一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于體外授精技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]體外授精是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成授精過程的技術(shù)，英文簡稱為工VF。由于它與胚胎移植技術(shù)(ET)密不可分，又簡稱為IVF-ET。在生物學(xué)中，把體外授精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物。人工授精技術(shù)是一項(xiàng)應(yīng)用于哺乳動物的繁育高新技術(shù)。利用人工授精，結(jié)合胚胎移植技術(shù)，可以開發(fā)遺傳特性優(yōu)良的母畜繁殖潛力，較快地?cái)U(kuò)大良種畜群，在自然情況下，牛、馬等母畜通常一年產(chǎn)I胎，一生繁殖后代僅僅16只左右;豬也不過百頭。采用人工授精技術(shù)，結(jié)合胚胎移植技術(shù)則使優(yōu)良母畜免去了冗長的妊娠期，胚胎取出后不久即可再次發(fā)情、配種和授精，從而能在一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較多的后代。目前在許多畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家人工授精和胚胎移植均已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化發(fā)展階段。在我國，這一技術(shù)起步較晚，我國從七十年代開始對胚胎生物工程技術(shù)進(jìn)行研究，八十年代后發(fā)展迅速。先后采用胚胎人工授精技術(shù)成功對奶牛、波爾山羊進(jìn)行擴(kuò)繁。
[0003]已有的研究報(bào)道中，體外授精技術(shù)的改善主要集中在精子獲能液和授精液的配方上，還沒有對于整個(gè)體系的改善的相關(guān)報(bào)道，而且現(xiàn)有技術(shù)的體外授精授精率率較低。因此開發(fā)出一種能改善體外授精的體系，以提高精子活力，增加體外授精的效率具有重要的生產(chǎn)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決上述技術(shù)問題，提供一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，包括以下步驟:
[0006](I)將睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)2天，細(xì)胞單層形成，在進(jìn)行體外授精前12h棄去舊培養(yǎng)基，用PBS洗I次，加入含1%FBS、1%PS的a-MEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)平衡，同時(shí)將HTF精子獲能液也放入37 °C、5 % CO2的培養(yǎng)箱過夜平衡；
[0007](2)獲取精子后，將精子導(dǎo)入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育Ih;
[0008](3)卵子的收集:收集出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體；
[0009](4)用透明質(zhì)酸酶消化卵子周圍的卵丘細(xì)胞，洗滌3次后，將洗滌過的卵子轉(zhuǎn)入已平衡的有睪丸支持細(xì)胞單層的培養(yǎng)基；
[0010](5)將20ul步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養(yǎng)液中，精子濃度為2-4 X 16 個(gè)/ml;
[0011](6)將培養(yǎng)皿放回37°C、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，保持5-6h；
[0012](7)將有第二極體和原核的卵從培養(yǎng)基中撿選出來，用培養(yǎng)基洗2次，然后轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0013]優(yōu)選地，所述步驟(2)的具體操作為:將成熟雄性動物處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團(tuán)，把精子團(tuán)導(dǎo)入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育Ih。
[0014]進(jìn)一步地，所述成熟雄性動物可以為成熟公鼠，將成熟公鼠處死的方法為用勁椎脫臼法將成熟公鼠處死。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟(3)的具體操作為:
[0016]a、對成熟雌性動物以48h為間隔注射5IU的PMSG和5IU的hCG，誘發(fā)排卵；
[0017]b JMhCG 14h后用將成熟雌性動物處死，立即開腹，取出輸卵管；
[0018]C、把輸卵管放入培養(yǎng)皿中，用解剖針?biāo)洪_膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。
[0019]進(jìn)一步地，所述成熟雌性動物可以為成熟母鼠，將成熟母鼠處死的方法為用勁椎脫臼法將成熟母鼠處死。
[0020]優(yōu)選地，步驟(5)中，精子濃度為3X 16個(gè)/ml。
[0021]需要注意的是，本發(fā)明所有步驟中所用到的器械均必須經(jīng)過高溫高壓滅菌消毒(121°C,20-30min)o
[0022]現(xiàn)有技術(shù)中，對于體外授精技術(shù)的研究工作一直集中在改變培養(yǎng)液的配方或授精機(jī)制的研究等方面，而從未涉及到體外授精體系的改善，本發(fā)明建立的體外授精技術(shù)改善了體外授精的微環(huán)境，進(jìn)而改善了體外授精的體系，采取以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層建立體夕卜授精體系，增加了精子活力，提高了體外授精的授精率和效率。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的技術(shù)方案能有效地提高體外授精的效率，本發(fā)明利用SC作為滋養(yǎng)層，通過改變培養(yǎng)體系的微環(huán)境達(dá)到了提高授精率和發(fā)育率的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明的技術(shù)方案的授精率達(dá)89.2%以上，由于本發(fā)明提高了授精卵的發(fā)育率，因此降低了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的生產(chǎn)成本，提高了精子和卵子的利用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0025]實(shí)施例1
[0026]本實(shí)施例為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組的處理如下:
[0027]—種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外授精的方法，包括以下步驟:
[0028](I)將睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)2天，細(xì)胞單層形成，在進(jìn)行體外授精前12h棄去舊培養(yǎng)基，用PBS洗I次，加入含1%FBS、1%PS的a-MEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)平衡，同時(shí)將HTF精子獲能液也放入37 °C、5 % CO2的培養(yǎng)箱過夜平衡；
[0029](2)用勁椎脫臼法將成熟公鼠處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團(tuán)，把精子團(tuán)導(dǎo)入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育Ih;
[0030](3)卵子的收集:[0031 ] a、對成熟母鼠注射5IU的PMSG，48h后注射5IU的hCG，誘發(fā)排卵；
[0032]b、注射hCG 14h后用勁椎脫臼法處死成熟母鼠，立即開腹，取出輸卵管；
[0033]C、把輸卵管放入培養(yǎng)皿中，用解剖針?biāo)洪_膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。
[0034](4)用透明質(zhì)酸酶消化卵子周圍的卵丘細(xì)胞，洗滌3次后