一種新生仔豬睪丸生殖干細(xì)胞的高效獲取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于成體干細(xì)胞研究技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種新生仔豬睪丸 生殖干細(xì)胞的高效獲取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雄性生殖干細(xì)胞(male germline stem cells，mGSCs)是一類存在雄性動物睪丸 中具有維持自我更新保持自身恒定和源源不斷分化精子繁衍后代的干細(xì)胞。新生動物睪丸 組織內(nèi)存在多種類型的細(xì)胞(生殖細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、類肌細(xì)胞、血管和淋巴管上皮 細(xì)胞、血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞），新生動物睪丸組織內(nèi)多種細(xì)胞都呈現(xiàn)未分化的狀態(tài)，相對集中 的呈現(xiàn)出各種具有干性的細(xì)胞，如mGSCs和間質(zhì)干細(xì)胞(stem 1 eydig ce 11 s，SLCs)，這時還 并未出現(xiàn)分化的生殖細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，這個時期對于富集mGSCs優(yōu)于其他時期。
[0003]未成熟的支持細(xì)胞、類肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和血管和淋巴管上皮細(xì)胞等成纖維樣生 長的細(xì)胞，表現(xiàn)出增殖和貼壁能力強，利用體外差速貼壁法可以去除，Percoll密度梯度離 心的方法是有效的將淋巴細(xì)胞、血細(xì)胞和成體細(xì)胞分開的方法，這些分離措施雖然早已應(yīng) 用到mGSCs分離中，但以往利用這些方法獲取mGSCs的純度并不高。
[0004] 對于傳統(tǒng)分離方法，通過免疫學(xué)建立起來的免疫磁珠和流式分離方法，更多的應(yīng) 用到成體干細(xì)胞分離中，但是一個目前主要的瓶頸是成體干細(xì)胞并未發(fā)現(xiàn)一種特異的分子 標(biāo)記，特別是特異的膜表面標(biāo)記，很多早先報道特異膜表面標(biāo)記先后被證實并不呈現(xiàn)一種 特異的狀態(tài)，早先證實GFRA1，THY-1和PGP9.5等一系列膜表面標(biāo)記特異表達(dá)在mGSCs上，但 結(jié)果在使用這些膜表面分子標(biāo)記分選人和家畜的mGSCs，卻發(fā)現(xiàn)結(jié)果中的細(xì)胞存在大量的 間質(zhì)細(xì)胞;證明了這些標(biāo)記可能也表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞上。目前，利用免疫學(xué)分離方法還并不能 有效的實現(xiàn)大動物和人的生殖干細(xì)胞的純化。
[0005] 雖然mGSCs研究已開展多年，但是人和家畜mGSCs體外體系仍然未建立成功，目前 僅存在嚙齒動物的mGSCs系，這和細(xì)胞純度和生物性質(zhì)等有直接關(guān)系。其中細(xì)胞純度對于培 養(yǎng)和后期細(xì)胞生物學(xué)研究至關(guān)重要。成體干細(xì)胞數(shù)量少，分布廣，分離難，是制約研究和應(yīng) 用的主要問題。而人和家畜的mGSCs體系未建立成功，這和不完善的分離方法存在直接關(guān) 系。細(xì)胞系是研究細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)和藥物篩選的重要材料，獲得高純度單一種類細(xì)胞是建 立細(xì)胞系的首要基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新生仔豬睪丸生殖干 細(xì)胞的高效獲取方法，該方法簡化了操作步驟，優(yōu)化了純化效率，提高了重復(fù)性，提高了分 離細(xì)胞的純度。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0008] (1)、通過胰蛋白酶和膠原蛋白的兩步酶消化法獲得新生仔豬的睪丸組織單細(xì)胞 懸液；
[0009] (2)、利用差速貼壁法將睪丸組織中貼壁能力強的成纖維類的細(xì)胞貼壁而被去除；
[0010] (3)、差速貼壁5次以后，基本都是不貼壁的細(xì)胞時，收集這些未貼壁細(xì)胞，所述未 貼壁細(xì)胞中含有淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞和生殖干細(xì)胞；
[0011] (4)、利用Percoll密度梯度離心方法將密度不同的淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞與生殖干細(xì) 胞分離，即得純的生殖干細(xì)胞。
[0012]在其中一些實施例中，步驟（1)中所述胰蛋白酶的濃度為〇. 25wt%，所述膠原蛋白 酶的濃度lmg/mL。
[0013] 在其中一些實施例中，步驟(2)中所述差速貼壁法中所用的多聚賴氨酸的濃度為 0.1mg/ml，可以高效短時間的去除貼壁能力強的睪丸成纖維細(xì)胞。
[0014] 在其中一些實施例中，步驟(3)中所述差速貼壁的次數(shù)為5次，基本上去除掉了成 纖維類的貼壁細(xì)胞。
[0015] 在其中一些實施例中，步驟(4)中所述密度梯度離心方法為:配置20 %和40%兩個 梯度的Percoll離心液，底層加入40 %Percoll液，上層加入20 %的Percoll液，離心后， mGSCs處于40%Perc〇ll液頂部，也就是20%的Percoll液底部，而紅細(xì)胞離心后處于離心管 底部，淋巴和細(xì)胞碎片在20%P erc〇ll液面頂部，達(dá)到分離的目的。
[0016] 在其中一些實施例中，步驟（1)中所述睪丸組織為去掉了脂肪墊白膜和結(jié)締組織 的睪丸組織。
[0017] 在其中一些實施例中，所述新生仔豬為1~5天的新生仔豬。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0019] 1、本發(fā)明結(jié)合傳統(tǒng)的差速貼壁法和密度梯度離心方法，摸索了不同時間點、處理 方法和濃度，通過大量試驗和優(yōu)化，將含有多種類型細(xì)胞的新生仔豬睪丸組織中的mGSCs分 離出來，在原有的分離方法基礎(chǔ)上，優(yōu)化建立起一套有效的新生仔豬mGSCs的分離純化方 法，操作簡單，重復(fù)性好，成功率高，對比以往的分離方法具有明顯優(yōu)勢，這種方法獲取的 mGSCs展現(xiàn)出形態(tài)均一，折光性好，流式檢測結(jié)果顯示純度達(dá)到85%以上，達(dá)到了細(xì)胞培養(yǎng) 的要求，高效的獲取高比例的mGSCs，對于后期研究mGSCs性質(zhì)及其應(yīng)用具有重要作用。
[0020] 2、本發(fā)明的新生仔豬睪丸生殖干細(xì)胞的高效獲取方法不僅可應(yīng)用于豬雄性生殖 干細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)研究的科研平臺、也可以在豬雄性生殖干細(xì)胞介導(dǎo)的動物育種、品種改 良和瀕危品種保存等方面具有潛在的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明實施例1的新生仔豬睪丸生殖干細(xì)胞的高效獲取方法的路線圖；
[0022] 圖2是本發(fā)明實施例1的新生仔豬睪丸生殖干細(xì)胞的高效獲取方法的模式圖；
[0023]圖3是本發(fā)明實施例1中差速貼壁法獲取高純度mGSCs過程中的細(xì)胞狀態(tài)圖，其中， A:單細(xì)胞懸液;B:貼壁的成纖維樣細(xì)胞;C:未貼壁的細(xì)胞;D:淋巴細(xì)胞和細(xì)胞碎片;E:紅細(xì) 胞;F:純化的生殖干細(xì)胞;G:堿性磷酸酶染色；
[0024] 圖4為本發(fā)明實施例2中流式細(xì)胞術(shù)分析新分離mGSCs的純度的分析結(jié)果；
[0025] 圖5為本發(fā)明實施例3中對生殖干細(xì)胞的組織化學(xué)染色與免疫熒光檢測結(jié)果圖；其 中，A:純化后豬mGSCs免疫熒光染色;B:原位組織化學(xué)染色；
[0026] 圖6為本發(fā)明實施例4中對生殖干細(xì)胞的生殖標(biāo)記檢測和分析結(jié)果，其中，A:RT_ PCR檢測;B:蛋白檢測。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和具體實施例來對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0028]以下實施例中，0CT4(鼠源）、PGP9.5(兔源）和C-KIT(大鼠源）單克隆抗體購于 Mi 11 ipore公司；CD29 (鼠源）購于BD公司；GFRA1 (鼠源）、PLZF(鼠源）、LIN28 (兔源）和CD9〇 (鼠源）單克隆抗體購于Santa Cruz公司；NAN0G(兔源）單克隆抗體購于（cell signaling technology，CST)公司；（Alexa Fluor 568)焚光標(biāo)記羊抗鼠二抗，（Alexa Fluor 568)焚光 標(biāo)記羊抗兔二抗，（FITC)焚光標(biāo)記羊抗鼠二抗購于Invitrogen公司；Hoechst 33342購于 Molecular Probes公司。其他原料均來源于市售。
[0029] 實施例1 一種新生仔豬睪丸生殖干細(xì)胞的高效獲取方法
[0030] 請參閱圖1和