30°C，開攪拌，轉(zhuǎn) 速為160r/min，其后，每2小時將溫度提高TC，培養(yǎng)26-32小時，檢測其芽孢含量超過100億 CFU/ml，即可結(jié)束發(fā)酵，作為萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液； 其中，所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨IOg，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水1000 mL，pH7.2，固體培 養(yǎng)基中加入瓊脂2%;其中，所述萎縮芽孢桿菌液體培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，牛肉膏10 g/L，蛋 白胨5 g/L，魚粉5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀 0.5 g/L，氯化鈣0.5 g/L，pH7.2; 其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L玉米粉10 g/L，玉米漿30 g/L，蛋白胨10 g/L， 硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，氯化鈣0.5 g/ U碳酸鈣5g/L，pH7.2;各培養(yǎng)基滅菌的條件為:0.10-0.15MPa，121°C滅菌30分鐘； 二、 將萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液40-70份;填料:高嶺土20-30份;紫外保護劑:海藻糖1-2份， 羧甲基纖維素0.2-1份;干燥保護劑:鹿糖1-5份，谷氨酸鈉0.2-1份;混勻后噴霧干燥，得到 萎縮芽孢桿菌粉劑； 三、 將潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉1-4份;分散劑= Morwet D-425 0.2-1份;芽孢萌發(fā) 劑:果糖〇. 1-1份，蘇氨酸〇. 1-1份，2，6-吡啶二羧酸鈣0.1-0.5份;混勻得到萎縮芽孢桿菌的 助劑； 四、 將步驟二與步驟三所得到的萎縮芽孢桿菌粉劑與助劑混勻并過通過氣流粉碎機粉 碎過400目篩，檢測其芽孢含量不低于100億cfu/g，懸浮率不低于82%，潤濕時間不高于75s， 水分含量低于5%，真空包裝，即為萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑。
[0015] 其中，所述萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑最佳重量份組成為:萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液60 份;填料:高嶺土28份;潤濕劑:十二烷基苯磺酸鈉3份;分散劑= Morwet D-425 1份;芽孢萌 發(fā)劑:果糖0.8份，蘇氨酸0.4份，2,6_吡啶二羧酸鈣0.5份;紫外保護劑:海藻糖1.8份，羧甲 基纖維素0.8份;干燥保護劑:蔗糖4份，谷氨酸鈉0.8份。
[0016] 自然界中芽孢萌發(fā)受外源營養(yǎng)物質(zhì)的影響，這類營養(yǎng)物質(zhì)被稱之為"萌發(fā)劑"，通 常情況下，芽孢和促進萌發(fā)的芽孢萌發(fā)劑混合后數(shù)秒鐘之內(nèi)，萌發(fā)劑快速跨過芽孢衣和皮 層到達芽孢內(nèi)膜的表面，與位于芽孢內(nèi)膜上的受體蛋白相互作用，激發(fā)芽孢進入萌發(fā)狀態(tài)， 接著啟動一連串萌發(fā)事件，之后的萌發(fā)過程不會因移走萌發(fā)劑而停止。本發(fā)明可濕性粉劑 中含有芽孢萌發(fā)劑：果糖，蘇氨酸，2，6-吡啶二羧酸鈣;是從苷氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨 酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，蛋氨酸，胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，賴 氨酸，精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，組氨酸，脯氨酸，肌苷，2,6吡啶二羧鈣中進行單因 素試驗，及組合性試驗得到的具有明顯誘導萎縮芽孢萌發(fā)的萌發(fā)劑。經(jīng)過試驗，本發(fā)明的萎 縮芽孢桿菌可濕性粉劑與水按1:1000的比例進行潤濕混合均勻，此時的芽孢萌發(fā)劑能充分 與芽孢接觸后，從而促使其快萌發(fā)，經(jīng)過試驗，30分鐘后，芽孢萌發(fā)率已經(jīng)達到80%以上，而 未加芽孢萌發(fā)劑的萎縮芽孢在4小時后，其芽孢萌發(fā)率只達到了45%左右。
[0017] 本發(fā)明人通過對載體(如膨潤土，滑石粉，高嶺土，硅藻土，白炭黑，磷礦粉，輕質(zhì)碳 酸鈣）、助劑(潤濕劑和分散劑）（聚乙烯醇，聚乙二醇，CMC-Na，吐溫-60，十二烷基苯磺酸鈉， T型木質(zhì)素，十二烷基硫酸鈉，茶皂素 ，Morwet EFW，Morwet D425，My100 ，D110，阿拉伯權(quán)膠， 2_萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽，辛基酚聚氧乙烯醚，二異辛基琥珀酸酯磺酸鈉，甲基纖維素，木 質(zhì)素磺酸鈉)填料(硅藻土，高嶺土，膨潤土，白炭黑，輕質(zhì)碳酸鈣，滑石粉）、紫外線保護劑 (抗壞血酸，糊精，十二烷基苯磺酸鈉，剛果紅，羧甲基纖維素，卵磷脂），干燥保護劑(脫脂奶 粉，蔗糖，谷氨酸鈉，麥芽糖，甘露糖，甲基纖維素等)進行篩選，其每種助劑對萎縮芽孢桿菌 的芽孢存活，懸浮性，濕潤性進行試驗，最后通過多輪單因素與正交試驗確定萎縮芽孢桿菌 可濕性粉劑的配方。通過驗證，本發(fā)明的萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑在20-25Γ下保存一年， 其芽孢存活率還可達到92億CFU/克。
[0018] 本發(fā)明的可濕性粉劑采有真空包裝，減少芽孢與空氣的接觸，降低了其萌發(fā)的機 率。
[0019] 本發(fā)明的可濕性粉劑的水分含量低于5%，低水份含量的可濕性粉劑中即使含有芽 孢萌發(fā)劑(果糖，蘇氨酸，2,6_吡啶二羧酸鈣），對其貯存過程中的芽孢活性也沒有明顯的影 響，沒有減少其在貯存過程中的芽孢。
[0020] 本發(fā)明中的可濕性粉中含有蘇氨酸等單分子氨基酸，不僅在使用初期作為萌發(fā) 劑，而施入大田后則作為氨基酸肥可起到肥效的作用。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果： 這是國內(nèi)首次將萎縮芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)劑加入萎縮芽孢桿菌可濕劑進行工業(yè)化生 產(chǎn)，大大提升了芽孢萌發(fā)速率與萌發(fā)率，解決了因為芽孢萌發(fā)慢，萌發(fā)率低而導致的防治效 果差，效果不穩(wěn)定的問題； 首次利用萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液直接與載體，填料等相關(guān)可濕性粉劑原料進行制備可濕 性粉劑，減少了工藝流程，減少了萎縮芽孢桿菌在制備可濕性粉劑過程中芽孢的損失率； 提供了一種芽孢含量不低于100億cfu/g，懸浮率不低于82%，潤濕時間不高于75s，水分 含量低于5%，真空包裝的萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明實質(zhì)性特點可從下述實施例中得以體現(xiàn)，但這些實施例僅作為說明，而不 是對本發(fā)明進行限制。
[0023] 實施例1 一種萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑由下列重量份組成:萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液60份;填料:高 嶺土28份;潤濕劑:十二烷基苯磺酸鈉3份;分散劑=Morwet D-425 1份;芽孢萌發(fā)劑:果糖 〇. 8份，蘇氨酸0.4份，2，6-吡啶二羧酸鈣0.5份；紫外保護劑:海藻糖1.8份，羧甲基纖維素 〇. 8份;干燥保護劑:蔗糖4份，谷氨酸鈉0.8份。
[0024] -種萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法，由以下幾步驟組成： 一、萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液的制備 取出菌種保藏管(萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeus CICC 23590,購置于中國工業(yè) 微生物菌種保藏管理中心，能防治枯萎病），用營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基劃平板進行復蘇，30°C 培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至50毫升營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中30°C震 蕩培養(yǎng)24小時。種子采用5%的接種量，接種至5L大三角瓶中的萎縮芽孢桿菌液體培養(yǎng)基，裝 液量為2L，30°C震蕩培養(yǎng)16-28小時，檢測其菌液濃度，菌液含量超過30億/毫升，即可作為 萎縮芽孢桿菌種子液;將萎縮芽孢桿菌種子液接種至1000L的發(fā)酵罐中，裝液量為600L的發(fā) 酵培養(yǎng)基，通氣量為前16小時為每分鐘液氣比為1:0.8，其后通氣量為1:1;培養(yǎng)溫度前24小 時為30°C，開攪拌，轉(zhuǎn)速為160r/min，其后，每2小時將溫度提高TC，培養(yǎng)30小時，檢測其芽 孢含量為112億CFU/ml，即可結(jié)束發(fā)酵，作為萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液； 其中，所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨IOg，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水1000 mL，pH7.2，固體培 養(yǎng)基中加入瓊脂2%;其中，所述萎縮芽孢桿菌液體培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，牛肉膏10 g/L，蛋 白胨5 g/L，魚粉5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀 0.5 g/L，氯化鈣0.5 g/L，pH7.2; 其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L玉米粉10 g/L，玉米漿30 g/L，蛋白胨10 g/L， 硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L