一種改善體外受精雌性胚胎附植后發(fā)育質(zhì)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及有性繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種改善體外受精雌性胚胎附植 后發(fā)育質(zhì)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體外受精（in vitro fertilization, IVF;即試管嬰兒）廣泛應(yīng)用于治療人類不 育。目前，全球已有超過540萬例的試管嬰兒出生，并且呈35萬例/年的速度激增。此外，IVF 也廣泛應(yīng)用于家畜的良種擴(kuò)繁，例如牛胚胎移植中IVF胚胎所占比例已達(dá)40%。盡管IVF存 在如此廣闊的應(yīng)用空間，但是IVF仍存在許多制約因素，例如:發(fā)育率低，妊娠丟失，早產(chǎn)，出 生缺陷，性別比例失衡，患糖尿病、高血壓風(fēng)險(xiǎn)增高等。目前，針對(duì)這些IVF缺陷，主要通過改 變體外胚胎操作的物理環(huán)境，受精液、培養(yǎng)液成分，添加小分子物質(zhì)等，該研究進(jìn)展緩慢。
[0003] 近年來，IVF引發(fā)的性別失衡問題得到廣泛關(guān)注。自1991年，Avery B等首次報(bào)道牛 IVF囊胚存在性別比例失衡問題(雄性多，雌性少），之后牛、豬IVF研究多次證實(shí)這一問題。 最近，大洋洲、英國分別展開的數(shù)十萬例人流行病學(xué)調(diào)查顯示人IVF也同樣存在出生性別比 例失衡問題（男多女少）。目前，針對(duì)這一問題，一種改善方式是向培養(yǎng)液中添加小分子物 質(zhì)。例如，在豬IVF胚胎的培養(yǎng)液中替換和添加不同的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)玻尿酸(hyaluronic acid, HA)可顯著提高囊胚率，但會(huì)使性別比例失衡問題更嚴(yán)重（Torner E，Bussalleu E，Briz MD,Yeste M，Bonet S Embryo development and sex ratio of in vitro-produced porcine embryos are affected by the energy substrate and hyaluronic acid added to the culture medium.Reprod Fertil Dev 2014;26:570-577·)。在牛IVF胚胎培 養(yǎng)液中添加6-磷酸葡糖脫氫酶抑制因子DHEA和6-AN，可顯著改善牛IVF囊胚的性別比例，但 是這一添加處理會(huì)降低牛IVF胚胎的發(fā)育效率(Kimura K, Spate LD,Green MP,Roberts RM Effects of D-glucose concentration，D_fructose,and inhibitors of enzymes of the pentose phosphate pathway on the development and sex ratio of bovine blastocysts.Mol Reprod Dev 2005;72:201-207·)。目前，針對(duì)IVF技術(shù)所致性別失衡問題 的所有解決方案都沒達(dá)到預(yù)期效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種改善體外受精雌性胚胎附植后發(fā)育質(zhì)量的方法。
[0005] 本發(fā)明基于前期研究的機(jī)制揭示，在胚胎發(fā)育早期，小鼠、牛等不同物種的胚胎本 身及所處的輸卵管中廣泛表達(dá)視黃酸合成相關(guān)基因（圖l)(Mohan M，Malayer JR，Geisert RD,Morgan GL Expression patterns of retinoid X receptors,retinaldehyde dehydrogenase，and peroxisome proliferator activated receptor gamma in bovine preattachment embryos.Biol Reprod 2002；66:692-700.Everts HB,Sundberg JP,0ng DE Immunolocalization of retinoic acid biosynthesis systems in selected sites in rat.Exp Cell Res 2005;308:309-319·)，表明視黃酸(RA)可能在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮 重要作用。根據(jù)上述研究結(jié)果，本發(fā)明有針對(duì)性地優(yōu)化IVF體系，從根源上補(bǔ)充IVF體系缺乏 的關(guān)鍵分子，而不是盲目的選擇外源活性物質(zhì)進(jìn)行添加處理。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供視黃酸在改善體外受精雌性胚胎附植后發(fā) 育質(zhì)量中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供一種改善體外受精雌性胚胎附植后發(fā)育質(zhì)量的方法，將通過IVF技術(shù) 獲得的受精卵移入添加有1-50ηΜ視黃酸的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚，再移植到母體 子宮內(nèi)，發(fā)育形成胎兒。
[0008] 所述受精卵是通過激素超數(shù)排卵獲取哺乳動(dòng)物ΜΠ 期卵母細(xì)胞，然后進(jìn)行體外受 精獲得的受精卵。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將通過IVF技術(shù)獲得的小鼠受精卵移入添加有1-20ηΜ視黃酸的培養(yǎng)液KS0M+AA中，于37 °C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24-48h， 然后移入不含有視黃酸的培養(yǎng)液KS0M+AA中，于37 °C、5 % C02、飽和濕度的⑶2培養(yǎng)箱中繼續(xù) 培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚(小鼠胚胎從受精到發(fā)育至囊胚的培養(yǎng)時(shí)間總計(jì)88-90h)。
[0010] 優(yōu)選地，將通過IVF技術(shù)獲得的小鼠受精卵移入添加有5nM視黃酸的培養(yǎng)液KS0M+ AA中，于37°C、5%C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)36h，然后移入不含有視黃酸的培養(yǎng) 液KS0M+AA中，于37°C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)52-54h，發(fā)育到囊胚。
[0011 ]其中，所述添加有5nM視黃酸的培養(yǎng)液KS0M+AA的制備方法如下：在避光條件下用 DMS0將視黃酸配制成0.1 mM濃儲(chǔ)，10μ1/管分裝后-20°C保存;視黃酸添加培養(yǎng)液需要現(xiàn)配現(xiàn) 用，使用前，避光條件下，吸取1〇μ1 KS0M+AA液加入濃儲(chǔ)管中，混勻后，得混合液I，吸取10μ1 混合液I加入990μ1 KS0M+AA液中，繼續(xù)混勻，得混合液Π ，再吸取20μ1混合液Π 加入1980μ1 KS0M+AA液中，混勻后，即得添加有5ηΜ視黃酸的培養(yǎng)液KS0M+AA。用于制作培養(yǎng)微滴。上述反 復(fù)稀釋操作，不僅能確保視黃酸添加濃度的精確，而且可減少DMS0在培養(yǎng)液中的殘留。
[0012] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將通過IVF技術(shù)獲得的牛受精卵移入添加有5-50ηΜ視黃酸的前期發(fā)育液中，于39 °C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48h，再移入 添加有5-50nM視黃酸的后期發(fā)育液中，于39°C、5%⑶ 2、飽和濕度的⑶2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng) 24-48h，然后移入不含有視黃酸的后期發(fā)育液中，于39°C、5 %⑶2、飽和濕度的⑶2培養(yǎng)箱中 繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚(牛胚胎從受精到發(fā)育至囊胚的培養(yǎng)時(shí)間總計(jì)7d)。
[0013] 所述前期發(fā)育液為CR1液+6mg/ml BSA;所述后期發(fā)育液為CR1液+10%FBS。
[0014] 優(yōu)選地，將通過IVF技術(shù)獲得的牛受精卵移入添加有20nM視黃酸的前期發(fā)育液中， 于39 °C、5 % C02、飽和濕度的⑶2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48h，再移入添加有20nM視黃酸的后期發(fā) 育液中，于39 °C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)36h，然后移入不含有視黃酸的后 期發(fā)育液中，于39°C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3.5d，發(fā)育到囊胚。
[0015] 本發(fā)明圍繞IVF技術(shù)引發(fā)的性別比例失衡問題，首先利用小鼠為模式動(dòng)物，通過揭 示其發(fā)生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)主要是由于IVF引發(fā)了特異性的表觀修飾錯(cuò)誤，即X染色體失活不足，造 成雌性胚胎傾向性的發(fā)育異常，最終導(dǎo)致了出生性別比例失衡。為此，利用視黃酸這一內(nèi)源 性物質(zhì)，通過一系列的處理濃度、時(shí)間等條件的優(yōu)化，有效地減少了IVF雌性胚胎的發(fā)育異 常比例，最終校正了IVF胎兒出生性別比例失衡的問題。進(jìn)一步，在牛IVF體系進(jìn)行添加處 理，成功改善了牛IVF雌性囊胚的發(fā)育率，并校正了牛IVF囊胚的性別比例。
[0016] 本發(fā)明方法適用于優(yōu)化人及哺乳動(dòng)物(包括小鼠、牛等）的IVF體外培養(yǎng)體系，提高 雌性胎兒的發(fā)育質(zhì)量;增加 IVF獲得雌性后代的幾率，具有廣闊的臨床應(yīng)用及市場前景，產(chǎn) 生可觀的經(jīng)濟(jì)效益和良好的社會(huì)效益。向培養(yǎng)液中添加視黃酸應(yīng)用于人類輔助生殖，可降 低胎兒發(fā)育異常的幾率，使不育家庭直接受益，有效降低出生性別比例失衡的風(fēng)險(xiǎn)，有利于 長期的社會(huì)穩(wěn)定。將該方法應(yīng)用于家畜良種擴(kuò)繁，有效平衡IVF后代的性別比例。
【附圖說明】
[0017] 圖1為小鼠視黃酸合成相關(guān)基因的PCR檢測結(jié)果;其中，小鼠交配見栓后，在不同時(shí) 間點(diǎn)收集受精卵(交配見栓后8-10h)、2-cell (交配見栓后26-28h)、4-cell (交配見栓后40-42h)、8-cell(交配見栓后46-48h)，以及對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的輸卵管，進(jìn)行PCR檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0019] 以下實(shí)施例中培養(yǎng)液KS0M+AA購自美國Millipore公司，視黃酸購自Sigma公司，貨 號(hào)R2500-100MG。
[0020]實(shí)施例1小鼠體外受精胚胎生產(chǎn) [0021] 1、體外受精
[0022] 7~8周齡的ICR雌鼠小鼠腹腔注射5IU PMSG(寧波第二激素廠），47~48h后注射 5IU hCG(寧波第二激素廠）。注射hCG后13h，頸椎脫臼處死小鼠，解剖剪取輸卵管，置于預(yù)熱 37°C的M2操作液(Sigma公司）中，體視顯微鏡下用注射器劃破輸卵管膨大部，收集卵丘卵母 細(xì)胞復(fù)合體(成熟的ΜΠ 期卵母細(xì)胞），移至預(yù)熱37°C的M2操作液中充分洗滌后，待用。將成 年健康的公鼠（10~12周齡)脫頸處死，用滅菌的剪刀剪開腹腔，取附睪尾，用鑷子和剪刀將 附睪尾中的精子擠出，并將其放入預(yù)平衡好的1〇〇μ1 HTF液（SAGE公司）中，置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中孵育lh，完成精