一種萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有萎縮芽孢萌發(fā)劑的萎縮芽孢 桿菌可濕性粉劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus、，非致病菌，枯草芽孢桿菌的一類(lèi)變種，在 含有碳水化合物的培養(yǎng)基上可形成可溶的黑色菌落，主要從土壤中分離得到。在農(nóng)業(yè)、工 業(yè)、科研、醫(yī)療和衛(wèi)生等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。萎縮芽孢桿菌能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，不產(chǎn)生接 觸酶，VP反應(yīng)陽(yáng)性，不產(chǎn)生硫化氫、吲哚以及二羥丙酮，能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，能水解 淀粉和酪素。萎縮芽孢桿菌最適生長(zhǎng)溫度范圍：28~30°C ;最大生長(zhǎng)溫度范圍：50~55°C ;最小 生長(zhǎng)溫度范圍：5~10°C。萎縮芽孢桿菌能在PH為4-9以及在7%NaCl中生長(zhǎng)。萎縮芽孢桿菌能 利用L-阿拉伯糖、D-果糖、D-葡萄糖、甘露醇、水楊苷、蔗糖、海藻糖和木糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能 利用蜜二糖和乳糖發(fā)酵。羅華東等人篩選出對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)具強(qiáng)致病性的細(xì)菌生防菌株萎縮 芽孢桿菌CPB072、CPB108,能降解幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)，能利用蔗糖、甘露醇發(fā)酵，不能進(jìn)行D-葡 萄糖發(fā)酵，CPB072能將硝酸鹽還原成亞銷(xiāo)酸鹽，但是CPB108不能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。
[0003] 1872年，由德國(guó)科學(xué)家Cohn建立的第一個(gè)細(xì)菌分類(lèi)系統(tǒng)中，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征建 立了芽孢桿菌屬(BaciUus)。芽孢桿菌屬細(xì)菌是一類(lèi)能產(chǎn)球形或橢圓形芽孢的革蘭氏陽(yáng)性 菌，對(duì)干旱、紫外線、低溫、高溫等不良因子抗性強(qiáng)，分布廣，存在于水、土壤、空氣、植物以及 動(dòng)物腸道中。同樣，萎縮芽孢桿菌在環(huán)境中分布較廣。韓松等人在鈴鐺刺花部器官中分離出 一株內(nèi)生細(xì)菌HS-4，該菌最終確定為萎縮芽孢桿菌。薛鵬輯從平均海拔4000米以上的青藏 高原土樣中分離到萎縮芽孢桿菌。Fall等人發(fā)現(xiàn)在植物根系中存在萎縮芽孢桿菌。
[0004] 生物防治(b i OI Og i Ca I contro 1)是利用生物種之間的相互關(guān)系，達(dá)到抑制另一種 或另一類(lèi)有害生物的方法。微生物生防作用，作為生物防治的一種重要方法，也是一種可持 續(xù)控制病害的手段，備受關(guān)注。近來(lái)，人們從土壤和農(nóng)作物內(nèi)部分離出萎縮芽孢桿菌，逐漸 將其用于防治病害。
[0005] 吳忠紅對(duì)具有耐鹽促生和防病作用2株萎縮芽抱桿菌進(jìn)行鑒定，并且研究其與其 它3株菌株混合培養(yǎng)以觀察混合菌劑的防效作用。涂彩虹從土壤中分離純化出一株具有黃 曲霄拮抗活性的萎縮芽孢桿菌，利用該菌株的發(fā)酵上清液觀察抑制黃曲霉生長(zhǎng)效果。
[0006] 石磊等通過(guò)平板透明圈法從大量生防菌中篩選獲得一株具有幾丁質(zhì)酶活性的細(xì) 菌菌株CAB-I，該菌株對(duì)番茄灰霉病菌等多種植物病原真菌表現(xiàn)較強(qiáng)的拮抗活性。通過(guò)生理 生化、16S rDNA和gyrB基因序列測(cè)定，將菌株CAB-I鑒定為萎縮芽孢桿菌（Baci Ilus atrophaeus)。劉丁等從土壤中分離篩選的1株對(duì)黃曲霉具有詰抗作用的萎縮芽孢桿菌 (BaciUm atrophaeus、進(jìn)一步深入研究。從營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、直接寄生、誘導(dǎo)寄主抗性和抗生作用 多個(gè)方面探討該株拮抗菌抑制黃曲霉的作用途徑，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用和誘導(dǎo)寄主抗性研究 發(fā)現(xiàn)，萎縮芽孢桿菌培養(yǎng)液無(wú)菌上清液中可能含有一種或幾種萎縮芽孢桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn) 物，具有拮抗黃曲霉的作用。
[0007] 目前芽孢桿菌作為生防制劑以可濕性粉劑為主，這種劑型雖然便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸， 但在生產(chǎn)應(yīng)用中存在很多制約因子。如施用的可濕性粉劑中大部份以芽孢作為衡量產(chǎn)品中 有效成分的惟一標(biāo)準(zhǔn)，若芽孢不能及時(shí)萌發(fā)，施用效果則不佳，如王倩利用枯草芽孢桿菌 TR21防治巴西蕉枯萎病時(shí)，前期試驗(yàn)利用TR21菌株NB發(fā)酵液灌根和葉腋接種都能有效防治 枯萎病，但是利用芽孢制備可濕性粉劑的灌根與葉腋效果卻不理想，驗(yàn)證了去掉發(fā)酵液后 的純芽孢可能因?yàn)槊劝l(fā)困難而使防效下降。
[0008] 芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，當(dāng)外部條件適合生長(zhǎng)時(shí)，芽胞會(huì)由休眠狀態(tài)經(jīng)過(guò) 一系列復(fù)雜生理生化反應(yīng)成長(zhǎng)為營(yíng)養(yǎng)體并恢復(fù)新陳代謝作用，這個(gè)過(guò)程稱為萌發(fā) (germination)。自然界中芽孢萌發(fā)受外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響，這類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被稱之為"萌發(fā) 劑"，通常營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)包括氨基酸、糖類(lèi)和嘌吟核苷的單一作用，也包括它們的協(xié)同 作用（例如:AGFK; A: L-天冬酞胺;G:葡萄糖;F:果糖;K:鉀離子）。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸到芽孢 時(shí)，芽孢內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列變化，（1 )、芽孢核內(nèi)部H+和Zn2+釋放出來(lái)，致使芽孢核內(nèi)部pH由 弱酸性上升至弱堿性；（2)、芽孢核內(nèi)部Ca 2+--DPA的大量釋放；（3)、芽孢核水合，內(nèi)部Ca2+--DPA被水所替代，芽孢的耐熱性下降；（4)、芽孢皮層的芽孢膚聚糖層水解，芽孢核膨脹；（5)、 芽孢核進(jìn)一步水合，芽孢核內(nèi)部蛋白質(zhì)流動(dòng)性增強(qiáng)，酶活性加強(qiáng)，合成ATP; (6)、降解SASP蛋 白，以釋放芽孢DNA，進(jìn)而引導(dǎo)芽孢生長(zhǎng)過(guò)程中RNA、蛋白質(zhì)、DNA的合成。
[0009] 芽孢和促進(jìn)萌發(fā)的芽孢萌發(fā)劑混合后數(shù)秒鐘之內(nèi)，萌發(fā)劑快速跨過(guò)芽孢衣和皮層 到達(dá)芽孢內(nèi)膜的表面，與位于芽孢內(nèi)膜上的受體蛋白相互作用，激發(fā)芽孢進(jìn)入萌發(fā)狀態(tài)，接 著啟動(dòng)一連串萌發(fā)事件，之后的萌發(fā)過(guò)程不會(huì)因移走萌發(fā)劑而停止。
[0010] 現(xiàn)階段，還未有在萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑的技術(shù)方案公開(kāi)，也未有在萎縮芽孢 桿菌可濕性粉劑中加入芽孢萌發(fā)劑的研究的報(bào)道。
[0011] 另外，由于不同的芽孢桿菌與濕潤(rùn)劑，分散劑等助劑的相容性，載體對(duì)各類(lèi)芽孢桿 菌吸附性各不相同，將現(xiàn)有的芽孢桿菌可濕性粉劑的配方或制備工藝無(wú)法用于制備加入芽 孢萌發(fā)劑的萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑，可濕性粉劑中有效菌的吸附量，存活率，對(duì)有害菌的 防治效果及可濕性粉劑量的穩(wěn)定性差異較大，其整個(gè)可濕性粉劑的制備方法必須全盤(pán)考慮 各載體吸附能力，對(duì)萎縮芽孢桿菌的干燥過(guò)程中保護(hù)作用，濕潤(rùn)劑，分散劑對(duì)可濕性粉劑的 懸浮率，濕潤(rùn)時(shí)間的影響，并且對(duì)芽孢萌發(fā)劑進(jìn)行全面的篩選才能夠得到濕潤(rùn)時(shí)間短，懸浮 率高，芽孢保存時(shí)間久，使用后芽孢能快速萌發(fā)的，防效好的萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種含有芽孢萌 發(fā)劑的萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑及其制備方法，芽孢萌發(fā)劑能使萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑 融入水后，萎縮芽孢能快速萌發(fā)，大大提高萎縮芽孢的萌發(fā)率，其制備的萎縮芽孢桿菌可濕 性粉劑芽孢含量為不低于100億CFU/克，懸浮率不低于82%，潤(rùn)濕時(shí)間不高于75S，細(xì)度粉碎 過(guò)400目篩，水分含量不高于5%，制備方法穩(wěn)定。
[0013] 為了達(dá)到上述目的，一種萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑由下列重量份組成:萎縮芽孢 桿菌發(fā)酵液40-70份;填料：高嶺土20-30份；潤(rùn)濕劑：十二烷基苯磺酸鈉1-4份；分散劑： Morwet D-425 0.2-1份;芽孢萌發(fā)劑：果糖0.1-1份，蘇氨酸0.1-1份，2，6-吡啶二羧酸鈣 0.1-0.5份;紫外保護(hù)劑:海藻糖1-2份，羧甲基纖維素0.2-1份;干燥保護(hù)劑:鹿糖1-5份，谷 氨酸鈉0.2-1份。
[0014] -種萎縮芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法，由以下幾步驟組成： 一、 萎縮芽孢桿菌發(fā)酵液的制備 取出菌種保藏管，用營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30°C培養(yǎng)48小時(shí)。在平板下 挑取單個(gè)菌落接種至50毫升營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中30°C震蕩培養(yǎng)24小時(shí)。種子采 用5%的接種量，接種至5L大三角瓶中的萎縮芽孢桿菌液體培養(yǎng)基，裝液量為2L，30°C震蕩培 養(yǎng)16-28小時(shí)，檢測(cè)其菌液濃度，菌液含量超過(guò)30億/毫升，即可作為萎縮芽孢桿菌種子液； 將萎縮芽孢桿菌種子液接種至1000L的發(fā)酵罐中，裝液量為600L的發(fā)酵培養(yǎng)基，通氣量為前 16小時(shí)為每分鐘液氣比為1:0.8，其后通氣量為1:1;培養(yǎng)溫度前24小時(shí)為