因此，例如參照"治療試劑"包括參照多于一種的治療試劑。
[0107] 除非內(nèi)容中特異地或明顯地說明，如本文所用，術(shù)語"或"可以理解為包含一切在 內(nèi)的。
[0108] 術(shù)語"包含"在本文中用于指短語"包含但不限于"，并且可以與該短語交換使用。 [0109]如本文所用，術(shù)語"包含"（動詞形式）、"包含"（分詞形式）、"含有"、"具有"等可以 具有在美國專利法中屬于這些詞語的含義，并且可以是指"包括"（動詞形式）、"包括"（分詞 形式)等；"基本由……組成"或"基本組成"等具有在美國專利法中所述的含義，并且這些術(shù) 語是無限度的，從而允許存在多于一個的所列舉的項目，只要所列舉的項目的基本或新的 特征沒有被存在的多于一個的所列舉的項目所改變，而且排除了現(xiàn)有技術(shù)的實施方案。在 另一個實施方案中，術(shù)語"包含"包括術(shù)語"組成"。
[0110]除非內(nèi)容中特異地或明顯地說明，如本文所用，術(shù)語"大約"理解為在本領(lǐng)域的正 常限度范圍內(nèi)，例如在平均值的2個標準偏差范圍內(nèi)。大約可以理解為在所述的值的10%， 9% ,8% ,7% ,6% ,5% ,4% ,3% ,2% ,1% ,0.5% ,0.1% ,0.05%或0.01%的范圍內(nèi)。除非內(nèi) 容中另外清楚地說明，本文提供的所有數(shù)值都通過術(shù)語大約來修飾。
[0111] 本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和新的特征在檢驗以下實施例的時對于本領(lǐng)域的任一普 通技術(shù)人員而言是顯而易見的，其中所述的實施例無意于是限定性的。此外，上文所描述的 以及所附的權(quán)利要求書中所要求的本發(fā)明的多個實施方案和方面的每一個在以下實施例 中都找到了試驗支持。 實施例
[0112] 通常，本文中使用的命名系統(tǒng)和本發(fā)明使用的試驗室程序包括分子、生物化學、微 生物學和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻中有充分的說明。例如參見"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等人，（1989); "Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed. (1994) ;Ausubel等人，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989);Perbal，〃A Practical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley&Sons，New York(1988);Watson等 人，''Recombinant DNA〃，Scientific American Books, New York;Birren 等人（eds)〃 Genome Analysis : A Laboratory Manual Series"，Vols·1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York( 1998);在美國專利No · 4，666，828; 4，683，202; 4，801，531; 5， 192,659和5,272,057中列出的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；^Culture ofAnimal Cells-A Manual of Basic Technique〃by Freshney,ffiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；^Current Protocols in Immunology ^Volumes I-III Coligan J.E.，ed. (1994) ;Stites 等人(eds)，〃Basic and Clinical Immunology"（8th Edition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994);Mishell和 Shi igi (eds)，''Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual〃CSHL Press( 1996);所有這些文獻均以引用方式并入本文。其 他一般的參考文獻在本文件中提供。
[0113] 實施例1
[0114] 由土壤細菌得到的新分離的漆酶對聚乙烯的生物降解
[0115] 本研究致力于細菌漆酶的活性的誘導和優(yōu)化，其中所述的漆酶被發(fā)現(xiàn)與塑料的生 物降解有關(guān)。
[0116]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2種土壤細菌顯示出有利的聚乙烯生物降解能力。根據(jù)2種細菌的 16SrRNA基因?qū)ζ溥M行測序，并識別為波茨坦短芽孢桿菌和土壤短芽孢桿菌。16SrRNA基因 示于圖11中。圖12示出以赤紅球菌作為外來菌株，基于它們的16SrRNA序列的2種菌株的系 統(tǒng)進化樹。
[0117] 2種菌株的特征表明它們的嗜熱的，波茨坦短芽孢桿菌的最佳生長溫度為40°C，土 壤短芽孢桿菌的最佳生長溫度為45°C (圖1)。此外，還發(fā)現(xiàn)最佳pH生長條件為pH = 6.0至pH =7(圖 2)。
[0118] 其他的證據(jù)顯示2種菌株均產(chǎn)生細胞外漆酶，其在80°C下展示出最佳活性（圖3和 圖17)。與細菌的最佳生長溫度相比，所述的最佳溫度相對較高，可能的情況是由使用所述 的酶的細菌的超嗜熱祖先經(jīng)過進化后存留的細菌衍生得到的。
[0119] 為了了解在高溫下溫育對所述的酶的影響，檢驗在不同溫度下的漆酶的存活（圖 18)。在該檢驗過程匯總，將漆酶在不同的溫度下溫育30或90分鐘，然后進行活性檢驗。發(fā) 現(xiàn)，酶在土壤短芽孢桿菌中最佳存活的溫度為80°C，在該溫度下，所述的酶顯示其活性降低 4%〇
[0120]當細菌與聚乙烯溫育時，注意，土壤短芽孢桿菌比波茨坦短芽孢桿菌具有更好的 生物降解能力（圖8)。
[0121] 當使用SEM顯微鏡放大10000倍時，與對照相比，聚乙烯的生物降解從表面上來看 是清除可見的（圖9)。
[0122] 對土壤短芽孢桿菌的細菌生長進行表征。如圖13所示，細菌在300分鐘后進入靜止 期。此外，制作用于活性分析的最佳生長時間，發(fā)現(xiàn)，土壤短芽孢桿菌的最佳分析時間為2天 (圖 16)。
[0123] 實施例2
[0124] 細胞外漆酶的分泌
[0125] 在2,6_二甲氧基苯酚(DMP)存在下，檢驗細胞外漆酶的分泌，發(fā)現(xiàn)所述的漆酶與生 物降解過程有關(guān)。酶的這種底物的氧化使得溶液的顏色變成棕黃色。在細胞外的酶與30mM DMP在室溫下溫育19個小時后，與空白相比（圖14)，得到棕色（圖15)。這表明漆酶被分泌至 細胞外的介質(zhì)中。
[0126] 實施例3
[0127] 不同添加劑對漆酶活性的影響
[0128] 為了改善酶活性，檢驗加入至細菌生長介質(zhì)中不同添加劑的影響。檢驗對2種漆酶 的誘導和活性的影響。檢驗以下添加劑:銅(Cu 2+)、ABTS、木聚糖、銅與木聚糖的協(xié)同作用、鈷 和鎳。
[0129] 評價加入至生長介質(zhì)中的Cu2+對2種細菌中漆酶的誘導和活性的影響。在波茨坦短 芽孢桿菌中，發(fā)現(xiàn)加入濃度增加的Cu2+使得漆酶的誘導較低，但是比活較高（圖4和5)。 [0130]在土壤短芽孢桿菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)加入濃度增加的Cu2+使得漆酶的誘導和比活被改 善（圖6)。此外，監(jiān)測Cu濃度對土壤短芽孢桿菌中漆酶濃度的影響（圖7)。銅對酶的誘導和活 性的陽性影響可以通過以下事實說明：銅構(gòu)成了酶催化位點的一部分。因此，增加銅的水平 使得更多活性的酶被產(chǎn)生。
[0131] 還稱為2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的ABTS是已知的底物和漆酶介 導物。當分析ABTS的影響時，假設(shè)將其加入至反應(yīng)介質(zhì)中將改善酶的活性。濃度為0.1 % (v/ v)的ABTS使得土壤短芽孢桿菌中的漆酶被最佳地誘導（圖19)。濃度為0.01 % (v/v)的ABTS 使得土壤短芽孢桿菌中的漆酶的比活達到最佳(圖20)。
[0132] 當檢驗?zāi)揪厶堑挠绊憰r，發(fā)現(xiàn)，濃度增加的木聚糖使得土壤短芽孢桿菌中的漆酶 的誘導增加(圖21A)。濃度為lOOyg/mL的木聚糖得到最佳的漆酶比活(圖21B)。
[0133] 當分析木聚糖和銅的協(xié)同作用的影響時，發(fā)現(xiàn)，濃度增加的銅使得土壤短芽孢桿 菌中漆酶的誘導和比活均增加（圖22A-B)。應(yīng)該提及，當將這些結(jié)果與加入銅而得到的結(jié)果 相比較時，實際上誘導水平比銅和木聚糖誘導中的水平更高。
[0134] 此外，還檢驗二價金屬對漆酶誘導和活性的影響。所選的金屬為鈷(發(fā)現(xiàn)該金屬能 夠替換催化位點中的銅)和鎳(已知具有氧化能力的二價金屬）。
[0135] 當檢驗鈷的濃度對漆酶誘導和活性的影響時，發(fā)現(xiàn)在土壤短芽孢桿菌中，濃度為 20μΜ的鈷使得漆酶被最佳地誘導（圖23A)，濃度為ΙΟμΜ的鈷使得漆酶的比活最佳（圖 23Β)〇
[0136] 當分析鎳的濃度對漆酶的誘導和活性的影響時，發(fā)現(xiàn)在土壤短芽孢桿菌中，濃度 為20μΜ的鎳使得漆酶被最佳地誘導（圖24Α)，濃度為ΙΟμΜ的鎳使得漆酶的比活最佳（圖 24Β)。
[0137] 當比較不同添加劑對漆酶活性的影響時（圖25 )，發(fā)現(xiàn)，最佳添加劑為30μΜ〇ι2+或 100yg/mL 木聚糖+60μ M Cu2+。
[0138] 進一步檢驗不同添加劑(銅、以及銅和木聚糖的協(xié)同作用）的影響，并且在生物降 解聚乙烯(PE)之前與漆酶溫育7天。根據(jù)(傅里葉變換紅外光譜學)FTIR分析（圖26A-B)，當 PE在生物降解試驗之前未與漆酶溫育時，可見在lOug/mL木聚糖和60μΜ銅存在下，生物降 解試驗會產(chǎn)生最高的羰基指數(shù)，這表明發(fā)生了較好的生物降解過程。
[0139] 根據(jù)(示差掃描熱量計)DSC分析（圖27Α-Β)，未收到樣品結(jié)晶度之間明顯的差異。 可以假設(shè)，在生物降解試驗開始時，PE的生物降解開始于PE中無定形區(qū)域中，并且PE的結(jié)晶 百分率增加。然后，生物降解過程在聚合物的結(jié)晶區(qū)域繼續(xù)，由于該區(qū)域的氧化而在PE的結(jié) 晶區(qū)域發(fā)生空間擾亂，并且結(jié)晶百分率降低。
[0140]當PE在生物降解試驗之前與漆酶溫育時，所有樣品在FTIR分析中都收到較高的羰 基指數(shù)值（圖28A)。在此，與對照相比，所有樣品中都收到了較高的羰基指數(shù)（圖28B)，但是 特別是在比較加入銅與加入銅和木聚糖對細菌生長培養(yǎng)物的影響時，在不同的處理之間不 具有明顯的差異。
[0141] 當PE在生物降解試驗之前與漆酶溫育時，還收到較高的結(jié)晶度和熔融溫度（圖 29)，其可以表明聚合物的無定形部分被破壞，并得到更穩(wěn)定的聚合物。在2個試驗中，與712 菌株溫育的樣品的結(jié)晶度水平比其他試驗更高，這與以下理論有關(guān):生物降解開始于聚合 物的無定形部分，并且結(jié)晶度增加，然后在一些點處，開始結(jié)晶區(qū)域的生物降解，并且結(jié)晶 度降低。
[0142] 當在生物降解試驗之前分析與酶的溫育的影響時，清楚的是溫育形成了具有不同 熱性質(zhì)（例如熔融溫度）的PE，但是在聚合物的結(jié)晶度之間無較大的差異。這種熔融溫度的 改變表明獲得更穩(wěn)定的聚合物(圖30)。
[0143] 實施例4
[0144] 赤紅球細菌的漆酶在與木聚糖和/或銅溫育7天后對聚乙烯的生物降解
[0145] 類似于之前的實施例，本研究致力于細菌漆酶的活性的誘導以及優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)所述 的漆酶與塑料的生物降解有關(guān)。
[0146] 在本研究中，發(fā)現(xiàn)，赤紅球細菌(C208)顯示有利