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一種新的三萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖_2

文檔序號:9742505閱讀:來源:國知局
Me-28)和0 · 91 (Me-29),以及一個雙峰甲基 信號δΗΟ. 82 (Me-21,J = 6.5Hz),說明該化合物為三萜類化合物。13C NMR和DEPT譜顯示30個 碳信號,包括七個甲基,八個亞甲基,五個次甲基(兩個烯烴碳),以及十個季碳(兩個酮羰 基,一個酯羰基,兩個烯烴碳以及一個含氧季碳)。側(cè)鏈具有24(25)-雙鍵(δ(:130.5,124.2和 δΗ4.99,tt,J = 7.1,1.4Hz),說明該化合物為羊毛甾醇型三萜。HMBC譜中Me-26和Me-27與C-24和C-25 ;Me-21 與C-17,C-20和C-22;以及H-24與C-22,C-23,Me-26和Me-27的相關性驗證 了上述推論。HMBC譜中,H 2-I與C-2;H-5,Me-28和Me-29與C-3的交叉峰表明C-2(SC201.1)和 〇30〇2〇5.6)為酮羰基。此外,一個酯羰基信號[6(:178.6((:-30)]和兩個碳信號[6088.3((:- 9)和64.7(C-14)]說明該化合物存在一個γ內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。HMBC譜中Me-18與C-14;H2-15與C-30;出-11與(:-9 ;!1-11€[與(:-8以及16-19與(:-9的相關性驗證了30,9-這個官能團的連接方 式。NOESY譜中H-7與H2-6,H-7與H-5的相關性,以及H-7與H2-15的交叉峰說明C-7和C-8之間 存在雙鍵。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜,以及文獻關于相關類型核磁數(shù)據(jù),可基本確 定該化合物如圖1所示,立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定,理論值與實驗值基本一致(圖 2) 0
[0027]實施例2:化合物(I)藥理作用試驗 [0028] 一、材料和儀器
[0029] HL7702肝細胞株由中國科學院上海生命科學研究所提供?;衔铮↖)自制,方法見 實施例1,HPLC歸一化純度大于98%。高糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM/F12 = 1:1培養(yǎng)基、胎牛血 清均購于HycLone JDTA購于上海試劑一廠。臺盼藍購于北京化工廠。無糖DMEM培養(yǎng)基購于 Gibco。胰酶、MTT、DMSO均購于Amresco。LDH釋放法檢測試劑盒購于GENMDE ALT生化檢測試 劑盒、AST生化檢測試劑盒、LDH生化檢測試劑盒均購于美國貝克曼試劑有限公司。Western 及IP細胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、MDA檢測試劑盒均購于碧云天生物技術研 究所。
[0030] CO2培養(yǎng)箱(SheL-Lab 2300),電熱恒溫孵育箱(上海躍進醫(yī)療器械廠),缺氧培養(yǎng) 盒(長沙長錦科技有限公司),GasALert Extreme氧氣檢測儀(加拿大BW TechnoLogies),酶 標儀(美國BioTek Epoch),全自動生化儀(Beckman LX20),離心機(德國Eppendorf centrifyge 5415D),孔板離心機(德國Eppendorfcentrifyge 5430R),電子微量天平 (METTLER TOLEDO AL104),PH儀(Thermo ORION 3 STAR)。
[00311二、試驗方法
[0032] 1、細胞分組
[0033] 將細胞分為6組,每組6個復孔:
[0034] (1)正常培養(yǎng)組(N組):完全培養(yǎng)基,正常條件下培養(yǎng);
[0035] (2)缺血再灌注組(IR組):完全培養(yǎng)基正常條件培養(yǎng)Ih后,模擬缺氧8h,再灌注4h;
[0036] (3)化合物(I)組:
[0037] REl 組:化合物(I )0 · 5ng/mL 預處理 Ih;
[0038] RE2 組:化合物(I) 5ng/mL 預處理 Ih;
[0039] RE3組:化合物(I )50ng/mL預處理Ih;模擬缺氧8h,再灌注4h;
[0040] (4)生理鹽水組(NS組):以與化合物(I)同等體積的生理鹽水預處理Ih,模擬缺氧 8h,再灌注4h。
[0041 ] 2、化合物(I)的預處理
[0042] (1)化合物(I)的配制:將Img化合物(I)溶解于500mL生理鹽水中。移液槍吸取 2.5mL于第一支離心管中,用生理鹽水稀釋至IOmL配制成濃度為500ng/mL的化合物(I)溶 液。從第一支離心管中吸取ImL至第二支離心管中,用生理鹽水稀釋至IOmL配制成濃度為 50ng/mL的化合物(I)溶液。從第二支離心管中吸取ImL至第三支離心管中,用生理鹽水稀釋 至I OmL配制成濃度為5ng/mL的化合物(I)溶液。作好標記。
[0043] (2)化合物(I)預處理:正常培養(yǎng)組和缺血再灌注組以每孔IOOyL新鮮的完全培養(yǎng) 基更換。REl組每孔加入5ng/mL的化合物(I)溶液IOyL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL,RE2組每孔 加入50ng/mL的化合物(I)溶液IOyL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL,RE3組每孔加入500ng/mL的 化合物(I)溶液IOyL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL。生理鹽水組每孔加入生理鹽水IOyL和新鮮 的完全培養(yǎng)基90yL。輕輕搖動96孔板,使藥液充分混混勻,放入CO 2培養(yǎng)箱中孵育Ih。
[0044] 3、肝細胞體外模擬缺血再灌注損傷模型的建立:
[0045] (1)體外模擬缺血過程:預處理時間結(jié)束后,從細胞培養(yǎng)箱中取出第一塊96孔板, 正常培養(yǎng)組每孔用I OOyL完全培養(yǎng)基更換,放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h。從CO2培養(yǎng)箱中取 出第二塊96孔板,缺血再灌注組、化合物(I)預處理組和生理鹽水組每孔用IOOyL無糖DMEM 培養(yǎng)基置換完全培養(yǎng)基,放入缺氧培養(yǎng)盒中,培養(yǎng)盒中放入盛有50mL滅菌水的無菌小瓶保 持飽和濕度。將缺氧培養(yǎng)盒放入37°C恒溫孵育箱中,進氣口連接94%N 2-5 %⑶2-1 %O2混合 氣體,出氣口連接氧氣檢測儀。以2L/min的氣體流量通入混合氣體,當氧氣檢測儀顯示出氣 口氧氣濃度〈1 %時,調(diào)節(jié)混合氣體流量300mL/min維持出氣口氧氣濃度〈1 %。以此模擬缺血 過程8h。
[0046] (2)體外模擬再灌注過程:從CO2培養(yǎng)箱中取出第一塊96孔板,正常培養(yǎng)組每孔更 換I OOyL新鮮的完全培養(yǎng)基,放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。從缺氧培養(yǎng)盒中取出第二塊96 孔板,缺血再灌注組、化合物(I)預處理組和生理鹽水組每孔用1〇〇此新鮮的完全培養(yǎng)基置 換無糖DMEM培養(yǎng)基,放入CO 2培養(yǎng)箱中正常條件下(37°C、5 % CO2、95 %空氣、飽和濕度)培養(yǎng) 4h,模擬再灌注過程。
[0047] 3、指標檢測
[0048] 3.1 MTT法檢測肝細胞活力
[0049] (I)MTT溶液配制:用電子微量天平稱取250mg MTT,放入小燒杯中,加入50mL PBS 攪拌30min,使之充分溶解,即為濃度為5mg/mL的MTT溶液。在超凈工作臺中用0.22μπι的微孔 濾器除菌,分裝為每支lmL,4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0050] (2)細胞準備:按上述方法進行細胞分組,并另設調(diào)零孔。并按上述方法進行化合 物(I)預處理和體外模擬缺血再灌注過程。
[0051 ] (3)呈色:終末時間點每孔加入5mg/mL的MTT溶液20yL,放入37°C、5 %⑶2、95 %空 氣、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入IOOyL DMSO溶液,微量振蕩器上振蕩I Omin,使結(jié)晶物充分溶解。
[0052] (4)比色:選擇570nm波長,在酶標儀上測定各孔光吸收度(A),記錄結(jié)果。實驗重復 2次。
[0053] 3.2乳酸脫氫酶釋放法細胞繁殖與毒性檢測
[0054] 按GENMED乳酸脫氫酶釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒說明書操作,重復2 次。
[0055] (1)按上述方法準備待測細胞,并另設無細胞的培養(yǎng)液(背景空對照孔)和未處理 的后續(xù)裂解的細胞(樣品最大酶活性對照孔),作好標記。
[0056 ] (2)到規(guī)定的檢測時間點前1小時,從CO2培養(yǎng)箱中取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板,加 入IOyL GENMED裂解液到未處理的后續(xù)裂解的細胞孔里,同時加入IOyL GENMED補充液到其 余所有檢測孔里。放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1小時即規(guī)定檢測時間。
[0057] (3)從⑶2培養(yǎng)箱取出待測96孔細胞培養(yǎng)板,放入孔板離心機離心10min,速度為 250g〇
[0058] (4)分別小心移取50yL上清液到新的96孔板的相應孔里,同時作好標記。
[0059] (5)混勻GENMED反應液,每孔分別加入50yL GENMED反應液,再分別每孔加入IOyL GENMED顯色液,搖動96孔板混勻。
[0060] (6)在室溫下孵育30min,避免光照。
[0061] (7)每孔分別加入IOyL
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