基于熒光染料法數(shù)字微滴pcr檢測血液中結(jié)核桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于結(jié)核桿菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于熒光染料法數(shù)字微滴PCR檢測血液中結(jié)核桿菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 數(shù)字微滴PCR(digitaldropletPCR，ddPCR)是近年來新出現(xiàn)的一種PCR技術(shù)。在 原有PCR[PolymeraseChainReaction(聚合酶鏈反應(yīng)），簡稱PCR]技術(shù)的基礎(chǔ)上，該技術(shù) 進(jìn)行了大幅革新。該技術(shù)將傳統(tǒng)PCR中的每一份樣品反應(yīng)體系均分為20000個(gè)獨(dú)立微滴， 然后再進(jìn)行PCR反應(yīng)。在制作微滴時(shí)，只有部分微滴可以包裹到目的基因。PCR反應(yīng)結(jié)束后 用設(shè)備檢測所有微滴的熒光信號(hào)值。再根據(jù)熒光信號(hào)的閾值來區(qū)分每一個(gè)微滴的信號(hào)值， 高于閾值的微滴信號(hào)值判定為該微滴包裹到了目的基因，稱為陽性微滴。低于閾值的微滴 信號(hào)，判定為該微滴沒包裹到目的基因，稱為陰性微滴。最后經(jīng)過設(shè)備統(tǒng)計(jì)陽性微滴數(shù)，并 自動(dòng)計(jì)算后得出目的基因拷貝數(shù)。
[0003] 結(jié)核桿菌感染人體，按發(fā)病部位不同主要分為肺結(jié)核與肺外結(jié)核兩大類。傳統(tǒng)的 結(jié)核桿菌檢測方法常用痰涂片法。
[0004] 申請?zhí)枮?01110153090. 4的中國專利申請公開了一種檢測痰液中結(jié)核桿菌的方 法，該方法將痰液薄層均勻涂在2-3張玻片上，固定并染色，然后通過酸性酒精脫色和復(fù) 染，用攝像頭對玻片進(jìn)行掃描圖像、分割，提取分割后細(xì)胞的形狀特征，利用計(jì)算的特征值 對細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分類，從而檢測出痰液中是否存在結(jié)核桿菌。該方法需要每毫升痰中至少 含有5000-10000個(gè)細(xì)菌才可以檢測出，且檢測敏感性欠佳。痰培養(yǎng)法常作為肺結(jié)核診斷的 "金標(biāo)準(zhǔn)"，但費(fèi)時(shí)較長，需要2-8周時(shí)間，容易導(dǎo)致患有結(jié)核病的患者錯(cuò)過早期治療的最佳 時(shí)機(jī)，導(dǎo)致療程加長，且治療副作用加重，增加病人痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0005] 更重要的是，在結(jié)核病中，肺外結(jié)核大約占20%。包括骨結(jié)核、腎結(jié)核、腸結(jié)核等 等。對于肺外結(jié)核而言，由于病灶處結(jié)核菌數(shù)量較少、難以獲得各器官的檢測樣本、無法進(jìn) 行痰檢等原因，使得檢測過程異常艱難。因此往往需要多種檢測方法共同使用后，方可在一 定程度上作出診斷，整個(gè)檢測過程尤顯繁瑣、低效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于熒光染料法數(shù)字微滴PCR檢測血液中 結(jié)核桿菌的方法。所述方法運(yùn)用數(shù)字微滴PCR檢測血液中是否含有結(jié)核桿菌，靈敏度高，檢 測快速。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種基于熒光染料法數(shù)字微滴PCR檢測血液中結(jié)核桿菌 的方法，包括以下步驟：
[0008] 步驟⑴采集血液，提取血液中的總DNA;
[0009] 步驟（2)將總DNA進(jìn)行數(shù)字微滴PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，檢測所有微滴的熒光信 號(hào)值并設(shè)定閾值，根據(jù)閾值確定微滴是否包裹結(jié)核桿菌DNA，高于閾值的微滴包裹結(jié)核桿菌 DNA，為陽性微滴，低于閾值的微滴不包裹結(jié)核桿菌為陰性微滴；
[0010] 步驟（3)統(tǒng)計(jì)陽性微滴數(shù)，計(jì)算得出結(jié)核桿菌DNA的拷貝數(shù)，繼而得到血液中結(jié)核 桿菌DNA的總拷貝數(shù)，從而判斷血液中是否含有結(jié)核桿菌。
[0011] 本發(fā)明基于熒光染料法數(shù)字微滴PCR檢測結(jié)核桿菌的原理為：首先提取出血液中 總DNA，血液中既有宿主（人或動(dòng)物）的DNA也有結(jié)核桿菌DNA，將總DNA進(jìn)行數(shù)字微滴PCR， 數(shù)字微滴PCR在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，將每一份樣品反應(yīng)體系均分為20000個(gè)的獨(dú)立微滴， 然后再進(jìn)行PCR反應(yīng)；在制作微滴時(shí)，只有部分微滴可以包裹到結(jié)核桿菌DNA。數(shù)字微滴 PCR可以對極微量的結(jié)核桿菌DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行絕對定量，得到樣品中極 低含量結(jié)核桿菌DNA的確切拷貝數(shù)，從而可以判斷血液中是否含有結(jié)核桿菌。
[0012] 步驟（1)提取血液中的總DNA的過程如下：
[0013] 步驟（a)血液中加入pH為8的TES緩沖液和5%的SDS溶液后，先置于36~37°C 水浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混懸液；
[0014] 步驟（b)在混懸液中加入pH4. 8的醋酸鈉溶液和0. 05mol/L的葡萄糖溶液，冰上 放置10~20min;然后加入苯酚/氯仿/異戊醇溶液提取，離心后取上層水相，上層水相中 加入氯仿/異戊醇提取，離心后，取上層水相，加入乙醇，充分震蕩后，-20°C沉淀30min，離 心得到總DNA。
[0015] 血液中DNA包括宿主DNA和結(jié)核桿菌DNA。由于結(jié)核桿菌細(xì)胞壁比較難破壞，難以 提取結(jié)核桿菌DNA，如何破壞結(jié)核桿菌細(xì)胞壁是本發(fā)明需要克服的一大技術(shù)難題。本發(fā)明在 使用細(xì)胞裂解液的基礎(chǔ)上加入溶菌酶，并在沸水浴反應(yīng)，從而有效破壞結(jié)核桿菌DNA的細(xì) 胞壁。
[0016] 步驟（a)TES緩沖液用于裂解細(xì)菌的細(xì)胞壁，釋放DNA，其中含有Tris-HCl(三羥甲 基氨基甲烷一鹽酸）、Η)ΤΑ(乙二胺四乙酸）和SDS(十二烷基磺酸鈉），故簡稱TES;TES緩 沖液還含有溶菌酶，溶菌酶的濃度為20mg/mL。
[0017] SDS是一種蛋白變性劑，破壞蛋白質(zhì)的尚級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0018] 加入TES緩沖液后，再加5 %的SDS溶液可以使得DNA更易沉淀。
[0019]步驟（a)所述溫水浴的溫度為36~37°C，溶菌酶在該溫度范圍下活性最高，從而 裂解小鼠肺組織中結(jié)核桿菌細(xì)胞壁。
[0020] 步驟（a)沸水浴的目的有兩個(gè)：第一，在裂解細(xì)胞的工作完成后，為了避免溶菌酶 繼續(xù)反應(yīng)，產(chǎn)生高溫使得溶菌酶失活。第二，沸水浴條件下，也可使溶菌酶裂解不充分的結(jié) 核桿菌細(xì)胞壁得到進(jìn)一步破碎，從而進(jìn)一步提高DNA得率。
[0021] 步驟（b)所述苯酚/氯仿/異戊醇溶液中苯酸、氯仿和異戊醇體積比為25 :24 :1， 所述氯仿/異戊醇溶液中氯仿和異戊醇的體積比為24 :1。
[0022] 步驟（a)和步驟（b)中所述離心條件為12000r/min,離心lOmin。
[0023] 步驟（b)加入乙醇充分震蕩后，在低溫條件下可使得DNA更容易沉淀，且可保護(hù) DNA不被降解。
[0024] 步驟（2)數(shù)字微滴PCR使用的引物是本發(fā)明以結(jié)核菌特有基因IS6110(GenBank 編號(hào)：X52471)為模板設(shè)計(jì)出的，序列如下：
[0025]前引物：5 ' 一AGAAGGCGTACTCGACCTGA- 3 '，
[0026]后引物：5 ' 一CTGAACCGGATCGATGTGTA- 3 '。
[0027]步驟（2)數(shù)字微滴PCR反應(yīng)體系中，2XQX200ddPCREvaGreenSupermix、DNA模 板、前引物、后引物和水的體積比為10 :2 :0. 2 :0. 2 :7. 6。
[0028]所述 2XQX200ddPCREvaGreenSupermix是ddPCR反應(yīng)所需的混合試劑，由 Bio-Rad公司生產(chǎn)銷售。
[0029] 步驟（2)數(shù)字微滴PCR反應(yīng)條件如下：在95°C進(jìn)行酶激活，激活時(shí)間為5min，循 環(huán)1次；95°C變性30s，52°C退火lmin，變性與退火循環(huán)35次；在4°C下信號(hào)穩(wěn)定lmin，穩(wěn)定 5min，循環(huán)1次；在90°C下信號(hào)穩(wěn)定lmin，穩(wěn)定5min，循環(huán)1次；在4°C下保溫，循環(huán)1次。
[0030] 步驟（3)微滴具有熒光信號(hào)，包裹宿主DNA和包裹結(jié)核桿菌DNA的微滴的熒光信 號(hào)值不同，初始閾值是ddPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)備自行設(shè)定的，然后根據(jù)陽性對照組和陰性對照組微 滴信號(hào)圖中的陰、陽性微滴分布情況來修正并最終劃定閾值；閾值根據(jù)微滴的熒光信號(hào)值 將包裹宿主DNA的液滴和包裹結(jié)核桿菌DNA的液滴劃分開。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0032] 1、本發(fā)明提供的方法取樣方便快捷，僅需采集微量（200μ1)血液即可檢測出微 量結(jié)核菌的存在，靈敏度達(dá)到可檢測出每微升血液中所含結(jié)核菌DNA的確切拷貝數(shù)；
[0033] 2、本發(fā)明提供的方法準(zhǔn)確率高，檢測快速，僅需2小時(shí)就可完成檢測過程。
【附圖說明】
[0034] 圖1為陽性對照組ddPCR微滴信號(hào)分布圖；
[0035] 圖2為陰性對照組ddPCR微滴信號(hào)分布圖；
[0036] 圖3為實(shí)施例lddPCR微滴信號(hào)分布圖；
[0037] 圖4為實(shí)施例2ddPCR微滴信號(hào)分布圖；
[0038] 圖5為對比例ddPCR微滴信號(hào)分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0040] 本發(fā)明的技術(shù)方案由云南省高校熱帶傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、云南省熱帶傳染病示 范型國際科技合作基地、云南省公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心支持，并在以下基金 項(xiàng)目的支撐下完成，基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（N〇:81060134;81371835; 31560051 ;81560596);云南省自然基金項(xiàng)目（No. 2010CD221，2011FB244,2012FB011， 2013FZ057,2014FA011, 2014FB001)。
[0041 ] 在以下實(shí)施例中，pH為8的TES緩沖液試劑的配制過程：
[0042]三種成分濃度比例如下：pH8.OTris-HCl10mmoL/L，EDTAImmoL/L，SDS0·ImmoL/ L，配制1L的TES緩沖液時(shí)，按上述濃度比例計(jì)算，需要加入pH8. 0的Tris-HCl10ml，EDTA 0. 29g，SDS0. 028g，然后用超純水將上述成分溶解并定容到1L的體積，最后用微量NaOH調(diào) 整pH值到8.0。
[0043] 實(shí)施例中以結(jié)核菌特異基因IS6110(GenBank編號(hào)：X52471)為模板設(shè)計(jì)引物序 列，由上海生工科技公司合成；"2XQX200ddPCREvaGreenSupermix試劑"由Bio-Rad中 國公司提供；QX100?DropletDigital?PCRSystem(QX100數(shù)字微滴PCR系統(tǒng)）實(shí)驗(yàn)設(shè) 備由Bio-Rad中國公司提供。
[0044] 對比例
[0045] 采集正常人外周血液本29份，作為正常對照組，每份血液按照如下步驟進(jìn)行提取 DNA：
[0046] 步驟（1) 200μ1血液中加入TES(PH為8,含溶菌酶濃度為20mg/ml) 200μ1和5% (W/V)SDS溶液120μ1，在36°C水浴中40min，沸水浴中60min，冰上放置5min，得到混懸液；
[0047] 步驟⑵混懸液中加500μ1PH4. 8的NaAc(醋酸鈉）和100μ10. 05mol/LG(葡 萄糖），顛倒混勻，冰上放置15min分裝成兩管，每管加入600μ1苯酚/氯仿/異戊醇