專利名稱:一種直接鑒定高等植物dna同源重組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物遺傳性狀的分析方法，尤其涉及一種直接鑒定高等植物DNA同源重組的方法，屬于植物遺傳學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
減數(shù)分裂是有性生殖物種世代交替的轉(zhuǎn)折點，而減數(shù)分裂過程中同源染色體間發(fā)生重組使生殖細胞的遺傳基礎(chǔ)多樣化從而加速了生物的進化。雖然人們對于同源重組進行了大量研究，其仍然是所知甚少的遺傳學現(xiàn)象之一。從上世紀60年代開始，人們對同源重組機制在原核生物和真菌系統(tǒng)中進行了系統(tǒng)的研究，并相繼提出了多種同源重組模型(Holliday R. A mechanism for gene conversion in fung1. Genet. Res, 1964,5 :282-304 ；Meselson M S, Radding C M. A general model of genetic recombination. Proc. Natl.Acad. Sc1. USA,1975, 72 :358-361 ；Szostak J W,Orr-weaver T L,Rothstein R J，et al.,The double-strand break-repair model for recombination. Cell,1983,33 :25-35)。目前得到廣泛認可的同源重組模型為Szostak等(1983)提出的雙鏈斷裂模型，其大致可以概括為DNA鏈發(fā)生雙鏈斷裂；單鏈DNA末端侵入形成hoiIiday連接體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA ；Holliday中間體切開并對錯配堿基進行修復。并通過電鏡證實holliday連接體的存在(Potter H, Dressier D. On the mechanism of genetic recombination electron microscopic observation intermediates. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA,1976,73:3000-3004)。目前多數(shù)遺傳重組現(xiàn)象的研究集中在原核及真菌生物中(PadmoreR, Cao L, Kleckner N. Temporal comparison of recombination and synaptonemalcomplex formation during meiosis in S.cerevisiae. Cell,1991,66 :1239-1256 ；Goldway M, Sherman A, Zenvirth D, Arbel T, Simchen G.A short chromosomal regionwith major roles in yeast chromosome III meiotic disjunction, recombinationand double strand breaks. Genetics, 1993,133 :159-169 ；Jessop L, Allers T, LichtenM.1nfrequent co-conversion of markers flanking a meiotic recombinationinitiation site in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 2005,169 :1353-1367)。對于高等植物，由于缺乏合適的研究材料及方法，迄今尚未見從DNA水平直接觀測高等植物同源重組的方法以及判斷是否有異源雙鏈DNA形成的相關(guān)證據(jù)。
就植物而言，植物孢母細胞減數(shù)分裂完成后，其大、小孢子發(fā)育都需通過一次以上的有絲分裂才能形成卵細胞或精子，而有絲分裂具有使異源雙鏈DNA“純合化”的作用，以至無法直接檢測異源雙鏈DNA的存在。這主要是由于在大、小孢子發(fā)育過程中，通過Ho 11 idayjunction結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的異源雙鏈DNA經(jīng)有絲分裂的DNA復制而形成兩條DNA鏈“純合化”的姊妹染色體，并經(jīng)過有絲分裂后期染色體分離(減數(shù)后分離)，兩條姊妹染色體分別進入不同的配子。由于同源重組的存在，這兩條姊妹染色體遺傳基礎(chǔ)并不相同，但此后不論經(jīng)過多少次有絲分裂，但每個單倍性配子只有DNA鏈已經(jīng)完全一致的姊妹染色體中的一條。這樣，在正常二倍體雜種后代中，只能通過兩個或多個連鎖位點或性狀分析判斷是否發(fā)生遺傳重組，而僅針對一對性狀或一個位點，則難以辨別是否發(fā)生同源重組，更無法直接判別異源雙鏈DNA的形成與否。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的植物同源重組的檢測方法對于一對性狀或一個位點難以鑒別是否發(fā)生同源重組的問題，提供一種新的直接鑒定高等植物DNA同源重組的方法，該方法可以通過檢測是否有異源雙鏈DNA形成從而判別該位點是否發(fā)生同源重組以及重組率的大小。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種直接鑒定高等植物DNA同源重組的方法，包括以下步驟
(I)以待鑒定的植物為母本，施加理化處理誘導胚囊染色體加倍獲得兩條姊妹染色體共存于同一配子的2η雌配子；(2)用2η雌配子與父本植物的雄配子雜交獲得雜種三倍體材料；(2)篩選獲得父母本有差異且母本雜合的共顯性分子標記引物；(3)提取母本以及三倍體材料的DNA為擴增模板，以篩選的共顯性分子標記引物作為PCR擴增引物，分別進行PCR擴增；(4)將擴增產(chǎn)物分別進行毛細管電泳分析如果雜種三倍體材料的擴增產(chǎn)物中只出現(xiàn)母本的共顯性分子標記的其中之一，表明在該分子標記相關(guān)位點未發(fā)生同源重組；如果雜種三倍體材料的擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)了母本的全部遺傳信息，則說明待鑒定的母本植物在該分子標記相關(guān)位點發(fā)生了同源重組并形成異源雙鏈DNA。
只有在適宜的大孢子發(fā)育時期進行理化處理才能獲得兩條姊妹染色體共存于同一配子的2η雌配子。本發(fā)明通過進一步的試驗發(fā)現(xiàn)，只有在胚囊發(fā)育的第一次有絲分裂時期(即單核胚囊時期向二核胚囊發(fā)育之間)對胚囊施加理化處理才能獲得兩條姊妹染色體共存于同一配子的2η雌配子，從而阻止同源重組形成的異源雙鏈DNA減數(shù)后分離，并通過與一父本雜交而將相關(guān)信息固定于三倍體內(nèi)，是本發(fā)明方法得以成功檢測DNA同源重組的基礎(chǔ)。
公開號為CN 101147465Α的中國發(fā)明專利公開了一種誘導植物胚囊染色體加倍選育三倍體的方法，該申請所要解決的技術(shù)問題是植物三倍體誘導時機和效率問題，該申請披露了誘導植物胚囊染色體加倍的有效時期為四核胚囊時期。本發(fā)明通過進一步的試驗發(fā)現(xiàn)，在四核胚囊時期對其施加理化處理并不能阻止同源重組形成的異源雙鏈DNA減數(shù)后分離，只有在單核胚囊向二核胚囊發(fā)育時施加理化處理誘導胚囊第一次有絲分裂染色體加倍，才能保證使異源雙鏈DNA經(jīng)過復制形成的兩條姊妹染色體共存于同一個2η配子中。
所述的理化處理可以是誘導植物多倍體的各種常規(guī)手段，例如可以用秋水仙堿溶液進行浸泡處理，秋水仙堿溶液的濃度可以為O. 3-0. 5%，處理的時間可以是6-48小時等；此外，也可以采用高溫對胚囊進行處理，所述的高溫可以是38-44°C等，所述的處理時間可以是1-8小時等；總之，這些誘導植物多倍體的各種常規(guī)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通曉。
分子標記是以DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標記，其中包括可檢測植物因同源重組形成的異源雙鏈的共顯性分子標記，如SSR分子標記。采用共顯性分子標記(如SSR)分析胚囊染色體加倍來源的三倍體后代的遺傳信息，就可以通過分析是否有異源雙鏈DNA形成而檢測同源重組發(fā)生情況。根據(jù)所要檢測的母本樣品，再選擇與母本雜交的適宜父本，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫結(jié)合毛細管電泳篩選就可得到對于父母本有差異且母本雜合的共顯性分子標記引物。
以待鑒定的母本植物為哲引3號楊(Populus pseudo-simonii XP.nigra ‘Zheyin3#’ )為例,本發(fā)明選定北京楊’(P. Xbeijingensis)為與哲引3號楊進行雜交的父本。本發(fā)明通過楊樹 SSR 數(shù)據(jù)(http://www. ornl. gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)并結(jié)合毛細管電泳反復篩選得到對于父母本有差異且母本雜合的三對SSR引物，具體序列見表I。
本發(fā)明利用源于胚囊染色體加倍獲得的特殊三倍體群體以及篩選出的共顯性分·子標記，通過分析是否存在異源雙鏈DNA而判別相關(guān)DNA區(qū)段是否具有遺傳重組，統(tǒng)計胚囊染色體加倍獲得的雜種三倍體群體中顯示該植物所有遺傳信息的植株數(shù)，從而較為方便地計算出某雜交組合中某一基因位點實際發(fā)生的同源重組率。本發(fā)明方法對于植物遺傳分析、分子標記技術(shù)方法判別以及指導三倍體育種等具有重要的理論和應(yīng)用價值。


圖1引物GCPM_2570擴增胚囊染色體加倍來源的三倍體株系及其親本后的毛細管電泳圖譜。
圖2引物PMGC_93擴增胚囊染色體加倍來源的三倍體株系及其親本的毛細管電泳圖譜。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例1檢測‘哲引3號楊’在孢母細胞減數(shù)分裂過程中的同源重組情況試驗
一、試驗材料
待檢測母本材料‘哲引3 號楊’(P. pseudo-simonii XP. nigra ‘Zheyin3#’)；
父本材料‘北京楊’(P.Xbeijingensis)。
二、試驗方法及檢測結(jié)果
當‘哲引3號楊’的胚囊發(fā)育階段處于單核胚囊時期向二核胚囊發(fā)育之間對胚囊施加理化處理(用0. 3-0. 5%的秋水仙堿溶液浸泡雌花序6-48小時)，獲得兩條姊妹染色體共存于同一配子的2n雌配子；將2n雌配子與‘北京楊’ (P. Xbeijingensis)的雄配子進行雜交獲得三倍體植株；
依據(jù)楊樹SSR 數(shù)據(jù)庫(http: //www. ornl. gov/sci/ipgc/ssr_resource. htm),篩選對于‘哲引3號楊’及‘北京楊’有差異，且‘哲引3號楊’為雜合的三對共顯性SSR引物，分別為 GCPM_2570、PMGC_93 和 WPMS_16 (表 I)。
表I適于檢測‘哲引3號楊’ X ‘北京楊’母本同源重組的SSR引物
權(quán)利要求
1.一種直接鑒定楊屬植物DNA同源重組的方法，包括以下步驟 (1以待鑒定的楊屬植物為母本，施加理化處理誘導胚囊染色體加倍獲得兩條姊妹染色體共存于同一配子的2η雌配子；(2)用2η雌配子與父本植物的雄配子雜交獲得雜種三倍體材料；(2)篩選獲得父母本有差異且母本雜合的共顯性分子標記引物；(3)提取母本以及雜種三倍體材料的DNA為擴增模板，以篩選的共顯性分子標記引物作為PCR擴增引物，分別進行PCR擴增；(4)將擴增產(chǎn)物分別進行毛細管電泳分析如果雜種三倍體材料的擴增產(chǎn)物中只出現(xiàn)母本的共顯性分子標記的其中之一，表明在該分子標記相關(guān)位點未發(fā)生同源重組；如果雜種三倍體材料的擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)了母本的全部遺傳信息，則說明待鑒定的母本植物在該分子標記相關(guān)位點發(fā)生了同源重組并形成異源雙鏈DNA，其中，在母本大孢子發(fā)育過程中處于單核胚囊時期向二核胚囊發(fā)育之間，即胚囊第一次有絲分裂時期，施加所述的理化處理。
2.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的母本是‘哲引3號楊’(P. pseudo-simonii XP. nigra ‘Zheyin3#’);所述的父本是‘北京楊’ (P. Xbei jingensis)。
3.按照權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述的理化處理包括用秋水仙堿溶液進行浸泡處理或用高溫進行誘導。
4.按照權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于所述的秋水仙堿溶液的濃度為O.3-0. 5%,所述的處理時間是6-48小時；所述的高溫溫度是38-44°C，所述的處理時間是1_8小時。
5.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的共顯性分子標記引物是SSR引物。
6.按照權(quán)利要求
1或5所述的方法，其特征在于所述的共顯性分子標記引物選自以下3組引物中的任意一組(1)由SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2組成的引物對；(2)由SEQID No. 3和SEQ ID No. 4組成的引物對；(3)由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6組成的引物對。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種直接鑒定高等植物DNA同源重組的方法，包括(1)以待鑒定的植物為母本，誘導胚囊染色體加倍獲得2n雌配子；(2)2n雌配子與父本植物雄配子雜交獲得雜種三倍體；(2)篩選獲得共顯性分子標記引物；(3)以篩選的共顯性分子標記引物進行PCR擴增；(4)擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳分析如果三倍體擴增產(chǎn)物中只出現(xiàn)母本的共顯性分子標記之一，表明在該分子標記相關(guān)位點未發(fā)生同源重組；如果三倍體擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)了母本的全部遺傳信息，表明待鑒定母本植物在該分子標記相關(guān)位點發(fā)生了同源重組并形成異源雙鏈DNA。本發(fā)明方法對于植物遺傳分析、分子標記技術(shù)方法判別以及指導三倍體育種等具有重要的理論和應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GKCN102392074 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110363048
公開日2013年4月10日 申請日期2011年11月16日
發(fā)明者康向陽, 董春波, 索玉靜, 王君, 張平冬 申請人:北京林業(yè)大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan