的聚乙烯生物降解能力。
[0147] C208聚乙烯生物降解活性的初始優(yōu)化表明木聚糖明確地影響了這種C208、漆酶和 聚乙烯生物降解活性。具體而言，圖10中的結(jié)果顯示木聚糖而非銅誘導(dǎo)了C208漆酶的活性。
[0148] 實(shí)施例5
[0149] 誘導(dǎo)時間對漆酶對PE的氧化的影響
[0150]當(dāng)使用FTIR分析來分析PE與漆酶的溫育時間的影響時，清楚的是PE與漆酶的溫育 時間越長，得到的羰基指數(shù)值越高。在此，當(dāng)PE樣品與漆酶溫育14天時，得到最高的羰基指 數(shù)(圖31)。
[0151]當(dāng)使用DSC分析來分析樣品結(jié)果時，所得到的結(jié)果符合FTIR結(jié)果。在DSC的結(jié)果中， 清楚的是當(dāng)與原始樣品比較時，PE樣品經(jīng)歷了改變。在溫育了 14天的樣品中改變的熔融溫 度以及結(jié)晶度（圖32)。
[0152]使用掃描電子顯微鏡（SEM)分析之前所得的樣品，以查看在PE的表面上是否有任 何改變。圖33可見，當(dāng)將與漆酶溫育14天后的PE(圖33C)與對照（圖33B)和原始PE(圖33A)相 比較時，PE的表面產(chǎn)生相當(dāng)大的改變。盡管對照和原始的未經(jīng)處理的PE的表面開起來相當(dāng) 光滑，但是在與漆酶溫育后，其看起來是膨脹的，或者甚至被破壞。該現(xiàn)象的一種可能的解 釋在于漆酶氧化了 PE的表面，并且其得到上文所討論的FTIR分析的支持。
[0153] 實(shí)施例6
[0154] 由712細(xì)菌菌株得到的酶在E. Col i中的表達(dá)
[0155] 基于N C B I網(wǎng)站，測序土壤短芽孢桿菌菌株中的多銅氧化酶基因 (ACCESSI0NELK42526)。在該過程中使用的引物為Lac-agri F，Lac-agri R，Lac-F3'，Lac-F5，。
[0156] Lac-agri F:5，ATGAACAAATCATCGTTACGAAG 3,（SEQ ID N0:4)
[0157] Lac-agri R:5'TTACTCCGGCATGTTGCCGACGG 3'(SEQ ID N0:5)
[0158] Lac-F3'：5'TCATTTTC GC GTC GCTCATGTTCG 3'（SEQ ID N0:6)
[0159] Lac-F5':5'AATGTGCTGCCAGGCGAGTCCTAC 3'(SEQ ID NO:7)
[0160] 所得的序列示于圖34中?；谠撔蛄?，涉及用于pET41a，pET28和pET41-mbp的引 物。使用Geneious程序和NEBcutter網(wǎng)站來設(shè)計引物。
[0161] 為了切割pET41a和pET41-mbp，使用以下引物：
[0162] Fr-Lac-MfeI-pET41(MfeI限制性位點(diǎn)）：
[0163] 5'-ATGCTACAATTGATATGAACAAATCATCGTTACGAAGC-3'(SEQ ID NO:8)
[0164] Fr-Lac_SpeI-pEt41(Spel限制性位點(diǎn)）：
[0165] 5'-TAGCTAACTAGTATGAACAAATCATCGTTACGAAGC-3'(SEQ ID NO:9)
[0166] Rev-Lac_NotI-pET41(Notl限制性位點(diǎn)）：
[0167] 5'-ATGTCATGCGGCCGCCTCCGGCATGTTGCCGACGGTCG-3'（SEQ ID N0:10)
[0168] 為了切割pET28a，使用以下引物：
[0169] Fr-Lac-Nde_pET28(Nde限制性位點(diǎn)）：
[0170] 5'-ATCGTACCATATGAACAAATCATCGTTACGAAGC-3'(SEQ ID NO:11)
[0171 ] Rev-Lac-Xho_pET28(Xho限制性位點(diǎn)）：
[0172] 5'-ATGCTACCTCGAGTTTACTCCGGCATGTTGCCGACGGTCG-3'(SEQ ID NO:12)
[0173] 使用1%瓊脂糖凝膠來分析具有上文提及的引物的多銅氧化酶基因的擴(kuò)增VPCR產(chǎn) 物(圖35)。該凝膠清楚地顯示使用所述的引物、所述的基因良好地擴(kuò)增。
[0174] 在所述的質(zhì)粒經(jīng)切割和連接后，其被轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.Coli細(xì)菌Clooni菌株中，并 實(shí)施菌落PCR。使用1%瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物（圖26)表明當(dāng)與陽性對照（由土壤短芽孢桿 菌擴(kuò)增的基因）相比時，菌落1，2，8，9，10，11，12和菌落15疑似為所述基因是陽性的。由原始 細(xì)菌(土壤短芽孢桿菌)擴(kuò)增的漆酶基因作為陽性對照。對于陰性對照，使用擴(kuò)增的未修飾 的質(zhì)粒(使用與用于分析修飾的質(zhì)粒的相同的質(zhì)粒）。
[0175] 所有陽性菌落(菌落數(shù)1，2，8,9,10,11，12,15)的質(zhì)粒都被清潔并測序，并且根據(jù) 在Geneious程序進(jìn)行的比對(未示出），菌落數(shù)1，2，10和15是真陽性的。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 感受態(tài)E.Coli細(xì)菌(BL21菌株）中，并且在10%SDS電泳PAGE上分析這些細(xì)菌的酶表達(dá)（圖 37)。質(zhì)粒41a，28a和41mbp用作陰性對照，并將其轉(zhuǎn)化至所述的細(xì)菌中。由于所述的蛋白質(zhì) 在菌落15中最佳表達(dá)，所以由這一點(diǎn)而言，顯然我們應(yīng)該使用菌落15來工作。
[0176] 接著，檢查用于酶誘導(dǎo)的最佳溫度。當(dāng)比較由不同溫度下的酶誘導(dǎo)試驗(yàn)得到的溶 解產(chǎn)物蛋白質(zhì)組合物時，清楚的是在37°C下未大量地誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)，而在20°C和30°C下， 酶被大量地誘導(dǎo)（圖38)。在多個試驗(yàn)的每一個中，對照為由具有41mbp質(zhì)粒的E.Coli BL21 細(xì)菌得到的溶解產(chǎn)物。
[0177] 誘導(dǎo)介質(zhì)中的銅濃度:在不同濃度的銅存在下進(jìn)行誘導(dǎo)時，實(shí)施產(chǎn)生蛋白質(zhì)的活 性的分析（圖39)。在多個試驗(yàn)的每一個中，對照為由具有41mbp質(zhì)粒的E.Coli BL21細(xì)菌得 到的溶解產(chǎn)物。在銅濃度為2mM下，得到最佳的溶解產(chǎn)物的活性。顯然從現(xiàn)在開始使用該濃 度來工作。在所有的處理中都得到酶(圖39)。
[0178] 實(shí)施例7
[0179] 在直鏈淀粉微珠的柱上，在蛋白質(zhì)純化過程中使用的洗滌和洗脫緩沖劑中的銅濃 度
[0180] 檢查在純化過程中結(jié)合和洗脫緩沖劑中銅濃度的影響（圖40和41)。清楚地表明銅 濃度為300μ Μ的銅最佳地用于蛋白質(zhì)的純化過程。所有原液均包含蛋白質(zhì)濃度為lmg/mL的 酶。
[0181] 在直鏈淀粉微珠上清潔重組的酶，并使用凝血酶進(jìn)行切割。然后，使用mono Q柱 (強(qiáng)陰離子交換劑)對其進(jìn)行純化。純化過程是高效的，由此在280nm波長下得到2個清晰的 峰。在330nm波長下得到另一個峰，其中在多銅氧化酶催化位點(diǎn)中的III型銅得到最大的吸 光率，表明酶被洗脫。使用10%SDS PAGE分析不同的蛋白質(zhì)級份，并且實(shí)際上在A14，A15和 B1級份中得到純的蛋白質(zhì)（~60KDa)，而mbp蛋白質(zhì)（~40KDa)處于A1中（圖42)。
[0182] 實(shí)施例8
[0183] ABTS的最佳濃度
[0184] 檢驗(yàn)用于比色反應(yīng)的最佳ABTS濃度（圖43)。發(fā)現(xiàn)最佳濃度為80mM ABTS，并繪制 ]\1；[(311&61丨8]\161^611曲線。該組(311&61丨8]\161^611曲線表明酶的1(1]1為4〇111]\^1^3，并且其￥1]1&叉為 220mol/min〇
[0185] 實(shí)施例9
[0186] 溫度對純化酶的活性的影響
[0187] 在相同濃度的酶存在下，在不同的溫度下，分析在SOmMABTS存在下純化酶的活性 (圖44)。得到的結(jié)論為65 °C為酶活性的最佳溫度。
[0188]此外，還檢查酶的存活能力（圖45)。結(jié)果表明在檢查之前在不同溫度下預(yù)溫育所 述的酶使得其活性降低。當(dāng)比較在不同溫度下預(yù)溫育30分鐘對酶的影響時，將酶在50°C下 預(yù)溫育使得酶活性降低最?。?1%)。應(yīng)該提及的是存活能力和最佳活性溫度都低于原始酶 的存活能力和最佳活性溫度。這可能是由于產(chǎn)生所述的酶的細(xì)菌。
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其包含聚乙烯和漆酶，所述的漆酶在60 °C至100 °C的溫度下具有最佳的 比活。2. 權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的組合物被保持在60°C至100°C的溫度下。3. 權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的漆酶包含SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列。4. 權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的漆酶選自波茨坦短芽孢桿菌漆酶或土壤短芽 孢桿菌漆酶。5. 權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的漆酶為細(xì)胞外漆酶。6. 權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含Cu2+，木聚糖或這二者。7. 權(quán)利要求1所述的組合物，其pH為7.5至8.5。8. -種組合物，其包含聚乙烯、漆酶和木聚糖。9. 權(quán)利要求8所述的組合物，其包含赤紅球菌菌株C208。10. 權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的聚乙烯是熱氧化的。11. 一種用于分解聚乙烯的方法，其包括將聚乙烯與在60°C至100°C的溫度下具有最佳 比活的漆酶相接觸的步驟。12. 權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述的聚乙烯和所述的漆酶保持在60°C 至100°C的溫度下。13. 權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述的聚乙烯和所述的漆酶保持在pH7.5 至8.5下。14. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的漆酶包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。15. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的漆酶選自波茨坦短芽孢桿菌漆酶或土壤短芽 孢桿菌漆酶。16. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的漆酶為細(xì)胞外漆酶。17. 權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包括將選自Cu2+和木聚糖的至少一種添加劑加入 至所述的漆酶中。18. -種用于分解聚乙烯的方法，其包括將聚乙烯與波茨坦短芽孢桿菌、土壤短芽孢桿 菌、或者波茨坦短芽孢桿菌和土壤短芽孢桿菌的組合相接觸的步驟，其中所述的聚乙烯為 用于所述的細(xì)菌的唯一碳源。19. 權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述的聚乙烯，以及所述的波茨坦短芽孢 桿菌、土壤短芽孢桿菌、或者波茨坦短芽孢桿菌和土壤短芽孢桿菌的組合保持在35°C至50 °(：的溫度。20. 權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述的聚乙烯，以及所述的波茨坦短芽孢 桿菌、土壤短芽孢桿菌、或者波茨坦短芽孢桿菌和土壤短芽孢桿菌的組合保持在PH7.5至 pH8.5 〇21. 權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包括將選自Cu2+和木聚糖的至少一種添加劑加入 至所述的土壤短芽孢桿菌中。22. -種用于分解聚乙烯的方法，其包括將包含聚乙烯和木聚糖的組合物與赤紅球菌 菌株C208相接觸的步驟。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種包含聚乙烯和漆酶的組合物，其中所述的漆酶在60℃至100℃的溫度下和/或在木聚糖存在下具有最佳的比活。此外，本發(fā)明涵蓋了通過將在60℃至100℃的溫度下具有最佳比活的漆酶與塑料相接觸，或者將表達(dá)在60℃至100℃的溫度下具有最佳比活的漆酶的微生物有機(jī)體與塑料相接觸，從而生物降解/分解塑料的方法。
【IPC分類】C07C4/22, C07C9/22, C12P1/04, C12N9/02, C08J11/04, C12N1/28
【公開號】CN105658791
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】A·西萬, A·阿哈龍尼, O·普雷斯
【申請人】B.G內(nèi)蓋夫科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年4月6日