用于生物降解塑料的組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明特別涉及基于嗜熱漆酶的組合物，以及使用嗜熱漆酶或表達(dá)該酶的微生物 有機(jī)體用于分解/生物降解塑料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類的工業(yè)活動不可避免地產(chǎn)生了工業(yè)廢物。這些工業(yè)廢物主要由工廠、農(nóng)業(yè)、漁 業(yè)和食品加工工業(yè)排放的無機(jī)和有機(jī)廢物組成。這些工業(yè)負(fù)擔(dān)了生物降解或處理這些廢物 的高成本。這些成本妨礙了這些及其他相關(guān)商業(yè)的市場擴(kuò)張。
[0003] 目前，已經(jīng)研發(fā)有機(jī)廢物發(fā)酵和處理系統(tǒng)用于利用這些廢物。使用這些系統(tǒng)，人們 目前可以產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，例如土壤改良試劑和堆肥。
[0004] 由于塑料通常更輕、更堅(jiān)固、更耐用且更防水，所以它們提供了多種優(yōu)點(diǎn)。但是，使 得傳統(tǒng)塑料成為用于許多用途的理想材料的上述性質(zhì)在這些材料有效期結(jié)束時還往往導(dǎo) 致環(huán)境問題，因?yàn)檫@些材料的固有強(qiáng)度和耐久性使得它們存留于環(huán)境中而未被降解。
[0005] 在消費(fèi)者使用后，塑料袋通常最為垃圾而最終存在于環(huán)境或垃圾填埋場中。由于 傳統(tǒng)塑料是不可生物降解的，所以被丟棄的塑料在上述任一地點(diǎn)都呈現(xiàn)出明顯的環(huán)境問 題。作為垃圾，塑料是可見的且普通的污染物(其為動物和海洋物種以及人類健康的威脅）。 在垃圾填埋場中，塑料袋增加了垃圾填埋場的體積、妨礙了垃圾填埋場的壓緊并延遲了陷 入其中的被丟棄的有機(jī)材料的生物降解，由此促進(jìn)了甲烷(一種有害的溫室氣體)的形成。
[0006] 根據(jù)全球環(huán)境保護(hù)，近來最重要的主題是構(gòu)建可以保持并持續(xù)的循環(huán)社會系統(tǒng)。 在該社會情況下，還作出了更多的努力來研發(fā)用于塑料廢物的再循環(huán)技術(shù)。用于塑料廢物 的再循環(huán)技術(shù)分成2種主要的類型:物理方法(熱再循環(huán)、材料再循環(huán))和化學(xué)方法(化學(xué)再 循環(huán)）。其中，前者的物理處理已經(jīng)在商業(yè)基礎(chǔ)上而實(shí)際用于PET或其他樹脂，因?yàn)槲锢硖幚?是相對簡單且成本有效的。但是，這種方法由于重復(fù)使用而不能避免質(zhì)量損失，由此所得的 再循環(huán)產(chǎn)物具有有限的用途。
[0007] 另一方面，在化學(xué)再循環(huán)的情況下，塑料廢物材料被破碎成單體或寡聚體，然后收 集這些單體或寡聚體并用作用于新塑料再合成的原材料。該方法可以產(chǎn)生于初級產(chǎn)物完全 相當(dāng)?shù)乃芰袭a(chǎn)物，并且不會引起質(zhì)量損失。根據(jù)這些事實(shí)，最近已經(jīng)理論研發(fā)出使用化學(xué)再 循環(huán)的產(chǎn)物，并且一部分該產(chǎn)物已經(jīng)被供應(yīng)出售。
[0008] 在將來，可生物降解的塑料將構(gòu)成塑料總產(chǎn)率的幾乎一半，并且還預(yù)計在將來，將 關(guān)注于研發(fā)用于塑料再循環(huán)的高效技術(shù)。目前循環(huán)中的可生物降解的塑料幾乎專門為聚酯 基塑料。這意味著對于這些塑料而言，可以非常容易地取得單體再循環(huán)，因?yàn)樗鼈兊膯误w成 分(例如有機(jī)酸和多羥基醇)通過對水解敏感的酯鍵來連接。
[0009] 但是，由于廢物包含預(yù)混的多種類型的材料，所以在實(shí)際上試圖再循環(huán)時，會產(chǎn)生 大問題。盡管需要分開收集廢物，但是當(dāng)考慮到丟棄廢物的人的覺悟以及分離收集所需的 時間和努力時，實(shí)際上不可能完全取得分離收集。具體而言，塑料產(chǎn)物通常使用了組合的大 量不同的塑料，并且目前使用的技術(shù)不能根據(jù)塑料的類型而分離所有的速率廢物。鑒于此， 在目前的環(huán)境，再循環(huán)局限于不管再循環(huán)技術(shù)如何都容易分離和收集的廢物。
[0010] 為了克服這種問題，已經(jīng)提出了新的工藝，其中使用酶用于塑料的化學(xué)降解。關(guān)于 由使用酶而得到的優(yōu)點(diǎn)，酶的底物特異性可以是優(yōu)異的特征，但是同樣重要的是多個反應(yīng) 可以在正常溫度下及在正常壓力下實(shí)施，由此節(jié)省了能量成本并且無需造成環(huán)境污染的有 機(jī)溶劑。通常，酶具有底物特異性，并且明確地選擇它們的靶物底物。因此，酶的組合(每種 酶僅對某種特異性塑料具有反應(yīng)性)允許由混合物形式的塑料廢物高效地提取高純度的單 體，而無需任何分離工藝。通常，生物工藝需要高成本，因此就這一點(diǎn)而言無疑是不利的，但 是其顯著的優(yōu)點(diǎn)是提取高純度的單體而無需分離。特別地，同樣鑒于以下事實(shí):可生物降解 的塑料是通過自然界中微生物有機(jī)體分泌的酶的作用而降解的，可以預(yù)計將研發(fā)使用了由 此類生物降解細(xì)菌衍生得到的酶的工藝。
[0011] 為了建立酶的再循環(huán)，前體是存在具有高底物特異性的強(qiáng)的降解塑料的酶。具體 而言，由于塑料廢物實(shí)際上以固體形式(例如碎片和/或小塊)被丟棄，所以降解固體的細(xì)菌 是特別重要的。
[0012] 已知作為由非天然生物降解塑料的細(xì)菌衍生得到的酶的實(shí)例為能夠生物降解酯 基聚亞安酯的那些。這些酶衍生自食酸叢毛單胞菌(Comamonas acidovoran)并切割酯基固 體聚亞安酯的酯鍵，從而產(chǎn)生水溶性單體[Akutsu，Y.，Nakajima-Kambe，T.，Nomura，N.，and Nakahara,T. : Pur ification and properties of a polyester polyurethanebiodegrading enzyme from C.acidovorans TB~35.Appl.Environ.Microbiol.,64,62-67 (1998);以及JP 09-224664 A,題為"Method for polyurethane esterase purification and method for ester-based polyurethane degradation〃（申請人：Suzuki Motor Corporation;Inventors:ToshiakiNakajima等）]〇
[0013] 盡管有許多報告關(guān)于用于這些可生物降解的塑料的生物降解細(xì)菌，但是大部分這 些報告都針對于乳化或粉狀塑料或者微米級薄膜的降解(Kim，D.Y.，and Rhee，Y.H.: Biodegradation ofmicrobial and synthetic polyesters by fungi .Appl .Microbiol .Biotechnol · ,61,300-308(2003)) eUchida等人已經(jīng)分離出德拉菲 爾德食酸菌(Acidovolax delafieldii)菌株BS-3,其同化roSA球作為唯一的碳源[JP 11-225755 A,題為〃Biodegradable polymer-biodegrading enzyme and method for its preparation〃（申請人：Mitsubishi Chemical Corporation;發(fā)明人：Toshiaki Nakajima 等）；N.，Tokiwa，Y.，and Nakahara，T·:Properties of a bacterium which degrades solid poly(tetramethylene succinate)-co_adipate，a biodegradable plastic.FEMS Microbiology Letters ,189,25-29,（2000)]，但是沒有其他的報告關(guān)于能夠生物降解固體 球的細(xì)菌。
[0014] 鑒于之前所述，存在有限數(shù)量的、關(guān)于生物降解薄膜或球形式的塑料的微生物有 機(jī)體的報告，并且進(jìn)一步地，它們的酶也很少知道。為了建立酶的再循環(huán)，強(qiáng)烈需要能夠快 速生物降解固體塑料的酶。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含:聚乙烯和漆酶，其中所述 的漆酶在60°C至100°C的溫度下具有最佳的比活。在另一個實(shí)施方案中，所述的漆酶包含氨 基酸序列SEQ ID N0:1。在另一個實(shí)施方案中，所述的漆酶包含氨基酸序列SEQ ID N0:3。在 另一個實(shí)施方案中，所述的漆酶為波茨坦短芽孢桿菌(B.borstelensis)漆酶。在另一個實(shí) 施方案中，所述的漆酶為土壤短芽孢桿菌(B.agri)漆酶。
[0017] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于分解/生物降解聚乙烯的方法，其 包括將聚乙烯與在60°C至100°C的溫度下具有最佳比活的漆酶相接觸的步驟。在另一個實(shí) 施方案中，所述的方法包括將反應(yīng)溫度保持在60 °C至100 °C。
[0018] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步通過了用于分解聚乙烯的方法，其包括將聚 乙烯與波茨坦短芽孢桿菌、土壤短芽孢桿菌、或者波茨坦短芽孢桿菌與土壤短芽孢桿菌的 組合相接觸的步驟，其中聚乙烯為所述的細(xì)菌的唯一碳源。在另一個實(shí)施方案中，所述的方 法進(jìn)一步包括將聚乙烯和短芽孢桿菌細(xì)菌保持在35°C至50°C的溫度下。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1為示出波茨坦短芽孢桿菌和土壤短芽孢桿菌的最佳溫度生長條件的圖。
[0021 ]圖2為示出波茨坦短芽孢桿菌和土壤短芽孢桿菌的最佳pH生長條件的圖。
[0022] 圖3為示出由波茨坦短芽孢桿菌分離得到的漆酶的活性以及由土壤短芽孢桿菌分 離得到的漆酶的活性的最佳溫度條件的圖。
[0023] 圖4為示出銅濃度對波茨坦短芽孢桿菌中漆酶比活的影響的柱狀圖。
[0024] 圖5為示出銅濃度對波茨坦短芽孢桿菌中漆酶濃度的影響的柱狀圖。
[0025]圖6為示出銅濃度對土壤短芽孢桿菌中漆酶比活的影響的柱狀圖。
[0026]圖7為示出銅濃度為土壤短芽孢桿菌中漆酶濃度的影響的柱狀圖。
[0027]圖8為示出土壤短芽孢桿菌比波茨坦短芽孢桿菌具有更好的聚乙烯生物降解能力 的柱狀圖。
[0028]圖9為示出漆酶生物降解的聚乙烯(A)和對照(B)的SEM顯微照片(X 10,000)。
[0029] 圖10為示出在溫育7天后，木聚糖和/或銅對赤紅球菌(Rhodococcus ruber)細(xì)菌 漆酶的聚乙烯消化效率的影響的柱狀圖。對照包含銅、木聚糖和聚乙烯，但不具有漆酶或包 含漆酶的細(xì)菌。
[0030] 圖11為土壤短芽孢桿菌的16SrRna序列。
[0031]圖12為以赤紅球菌作為外來菌株，基于它們的16SrRNA序列的2種菌株的系統(tǒng)進(jìn)化 樹。
[0032]圖13為土壤短芽孢桿菌在40°C下的細(xì)菌生長曲線。
[0033] 圖14為在00:00小時時分泌至細(xì)菌細(xì)胞外介質(zhì)中的漆酶。
[0034] 圖15為在19:40小時時分泌至細(xì)菌細(xì)胞外介質(zhì)中的漆酶。
[0035] 圖16為在不同測量時間時分泌的漆酶的活性。
[0036] 圖17為在不同溫度下的漆酶的相對活性。所有試驗(yàn)均是在相同的酶濃度下實(shí)施 的。
[0037]圖18為在不同溫度下在30和90分鐘后的漆酶的活性。
[0038] 圖19為ABTS對漆酶誘導(dǎo)的影響。
[0039] 圖20為ABTS對漆酶比活的影響。
[0040] 圖21為木聚糖對(A)漆酶誘導(dǎo)和(B)漆酶比活的影響。
[0041] 圖22為木聚糖和銅對(A)漆酶誘導(dǎo)和(B)漆酶比活的協(xié)同影響，其中木聚糖的濃度 為100yg/mL。
[0042]圖23為鈷對對(A)漆酶誘導(dǎo)和(B)漆酶比活的影響。
[0043]圖24為鎳對(A)漆酶誘導(dǎo)和(B)漆酶比活的影響。
[0044]圖25為不同添加劑對漆酶活性的影響之間的比較。
[0045]圖26為在不同添加劑存在下在30天生物降解試驗(yàn)后PE樣品的FTIR分析。（A)FTIR 光譜，（B)用于各處理的羰基指數(shù)。
[0046]圖27為在不同添加劑存在下在30天生物降解試驗(yàn)后PE樣品的DSC分析。（A)DSC曲 線，（B)由DSC分析得到的參數(shù)。
[0047]圖28為在與漆酶預(yù)溫育7天后實(shí)施的，在不同添加劑存在下在30天生物