氧化裂解是整個反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，葡萄糖氧化開環(huán)的程度決定了整個反應(yīng) 的產(chǎn)率。
[0022]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進。
[0023]進一步，步驟一中，所述pH調(diào)節(jié)的方式為檸檬酸、醋酸、磷酸中的一種。
[0024]采用上述進一步的有益效果是:有利于對羅漢果皂苷V的水解。
[0025] 進一步，步驟一所得混合皂苷溶液經(jīng)HPLC檢測，混合皂苷溶液中的羅漢果皂苷V含 量多30%，則重復(fù)步驟一，直到混合皂苷溶液中的羅漢果皂苷V含量〈30%。
[0026]采用上述進一步的有益效果是:可以盡可能降低皂苷中糖殘基的含量，有利于后 續(xù)步驟的反應(yīng)。
[0027]進一步，步驟二(3)中，所述反應(yīng)液與水的體積比例為1: 1。
[0028]進一步，步驟二(3)中，步驟二(3)中，所述加酸調(diào)節(jié)pH的方式為鹽酸或硫酸。
[0029] 進一步，步驟二(3)中，所述加堿調(diào)節(jié)pH的方式為碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鉀或氫氧 化鈉中的一種。
[0030] 進一步，步驟二(3)中，所述乙酸乙酯萃取的次數(shù)為3次。
[0031] 進一步，步驟二(3)中，所述硅膠柱層析中展開劑為體積比8:1-2:1的二氯甲烷和 乙酸乙酯的混合物。
[0032] 采用上述進一步的有益效果是:可以獲得不同純度及組成的兩種皂苷元產(chǎn)品。 [0033]本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 1.本發(fā)明聯(lián)用酶水解和氧化裂解兩種方法，首先利用酶水解掉羅漢果皂苷V的部 分糖殘基，降低糖鏈的復(fù)雜度，再用氧化裂解的方法最終制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇兩種羅漢果皂苷元。本發(fā)明的方法，適用于大量樣品的制備，產(chǎn)率高，而且可以同時獲得 羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇兩種苷元。
[0035] 2.本發(fā)明的制備方法條件溫和，極大的保留了苷元的化學(xué)完整性，副產(chǎn)物少，尤其 適合制備天然豐度很低其它方法難以制備的11-氧化-羅漢果醇。
【具體實施方式】
[0036] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā) 明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0037] 實施例1
[0038]本實施例的酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇的方法，包 括如下步驟：
[0039] 步驟一:酶水解羅漢果皂苷V
[0040] 取6g水解酶，溶于600mL水中，取上清液，用醋酸調(diào)節(jié)pH= 2，得到酶解液;取6g羅漢 果皂苷V，采用50mL的上述酶解液溶解，反應(yīng)24h，加乙醇終止反應(yīng)，過濾后，得到150mL混合 皂苷溶液；
[0041 ]步驟二：smith 降解 [0042] (1)高碘酸鈉氧化開裂
[0043]在步驟一得到的混合皂苷溶液中，加入lmL醋酸，攪拌下緩慢50mL高碘酸鈉溶液， 避光在20°C下攪拌反應(yīng)，得到高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液；
[0044] (2)硼氫化鈉還原
[0045]蒸干步驟（1)得到的高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液，殘渣中加入1 OOmL乙醇，過濾 溶液，濾液中緩慢加lg硼氫化鈉固體，攪拌反應(yīng)5h，得到硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液；
[0046] (3)水解
[0047] 在步驟(2)得到的硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液，加入50mL的水稀釋，加鹽酸調(diào)節(jié)pH = 1，20°C水浴攪拌8h，加碳酸鉀調(diào)節(jié)pH=6,蒸出乙醇，用乙酸乙酯萃取1次，合并乙酸乙酯相， 蒸干乙酸乙酯后，硅膠柱柱層析分離，所述硅膠柱層析中展開劑為體積比8:1的二氯甲烷和 乙酸乙酯的混合物，即分別得到所述羅漢果醇1.45g和11-氧化-羅漢果醇0.41g。
[0048] 實施例2
[0049] 本實施例的酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇的方法，包 括如下步驟：
[0050] 步驟一:酶水解羅漢果皂苷V
[00511 取l0g水解酶，溶于l000mL水中，取上清液，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH=4，得到酶解液；取 100g商品羅漢果皂苷V(50%含量），采用1000mL的上述酶解液溶解，反應(yīng)18h，加乙醇終止反 應(yīng)，過濾后，得到2000mL混合皂苷溶液；
[0052]步驟二：smith 降解 [0053] (1)高碘酸鈉氧化開裂
[0054]在步驟一得到的混合皂苷溶液中，加入20mL醋酸，攪拌下緩慢400mL高碘酸鈉溶 液，避光在50°C下攪拌反應(yīng)，得到高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液；
[0055] (2)硼氫化鈉還原
[0056]蒸干步驟(1)得到的高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液，殘渣中加入1 OOOrnL乙醇，過濾 溶液，濾液中緩慢加入40g硼氫化鈉固體，攪拌反應(yīng)8h，得到硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液；
[0057] (3)水解
[0058] 在步驟(2)得到的硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液，加入2000mL的水稀釋，加鹽酸調(diào)節(jié)pH =1，50 °C水浴攪拌5h，加碳酸鈉調(diào)節(jié)pH= 7，蒸出乙醇，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯 相，蒸干乙酸乙酯后，硅膠柱柱層析分離，所述硅膠柱層析中展開劑為體積比5:1的二氯甲 烷和乙酸乙酯的混合物，即分別得到所述羅漢果醇16g和11-氧化-羅漢果醇5.8g。
[0059] 實施例3
[0060] 本實施例的酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇的方法，包 括如下步驟：
[0061 ] 步驟一:酶水解羅漢果皂苷V
[0062] 取30g水解酶，溶于3000mL水中，取上清液，用磷酸調(diào)節(jié)pH=6，得到酶解液;取500g 商品羅漢果皂苷V(50%含量），采用3000mL的上述酶解液溶解，反應(yīng)12h，加乙醇終止反應(yīng)， 過濾后，得到5000mL混合皂苷溶液，經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)溶液中羅漢果皂苷V相對含量為38 %， 蒸干溶劑，再次以3000mL酶解液溶解反應(yīng)8小時，加乙醇終止反應(yīng)，過濾后，得到6000mL混合 皂苷溶液；
[0063]步驟二：smith 降解 [0064] (1)高碘酸鈉氧化開裂
[0065]在步驟一得到的混合皂苷溶液中，加入150mL醋酸，攪拌下緩慢2000mL高碘酸鈉溶 液，避光在50°C下攪拌反應(yīng)，得到高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液；
[0066] (2)硼氫化鈉還原
[0067]蒸干步驟（1)得到的高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液，殘渣中加入5000mL乙醇，過濾 溶液，濾液中緩慢加入200g硼氫化鈉固體，攪拌反應(yīng)12h，得到硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液； [0068] ( 3)水解
[0069] 在步驟(2)得到的硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液，加入5000mL的水稀釋，加硫酸調(diào)節(jié)pH =1，50 °C水浴攪拌5h，加氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH = 7，蒸出乙醇，用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙 酯相，蒸干乙酸乙酯后，硅膠柱柱層析分離，所述硅膠柱層析中展開劑為體積比2:1的二氯 甲烷和乙酸乙酯的混合物，即分別得到所述羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇混合產(chǎn)品198g。
[0070] 對比例
[0071] 以現(xiàn)有技術(shù)中的酸水解為對比例
[0072] 酸水解是制備三萜皂苷苷元最常用的方法，由于與酶水解相同，受到一糖苷水溶 性的限制，反應(yīng)必須選擇在水/醇體系中進行，本
【申請人】考察了不同酸水解條件對羅漢果醇 (11-氧化-羅漢果醇天然豐度太低，多個樣品未能檢出，因此沒有列出）產(chǎn)率的影響，如表1 所示：
[0073]表1不同條件下的酸水解
[0074]
[0075] 由表1可見，以強酸水解羅漢果皂苷產(chǎn)率較低，無法達到制備苷元的要求，這是由 于苷元上同時存在一個叔羥基和三個仲羥基，在酸性條件下容易被活化而引起一系列的副 反應(yīng)所致。由此可見，酸水解法不僅產(chǎn)率極低，而且無法用于制備11-氧化-羅漢果醇。
[0076] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇的方法，其特征在 于，包括如下步驟： 步驟一:酶水解羅漢果皂苷V 取水解酶，溶于水中，所述水解酶與水的質(zhì)量比例為1:100,取上清液，調(diào)節(jié)pH=2-6,得 到酶解液;取羅漢果皂苷V，采用所述酶解液溶解，所述羅漢果皂苷V與所述酶解液的質(zhì)量比 例為1:50-100，反應(yīng)12-24h，加乙醇終止反應(yīng)，過濾后，得到混合皂苷溶液； 步驟二:smith降解 (1) 高碘酸鈉氧化開裂 在步驟一得到的混合皂苷溶液中，加入混合皂苷溶液體積1-3%的醋酸，攪拌下緩慢加 入高碘酸鈉溶液，所述羅漢果皂苷V與所述高碘酸鈉摩爾比例為1:2-5，避光在20-80 °C下攪 拌反應(yīng)，得到高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液； (2) 硼氫化鈉還原 蒸干步驟（1)得到的高碘酸鈉氧化開裂后的反應(yīng)液，殘渣中加入乙醇，過濾溶液，濾液 中緩慢加入硼氫化鈉固體，所述羅漢果皂苷V與硼氫化鈉的摩爾量比例為1:5-10,攪拌反應(yīng) 5-12h，得到硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液； (3) 水解 在步驟(2)得到的硼氫化鈉還原后的反應(yīng)液中，加入水稀釋，所述反應(yīng)液與水的體積比 例為1:0.5-1:2，加酸調(diào)節(jié)pH = 1，20-60°C水浴攪拌2-8h，加堿調(diào)節(jié)pH=6-7，蒸出乙醇，用乙 酸乙酯萃取，萃取次數(shù)多1次，合并乙酸乙酯相，蒸干乙酸乙酯后，采用硅膠柱柱層析分離， 分別得到所述羅漢果醇和11-氧化-羅漢果醇。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇的方法，其特征在于，步驟一中，所述PH調(diào)節(jié)的方式為檸檬酸、醋酸、磷酸中的一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇的方法，其特征在于，步驟一所得混合皂苷溶液經(jīng)HPLC檢測，混合皂苷溶液中的羅漢果皂 苷V含量多30%，則重復(fù)步驟一，直到混合皂苷溶液中的羅漢果皂苷V含量〈30%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇的方法，其特征在于，步驟二(3)中，所述反應(yīng)液與水的體積比例為1:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇的方法，其特征在于，步驟二(3)中，所述加酸調(diào)節(jié)pH的方式為鹽酸或硫酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇的方法，其特征在于，步驟二(3)中，所述加堿調(diào)節(jié)pH的方式為碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鉀 或氫氧化鈉中的一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇的方法，其特征在于，步驟二(3)中，所述乙酸乙酯萃取的次數(shù)為3次。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶水解與氧化裂解聯(lián)用制備羅漢果醇和11-氧化-羅漢果 醇的方法，其特征在于，步驟二(3)中，所述硅膠柱層析中展開劑為體積比8:1-2:1的二氯甲 烷和乙酸乙酯的混合物。
【文檔編號】C12P33/00GK105950695SQ201610521201
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】王磊, 李炳辰, 羊?qū)W榮, 符毓夏, 李典鵬
【申請人】廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所