癥的方法。
[0009] 制備用作有助于減少肝細(xì)胞癌(HCC)的生長(zhǎng)的食物補(bǔ)劑和治療劑的益生菌制劑是 合乎需要的。為該目的，所公開(kāi)的益生菌制劑可用作食物補(bǔ)劑和治療劑，且另外地特別用于 減少HCC生長(zhǎng)。
[0010] 本發(fā)明的方面提供包含有效量的細(xì)菌的組合的益生菌組合物，其中細(xì)菌的組合包 含（a)熱滅活的嗜酸乳桿菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，（b)活的大腸桿菌 (Escherichia coli)Nissle 1917,和(c)熱滅活的VSL#3?。與對(duì)照生長(zhǎng)比較，細(xì)菌的組合 可有效減少肝細(xì)胞癌(HCC)生長(zhǎng)。細(xì)菌(a )、（ b)和(c)可各自獨(dú)立地以約20-55%重量的濃度 存在于益生菌組合物中。
[0011] VSL#3?包含短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve)、長(zhǎng)雙歧桿菌 (Bifidobacterium Iongum)、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis)、嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)、類干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)、保加利亞乳桿菌(LactobaciIlus bulgaricus)和嗜熱鏈球 菌（Streptococcus thermophiles)〇
[0012] 在至少一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含有效量的細(xì)菌組合的益生菌組合物，其 中細(xì)菌的組合包含(a)熱滅活的嗜酸乳桿菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，（b) 活的大腸桿菌Nissle 1917,和(c)熱滅活的選自以下的細(xì)菌:短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰 兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、類干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及其組 合。
[0013] 本發(fā)明的方面也提供治療肝細(xì)胞癌(HCC)的方法。所述方法包含口服給予面臨HCC 的風(fēng)險(xiǎn)或經(jīng)診斷患有HCC的受試者益生菌組合物。益生菌組合物可以任何有效的方案給予。 例如，且不意味著限制，益生菌組合物可每日給予。益生菌組合物可每日給予，持續(xù)至少一 個(gè)月。受試者可被診斷患有HCC。受試者可面臨HCC的風(fēng)險(xiǎn)中。受試者可以是被診斷有乙型肝 炎病毒、丙型肝炎病毒或二者的受試者。受試者可以是暴露于黃曲霉毒素BI (AFBl)的受試 者。受試者可以是經(jīng)診斷患有酒精中毒的受試者。
[0014] 所述方法可進(jìn)一步包括在給予益生菌組合物之前，診斷受試者患有HCC。所述方法 可進(jìn)一步包括在給予益生菌組合物之前，診斷受試者面臨HCC的風(fēng)險(xiǎn)。診斷受試者面臨HCC 的風(fēng)險(xiǎn)可包括診斷受試者有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或二者。診斷受試者面臨HCC的風(fēng) 險(xiǎn)可包括診斷受試者已暴露于黃曲霉毒素BI (AFBl)。診斷受試者面臨HCC的風(fēng)險(xiǎn)可包括診 斷受試者患有酒精中毒。
[0015] 還公開(kāi)了包括診斷受試者患有HCC或面臨HCC的風(fēng)險(xiǎn)中和口服給予診斷為患有HCC 或面臨HCC的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者益生菌組合物的方法。
[0016] 益生菌組合物可以是任何公開(kāi)的益生菌組合物。例如，且不意味著限制，益生菌組 合物可包含有效量的細(xì)菌的組合，其中細(xì)菌的組合包含(a)熱滅活的嗜酸乳桿菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，（b)活的大腸桿菌Nissle 1917,和（c)熱滅活的選自以下 的細(xì)菌:短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、類干酪乳桿菌、 保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及其組合。與對(duì)照生長(zhǎng)比較，細(xì)菌的組合可有效減少肝細(xì)胞癌 (HCC)生長(zhǎng)。細(xì)菌(a)、（b)和(c)可各自獨(dú)立地以約20-55%重量的濃度存在于益生菌組合物 中。
[0017] 在至少一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療受試者的方法，其包括口服給予面 臨肝細(xì)胞癌(HCC)的風(fēng)險(xiǎn)或經(jīng)診斷患有肝細(xì)胞癌(HCC)的受試者益生菌組合物，益生菌組合 物包含有效量的細(xì)菌的組合，其中細(xì)菌的組合包含（a)熱滅活的嗜酸乳桿菌（Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，（b)活的大腸桿菌Nissle 1917,和（c)熱滅活的選自以下 的細(xì)菌:短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、類干酪乳桿菌、 保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及其組合。
[0018] 在至少一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供依據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物在制備用于治療 或預(yù)防受試者的肝細(xì)胞癌(HCC)的食物補(bǔ)劑或治療劑中的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供依據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物在制備用于治療面臨肝細(xì)胞癌(HCC)的風(fēng)險(xiǎn)或經(jīng)診斷患 有肝細(xì)胞癌(HCC)的受試者的食物補(bǔ)劑或治療劑中的用途。益生菌組合物包含有效量的細(xì) 菌的組合，其中細(xì)菌的組合包含(a)熱滅活的嗜酸乳桿菌(Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，（b)活的大腸桿菌Nissle 1917,和(c)熱滅活的選自以下的細(xì)菌:短雙歧桿菌、長(zhǎng) 雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、類干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱 鏈球菌及其組合。
[0019] 在至少一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防受試者的肝細(xì)胞癌(HCC)的 依據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防面臨肝細(xì) 胞癌(HCC)的風(fēng)險(xiǎn)或經(jīng)診斷患有肝細(xì)胞癌(HCC)的受試者的依據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物。益 生菌組合物包含有效量的細(xì)菌的組合，其中細(xì)菌的組合包含（a)熱滅活的嗜酸乳桿菌 (Moro) Hansen和Mocqu (ATCC 53103)，（b)活的大腸桿菌Nissle 1917,和（c)熱滅活的 選自以下的細(xì)菌:短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、類干 酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及其組合。
[0020] 所公開(kāi)的方法和組合物的另外優(yōu)點(diǎn)將部分地在以下說(shuō)明書(shū)中提出，并將部分地從 說(shuō)明書(shū)中得到了解，或可通過(guò)實(shí)施所公開(kāi)的方法和組合物而得知。所公開(kāi)的方法和組合物 的優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)所附權(quán)利要求書(shū)特別指出的要素和組合認(rèn)知和獲得。要理解，前述的一般描 述和以下的詳細(xì)說(shuō)明二者都只是示例性的和說(shuō)明性的且并不限制如所要求的發(fā)明。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述 附圖，其結(jié)合到本申請(qǐng)中并構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，圖示說(shuō)明所公開(kāi)的方法和組合物 的幾個(gè)實(shí)施方案并與說(shuō)明書(shū)一起，用于解釋所公開(kāi)的方法和組合物的原理。
[0022]圖1是在不同的治療后腫瘤重量與體重的比率的圖。該圖顯示在預(yù)防模型中食用 作為食物補(bǔ)劑的益生菌后的腫瘤負(fù)荷較小。雄性5-6周齡C57BL6/N小鼠在皮下注射小鼠肝 癌細(xì)胞系Hepal-6前1周開(kāi)始每日喂給益生菌。在腫瘤注射后38天處死動(dòng)物，以測(cè)定腫瘤:體 重比率。如通過(guò)Tukey多重比較檢驗(yàn)所測(cè)定的，益生菌群的腫瘤負(fù)荷顯著小于對(duì)照，但在熱 滅活的和活的細(xì)菌之間無(wú)差異。*P〈〇.〇5. **p〈0.01. ***p〈0.001. C:陰性對(duì)照;cis:順鉑 (每3天0.25mg/ml) ;vd:熱滅活的VSL#3 ? (1010cfu/d); Id:熱滅活的LGG (108cfu/d) ;eh: 活的高劑量的EcN (108cfu/d)。
[0023]圖2顯示在預(yù)防模型中食用作為食物補(bǔ)劑的益生菌后在腫瘤組織中的A) T輔助細(xì) 胞亞群標(biāo)記和B)血管生成標(biāo)記的相對(duì)mRNA表達(dá)的圖。益生菌組中的表達(dá)水平經(jīng)Dunnett檢 驗(yàn)與對(duì)照比較。血管生成標(biāo)記的表達(dá)減少通?？膳cTreg標(biāo)記(TGFB-I)和Thl7標(biāo)記(RORyt) 表達(dá)的減少一起被觀察到，但不與Thl標(biāo)記（IFNG、TBET)的表達(dá)一起被觀察到。*p〈0.05，**p 〈0 · 01，##p〈0 ·0001 κ:對(duì)照；cis:順鉑;vd:熱滅活的VSL#3 ? ; Id:熱滅活的LGG (108cfu/ d);eh:活的高劑量EcN (108cfu/d)。
[0024]圖3顯示用IxlO7 Hepal-6腫瘤細(xì)胞皮下接種并從腫瘤接種前1-周（p: ProHep預(yù) 防）或者在腫瘤接種的同一天(Pt: ProHep治療)開(kāi)始用ProHep食物每日飼喂的小鼠的A)腫 瘤大小和B)腫瘤重量的圖。順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照每3天i.p.給予。
[0025]圖4顯示A)用T0-PR0-3對(duì)死亡細(xì)胞染色的整個(gè)腫瘤切片的共焦圖像。比例尺，200 顯示對(duì)代表B) Ki67、（C)胱天蛋白酶3和(D) GLUT-I (藍(lán))和CD31 (紅）的腫瘤切片的 免疫染色。比例尺，50 μπι。
[0026]圖5顯示Α)代表性腫瘤切片的微血管密度。比例尺，50 μπ^Β)顯示在多個(gè)共焦平 面(切片厚度，25μπι)疊加后，由共焦Z堆棧(stack)獲得的三維模型的圖像。
[0027]圖6顯示A)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR)在全部腫瘤溶胞產(chǎn)物中的基因表達(dá)。 Hprt被用作參考基因。B)顯示由分層基因聚類分析的差異基因表達(dá)的相關(guān)性。
[0028]圖7顯示A) IL-17在代表性腫瘤切片中的免疫染色。B)顯示在用腫瘤接種和用 抗-IL-17抗體(200 yg/天)或?qū)φ沾笫驣gG注射的C57BL/6N小鼠中隨時(shí)間推移的腫瘤大小。 監(jiān)測(cè)腫瘤大小1個(gè)月。小鼠喂給對(duì)照或者從腫瘤接種前1周開(kāi)始喂給ProHep食物。C)顯示在 腫瘤中的％ MDSC的流式細(xì)胞術(shù)分析。
[0029] 圖8顯示A)用IL-17染色(藍(lán)）的與⑶3 (左小圖），⑶Ilb (中小圖）和MPO (右小圖） 共染色(紅）的腫瘤切片的共焦圖像。比例尺，50 μπ^Β)顯示％ Th亞群在腫瘤中的流式細(xì)胞 術(shù)分析。C)顯示％ Thl7、MVD和腫瘤大小的相關(guān)性分析。D)顯示Thl7在腫瘤中的表型分析。 E)顯示由流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的Thl7在各種器官中出現(xiàn)的頻率。
[0030] 圖9顯示ProHep食物降低幼稚CD4+ T細(xì)胞分化為T(mén)hl7的能力。幼稚CD4+CD62L+T細(xì) 胞從對(duì)照或ProHep食物喂飼的小鼠腸分離并在抗-CD3和抗-CD28的存在下經(jīng)72小時(shí)分化為 Thl、Th2、Thl7或Treg細(xì)胞。A)顯示Tbet、Gata3、Ror γ t和Foxp3 mRNA表達(dá)的RT-qPCR分析。 表達(dá)相對(duì)于Gapdh表達(dá)呈現(xiàn)。B)顯示在分化3天的⑶4+ T細(xì)胞的上清液中經(jīng)ELISA測(cè)定的細(xì) 胞因子分泌。C)顯示在極化條件下，經(jīng)5天培養(yǎng)評(píng)價(jià)的從幼稚⑶4+ T細(xì)胞衍生的％ Thl(CD4 +IFN-y+)、Th2 (CD4+IL-4+)和Thl7 (CD4+IL-17+)的流式細(xì)胞術(shù)分析。來(lái)自3次獨(dú)立的實(shí) 驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)被示出。
[0031] 本發(fā)明的詳細(xì)公開(kāi) 通過(guò)參照本文包括的特定實(shí)施方案和實(shí)施例的以下詳細(xì)描述和附圖及其先前的和以 下的描述，可以更容易地理解所公開(kāi)的方法和組合物。
[0032] 已公開(kāi)的材料、組合物和組分可用于所公開(kāi)的方法和組合物，可與所公開(kāi)的方法 和組合物聯(lián)合使用，可用于所公開(kāi)的方法和組合物的產(chǎn)品的制備，或?yàn)樗_(kāi)的方法和組 合物的產(chǎn)品。這些和其它材料在此公開(kāi)，并且要理解，當(dāng)這些材料的組合、子集、相互作用、 組等被公開(kāi)時(shí)，雖然這些化合物的每個(gè)各種單獨(dú)和集體組合和排列的具體提及可能未明確 公開(kāi)，但各自都是在此被特別地構(gòu)思和描述的。例如，如果益生菌組合物被公開(kāi)和討論以及 可對(duì)許多組分(包括益生菌細(xì)菌)進(jìn)行的許多修飾被討論時(shí)，則益生菌細(xì)菌的各個(gè)和每一個(gè) 組合以及排列和可能的修飾被特別地構(gòu)思，除非明確指出相反。因此，如果一類細(xì)菌A、B和C 以及一類食物D、E和F被公開(kāi)且組合組分的實(shí)例A-D被公開(kāi)時(shí)，那么即使各自不被單獨(dú)記載， 各自也都是都是單獨(dú)和集體考慮的。因此，在這種情況下，組