，將洗滌過的卵子轉(zhuǎn)入步驟(I)所得的已平衡的有睪丸支持細(xì)胞單層的培養(yǎng)基；
[0035](5)將20ul步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養(yǎng)液中，精子濃度為
3X 16 個(gè)/ml;
[0036](6)將培養(yǎng)皿放回37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱孵育，保持5_6h ；
[0037](7)將有第二極體和原核的卵從培養(yǎng)基中撿選出來，用培養(yǎng)基洗2次，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0038]實(shí)施例2
[0039]本實(shí)施例為對(duì)照組的【具體實(shí)施方式】，對(duì)照組的處理如下:
[0040](I)在沒有支持細(xì)胞單層的35mm的培養(yǎng)皿中加入含I %FBS、I %PS的a-MEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置于37°C,5%⑶2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)平衡，同時(shí)將HTF精子獲能液也放入37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱過夜平衡；
[0041](2)用勁椎脫臼法將成熟公鼠處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團(tuán)，把精子團(tuán)導(dǎo)入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育Ih;
[0042](3)卵子的收集:
[0043]a、對(duì)成熟母鼠注射5IU的PMSG，48h后注射5IU的hCG，誘發(fā)排卵；
[0044]b、注射hCG 14h后用勁椎脫臼法處死成熟母鼠，立即開腹，取出輸卵管；
[0045]C、把輸卵管放入培養(yǎng)皿中，用解剖針?biāo)洪_膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。
[0046](4)用透明質(zhì)酸酶消化卵子周圍的卵丘細(xì)胞，洗滌3次后，將洗滌過的卵子轉(zhuǎn)入步驟(I)所得的已平衡的沒有睪丸支持細(xì)胞單層的培養(yǎng)基中；
[0047](5)將20ul步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養(yǎng)液中，精子濃度為
3X 16 個(gè)/ml;
[0048](6)將培養(yǎng)皿放回37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱孵育，保持5_6h ；
[0049](7)將有第二極體和原核的卵從培養(yǎng)基中撿選出來，用培養(yǎng)基洗2次，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0050]需要注意的是，本發(fā)明所有步驟中所用到的器械均必須經(jīng)過高溫高壓滅菌消毒(121°C,20-30min)o
[0051]本發(fā)明的技術(shù)方案能有效地提高體外授精的效率，本發(fā)明利用SC作為滋養(yǎng)層，通過改變培養(yǎng)體系的微環(huán)境達(dá)到了提高授精率和發(fā)育率的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明的技術(shù)方案的授精率達(dá)89.2%以上，由于本發(fā)明提高了授精卵的發(fā)育率，因此降低了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的生產(chǎn)成本，提高了精子和卵子的利用價(jià)值。
[0052]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)2天，細(xì)胞單層形成，在進(jìn)行體外受精前12h棄去舊培養(yǎng)基，用I3BS洗I次，加入含I %FBS、I %PS的a-MEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)平衡，同時(shí)將HTF精子獲能液也放入37°C、5 % CO2的培養(yǎng)箱過夜平衡； (2)獲取精子后，將精子導(dǎo)入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育Ih; (3)卵子的收集:收集出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體； (4)用透明質(zhì)酸酶消化卵子周圍的卵丘細(xì)胞，洗滌3次后，將洗滌過的卵子轉(zhuǎn)入已平衡的有睪丸支持細(xì)胞單層的培養(yǎng)基； (5)將20uI步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養(yǎng)液中，精子濃度為2-4X 16 個(gè)/ml; (6)將培養(yǎng)皿放回37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱孵育，保持5-6h; (7)將有第二極體和原核的卵從培養(yǎng)基中撿選出來，用培養(yǎng)基洗2次，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于:所述步驟(2)的具體操作為:將成熟雄性動(dòng)物處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團(tuán)，把精子團(tuán)導(dǎo)入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育Ih。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于:所述成熟雄性動(dòng)物為成熟公鼠。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于:將成熟公鼠處死的方法為用勁椎脫白法將成熟公鼠處死。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于:所述步驟(3)的具體操作為: a、對(duì)成熟雌性動(dòng)物以48h為間隔注射5IU的PMSG和5IU的hCG，誘發(fā)排卵； b、注射hCG14h后用將成熟雌性動(dòng)物處死，立即開腹，取出輸卵管； c、把輸卵管放入培養(yǎng)皿中，用解剖針?biāo)洪_膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于:所述成熟雌性動(dòng)物為成熟母鼠。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于:將成熟母鼠處死的方法為用勁椎脫白法將成熟母鼠處死。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，其特征在于:步驟(5)中，精子濃度為3 X 16個(gè)/ml。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，包括以下步驟：(1)將睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)，制備支持細(xì)胞滋養(yǎng)層；(2)將精子導(dǎo)入盛有已平衡好的HTF獲能液中孵育1h；(3)卵子的收集；(4)將洗滌過的卵子轉(zhuǎn)入已平衡的有睪丸支持細(xì)胞單層的培養(yǎng)基；(5)將20ul孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養(yǎng)液中；(6)將培養(yǎng)皿放回37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育，保持5-6h；(7)將有第二極體和原核的卵從培養(yǎng)基中撿選出來，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是授精率和發(fā)育率高。
【IPC分類】C12N5/073, C12N5/075, C12N5/076
【公開號(hào)】CN105647854
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】董煥聲, 王明明, 潘慶杰
【申請(qǐng)人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年3月5日