.6(CH2，16-C)，58.1(CH，17-C)，19.5(CH3，18-C)，15.3(CH3，19-C)，30.8(CH，20-C)，66.0(CH2,21-C)，33.9(CH2,22-C)，68.6(CH，23-C)， 113.1(C，24-C)，56.7(C，25-C)，25.1(CH3,26-C)，23.2(CH3,27-C)，34.3(CH3,28-C)，23.4 (CH3,29-C)，27.4(CH3,30-C)，171.1(C，l-0Ac)，20.7(CH3a-0Ac)，171.8(C，7-0Ac)，21.1 (013,7-(^(：);碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外波譜表明該化合物含有羥基（3448(31^ 1)和羰基 (1730cm-4基團(tuán)。4NMR譜顯示九個甲基信號（δΗΙ.99,1.92,1.46,1.23,1.18,1.17,1.13， 1.12，1.〇1，各3!1，8)，一個烯屬質(zhì)子0!15.18)，五個含氧質(zhì)子信號（6!15.〇4,4.74,3.79， 3.71，3.47)。13CNMR、DEPT和HSQC譜中顯示有34個碳信號，包括九個甲基，七個亞甲基(一個 含氧），八個次甲基(三個含氧次甲基和一個烯屬次甲基），以及十個季碳(三個羰基碳，三個 含氧季碳和一個烯烴季碳）譜中，H-1 (δΗ4.74，d，J= 7.5Hz)和H-7 (5.04，br，s)分別與 相應(yīng)羰基碳0C171.1和171.8)的相關(guān)性表明C-1和C-7位各連有一個乙酰氧基。ROESY譜中， H-1與Me-19的交叉峰以及H-7與Me-30的相關(guān)性表明兩個乙酰氧基均為α構(gòu)型。HMBC譜中H-1 與C-3，C-5和C-10，H2-2與C-3，Me-28和Me-29與C-4，Me-19與C-1的相關(guān)性表明Α環(huán)為七元內(nèi) 酯環(huán)。此外，通過HMBC譜中Me-19 與C-5 和C-9，Me-30 與C-7，C-9 和C-14，Me-18 與C-12，C-14 和 C-17，烯烴質(zhì)子H-15與C-8，C-13和C-17的相關(guān)性，可知該化合物還含有B、C和D環(huán)。HMBC譜 中，含氧亞甲基質(zhì)子H2-21與含氧季碳C-24(SC113.1)的相關(guān)性表明C-21和C-24之間存在氧 橋。HMBC譜中Η-23與C-22和C-24的相關(guān)性表明C-23位連有一個羥基。R0ESY譜中，Η-1與Me-19，Me-19與Me-29，Me-19與Me-30，Me-30與H-7，以及Me-30與H-17的相關(guān)性表明H-1，H-7， Me-19，Me-29和Me-30為β構(gòu)型。此外，Me-18與H-9，H-9與H-5，以及H-5與Me-28的交叉峰表明 它們均為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基 本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過EO)試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致 (圖 2)。
[0029]實(shí)施例2:化合物(I)藥理作用試驗(yàn) [0030] 一、材料和儀器
[00311健康雌性SD大鼠由上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供?；衔铮↖)制備方法見 實(shí)施例1，HPLC歸一化純度大于98%。二甲基亞砜、銀杏提取物(EGb761，陽性藥）、ΜΤΤ、Αβ25-35、L-多聚賴氨酸均購于美國SIGMA公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、Neurobasal、B27購于美國GIBC0 公司。NSE購于英國ABC0M公司。Tunel購于武漢Boster公司。LDH試劑盒購于南京建成生化試 劑公司。
[0032] 電子天平，北京賽多利斯。1815TCC02恒溫孵育箱（美國Shel-Lab公司），TH_2C恒 溫震蕩器（江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），解剖顯微鏡（日本OLYMPUS公司），臺式離心機(jī)（德國Heraeus公司），酶標(biāo)儀（日本DynaTtech公司），J2-HS全自動高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman 公司）。
[0033]二、試驗(yàn)方法
[0034] 1、海馬神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)
[0035] 1.1海馬組織取材的具體過程
[0036] (1)將16-18d孕齡的健康雌性SD大鼠常規(guī)麻醉并消毒，解剖后取出胎鼠，放入D- Hank's平衡鹽溶液中。
[0037] (2)將其放置于解剖顯微鏡下緩慢剝離胎鼠的頭部皮膚與顱骨，然后看到暴露的 大腦雙側(cè)半球。
[0038] (3)于大腦半球外側(cè)面小心分離腦膜和大腦皮層，即可見海馬組織。
[0039] (4)用解剖鑷小心夾取海馬組織，將其放于D-Hank's平衡鹽溶液中反復(fù)漂洗三遍， 徹底去除腦膜和表面血管。
[0040] (5)分離血絲和腦膜，即得海馬組織，用于海馬神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。
[0041] 1.2海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)的具體過程
[0042] (1)將所取得的海馬組織用眼科剪充分剪碎。
[0043] (2)用濃度為0.125%的胰酶消化25min，然后用含15%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng) 基完全培養(yǎng)液終止消化。
[0044] (3)于離心機(jī)中以800rpm的速度離心lOmin。
[0045] (4)棄去上清并加入培養(yǎng)基(NeurobasalMedium/B27)后，用尖端已被火焰拋光的 彎頭吸管緩慢的吹打，反復(fù)吹打直至吹打均勻后，靜置5min，所得的上液即為所需的海馬神 經(jīng)細(xì)胞懸液。
[0046] (5)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按所需細(xì)胞密度分別植入預(yù)先包被L-多聚賴氨酸的96孔板或6 孔培養(yǎng)板中。其中96孔培養(yǎng)板中每孔約1OOyL，6孔培養(yǎng)板中每孔約1.5mL。
[0047] (6)放入37°C的C02孵育箱中，培養(yǎng)3d后用于實(shí)驗(yàn)。
[0048] 2、化合物(I)最佳效應(yīng)時間和最佳作用濃度的篩選
[0049] 設(shè)計(jì)如下七組分組：①10yg/mL組；②20yg/mL組；③40yg/mL組；④60yg/mL組；⑤80 yg/mL組;⑥100yg/mL組;⑦0yg/mL組（即空白對照組）。將化合物（I)各劑量組分別作用24h， 48h和72h，分別每孔加入二甲基亞砜100yL，充分溶解后，在波長為570nm的全自動酶標(biāo)儀下 觀察并測定其光密度值(0D值），取光密度最高處的藥物濃度及對應(yīng)的作用時間作為本實(shí)驗(yàn) 篩選的化合物(I)的最佳作用條件。采用MTT比色法進(jìn)行最佳作用條件篩選。
[0050] 3、化合物(I)對Αβ25_35誘導(dǎo)損傷情況下海馬神經(jīng)元的影響
[0051 ]采用已配制好在37°C下聚合7d的Αβ25-35建立海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的模型。實(shí)驗(yàn)分 組如下:A:空白對照組Contro1組，Β:Αβ組，C:化合物（I) +Αβ組，D:化合物（I)+I(inhibitor) +Αβ組(在化合物（I) +Αβ組基礎(chǔ)上加入BDNF的拮抗劑K252a)，E:EGB+Αβ組，F(xiàn):化合物（I)組， G:EGB組;海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)3d后，在培養(yǎng)液中加入25yg/mL的Αβ25-35，4h后再按照分 組分別給藥。
[0052] 3.1化合物（I)對Αβ25_35誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性的影響
[0053] 3.1.1ΜΤΤ比色法檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞活力的步驟
[0054] (1)將海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)3d后，分別加入化合物（I) :40yg/mL，EGb761:150yg/ mL及空白對照組什么都不加。48h后進(jìn)行MTT比色法。
[0055] (2)分別在96孔板中每孔加入配制好的MTTlOyL。
[0056] (3)將其置于37°C的C02培養(yǎng)箱中孵育4h。
[0057] (4)緩慢吸去上清后每孔加入100yL的二甲基亞砜作用10min，使之充分溶解。
[0058] (5)在波長為570nm的全自動酶標(biāo)儀下測定每孔的光密度值。
[0059] 3.2化合物（I)對Αβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
[0060] 3.2.1實(shí)驗(yàn)分組
[0061] 通過檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3的活性，觀察化合物 (I)對Αβ25-35誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)共分為七個組:A:Control組，B:AM&，C: 化合物（I) +Αβ組，D:化合物（I)+Ι+Αβ組，E:EGB+Αβ組，F(xiàn):化合物（I)組，G:EGB組。
[0062] 3.2.2實(shí)驗(yàn)步驟
[0063] (1)按分組分別給予藥物48h后，小心收集細(xì)胞并以400rpm的轉(zhuǎn)速離心5min后，吸 棄上清。
[0064] (2)將海馬神經(jīng)細(xì)胞重懸