專利名稱:核酸探針以及檢測(cè)瘧原蟲寄生蟲的方法
核酸探針以及檢測(cè)瘧原蟲寄生蟲的方法
發(fā)明的背景技術(shù)：
瘧原蟲是一種寄生性原生動(dòng)物屬。已知被這種屬感染會(huì)形成瘧疾。在寄生蟲的生命周期中始終存在著兩個(gè)宿主蚊子帶菌者以及脊椎動(dòng)物宿主。至少有十個(gè)種類會(huì)感染人類，其包括惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P.malariae)，以及卵形瘧原蟲(P. ovale)。瘧疾是一種傳染性疾病，其普遍存在于熱帶地區(qū)以及亞熱帶地區(qū)。瘧疾對(duì)于男人、女人以及兒童的生存而言象征著一種威脅。它每年感染300百萬至500百萬人，并且每年導(dǎo)致1百萬至3百萬人的死亡，這些大部分都發(fā)生在撒哈拉以南的非洲地區(qū)的兒童中。
瘧疾是最常見的傳染性疾病中的一種，并且是一種極大的公共衛(wèi)生問題。上述疾病是由瘧原蟲屬的原生動(dòng)物寄生蟲引發(fā)的。上述疾病中最嚴(yán)重的類型是由惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)以及間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)所引發(fā)的，但是其他相關(guān)的種類(卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)以及三日瘧原蟲(Plasmodium malariae))同樣能夠感染人類。確定上述的感染性種類能夠幫助確定所述患者的治療方案。
瘧疾的優(yōu)選并且最可靠的診斷方法是對(duì)血膜進(jìn)行顯微鏡檢驗(yàn)，因?yàn)樯鲜鏊姆N主要的寄生蟲種類中的每一種都具有不同的特性。傳統(tǒng)使用到的是兩類血膜。薄膜類似于常規(guī)的血膜，并且能夠進(jìn)行種類的識(shí)別，因?yàn)樵谶@種方法中所述寄生蟲的外觀能得以最好的保存。厚膜使得顯微鏡操作人員能夠篩選出更大量的血液，并且其敏感性比上述薄膜的敏感性高出大約十一倍，因此在所述厚膜上識(shí)別低水平的感染比在薄膜上識(shí)別更加容易，但是所述寄生蟲的外觀則被扭曲的多，并且因此在區(qū)別不同的種類上存在更大的困難。
從上述厚膜中，有經(jīng)驗(yàn)的顯微鏡操作人員能夠檢測(cè)到的寄生蟲的水平(或者寄生蟲血癥)下降到低至紅血球的0.0000001%。然而，顯微鏡診斷可能存在困難，因?yàn)樗兴膫€(gè)種類的早期營養(yǎng)體(“環(huán)形體”)看起來是相同的并且根本不可能基于單個(gè)的環(huán)形體來診斷其種類；種類的識(shí)別始終要以幾種營養(yǎng)體為基礎(chǔ)來進(jìn)行的。
在無法利用顯微鏡方法的情況下，利用抗原檢測(cè)試驗(yàn)，該方法僅需要一滴血液。OptiMAL-IT (TCS Bio Sciences，白金漢郡，英格蘭)將可靠的檢測(cè)到下至0. 01 %寄生蟲血癥水平的惡性瘧原蟲(falciparum)以及下至0. 1 %水平的非惡性瘧原蟲。Paracheck-Pf(Orchard Biomedical Systems,印度)將檢測(cè)到下降至0. 002%水平的寄生蟲血癥，但其不能夠區(qū)分惡性瘧原蟲瘧疾以及非惡性瘧原蟲瘧疾。也可以利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)寄生蟲的核酸進(jìn)行檢測(cè)。這項(xiàng)技術(shù)比顯微鏡方法更加準(zhǔn)確。然而，這項(xiàng)技術(shù)昂貴并且需要專門的實(shí)驗(yàn)室。并且，寄生蟲血癥的水平并不必然與所述疾病的程度相互關(guān)聯(lián)，特別是在當(dāng)所述寄生蟲能夠粘附于血管壁的情況時(shí)。在一些臨床實(shí)驗(yàn)室以及快速實(shí)時(shí)檢測(cè)中可以利用的分子方法是有限的，例如，QT_NASBA(基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的實(shí)時(shí)定量核酸序列依賴性擴(kuò)增)，但其目前需要進(jìn)行改進(jìn)。因此，為了在上述領(lǐng)域檢測(cè)低水平的寄生蟲血癥，需要研制敏感的、低科技的診斷工具。
我們所需要的是能夠快速并且準(zhǔn)確的檢測(cè)到并辨別出引起瘧疾的各種瘧原蟲種類的試劑以及方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及能夠在例如雜交檢測(cè)中檢測(cè)到并且辨別出不同種類的瘧原蟲寄生蟲的核酸探針。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于用作探針的核酸片段，用于在雜交檢測(cè)中檢測(cè)瘧原蟲。本發(fā)明還包括能夠辨別出惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)以及卵形瘧原蟲(P. ovale)的探針(DNA, RNA以及PNA) 0在本發(fā)明的內(nèi)容中，所述術(shù)語“辨別”(或者類似的術(shù)語)指的是所述探針與來自于一個(gè)種類的核酸(例如，RNA，DNA，rRNA[核糖體RNA]或者rDNA[核糖體DNA])的結(jié)合比其他三個(gè)種類的結(jié)合更加順利。
本發(fā)明的探針能夠檢測(cè)樣品中特定種類的瘧原蟲同時(shí)不與其他種類的瘧原蟲發(fā)生任意顯著程度的交叉反應(yīng)。在這一點(diǎn)上，在檢測(cè)不同的瘧原蟲種類時(shí)，本發(fā)明探針之間發(fā)生的交叉反應(yīng)小于大約20%、小于大約15%、小于大約10%、小于大約5%或者小于大約
2 % ο
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于一種核酸片段，所述的核酸片段含有一個(gè)序列，所述序列選自指定的SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :4中的一個(gè)或者一個(gè)以上序列中至少5個(gè)連續(xù)的核苷酸、優(yōu)選的，至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸、更優(yōu)選地，至少十三個(gè)連續(xù)的核苷酸，或者最優(yōu)選的，至少十五個(gè)連續(xù)的核苷酸，或者整個(gè)序列，或者是這些序列的部分或者完整長度的互補(bǔ)序列。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于在樣本中檢測(cè)瘧原蟲的存在的方法。在這個(gè)方法中，將樣本與一個(gè)核酸片段進(jìn)行接觸，所述的核酸片段含有一個(gè)序列，所述的序列選自PVl, PF4，PMl或者POl中的優(yōu)選至少5個(gè)連續(xù)的核苷酸、至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸、更加優(yōu)選至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸或者最優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸或者全部序列，探針選自或者是上述序列(或者上述序列的任意組合)的部分或者完整長度的互補(bǔ)序列；上述的接觸是在允許所述核酸片段與瘧原蟲核酸發(fā)生雜交的條件下進(jìn)行的。對(duì)與所述樣本中的瘧原蟲核酸發(fā)生結(jié)合的所述核酸片段進(jìn)行檢測(cè)，用來指示所述樣本中瘧原蟲的存在。對(duì)本發(fā)明所述的能夠?qū)ι鲜隽谐龅乃膫€(gè)種類的瘧原蟲進(jìn)行辨別的探針進(jìn)行的檢測(cè)，能夠指示這些瘧原蟲種類的存在。
在具體的方面，本發(fā)明預(yù)期了一種檢測(cè)樣本中瘧原蟲的存在的方法，所述方法包括如下步驟將所述樣本與一種探針進(jìn)行接觸，所述探針用于在雜交檢測(cè)中檢測(cè)瘧原蟲，其中所述的探針能夠辨別瘧原蟲的種類，在允許所述探針與瘧原蟲核酸發(fā)生雜交的條件下進(jìn)行接觸；并且對(duì)與所述樣本中的所述瘧原蟲核酸發(fā)生結(jié)合的所述探針進(jìn)行檢測(cè)，用來指示所述樣本中瘧原蟲的存在。
在前述的實(shí)施方式中，所述的核酸片段包括一種序列，所述的序列選自探針PV1，PF4，PMl或者POl中的至少5個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，或者是上述序列的完整長度的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明還預(yù)期了一種核酸片段，所述的核酸片段包括一個(gè)序列，所述的序列選自由PV1，PF4，PMl或者POl所組成的組中的探針中至少十(10)個(gè)連續(xù)的核苷酸、至少十三(13)個(gè)連續(xù)的核苷酸、至少十五(1 個(gè)連續(xù)的核苷酸，或者是上述序列的完整長度的互補(bǔ)序列。[0015]本發(fā)明還預(yù)期了一種核酸片段，所述的核酸片段包括一個(gè)序列，所述的序列選自由PV1，PF4，PMl或者POl所組成的組中的探針的完整序列，或者是上述序列的完整長度的互補(bǔ)序列。
在具體的方面，本發(fā)明預(yù)期了一種篩選核酸探針的方法，所述的核酸探針能夠辨別出下述種類惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P.malariae)以及卵形瘧原蟲(P. ovale)，上述方法包括制備一個(gè)核酸片段或者多肽核酸PNA，使其對(duì)應(yīng)于或者互補(bǔ)于一種序列，所述的序列具有來自于惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)，以及卵形瘧原蟲(P. ovale)的核酸中的至少5個(gè)核苷酸；對(duì)比所述探針在雜交檢測(cè)中檢測(cè)一種或者多種上述瘧原蟲種類的能力；并且選擇那個(gè)或者那些能夠檢測(cè)到一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)瘧原蟲種類而不是檢測(cè)到全部四個(gè)瘧原蟲種類的探針。
本發(fā)明還預(yù)期了一種檢測(cè)并且區(qū)分存在于樣本中的惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)，以及卵形瘧原蟲(P. ovale)的方法，所述方法包括提供i)來自于(例如)被懷疑患有瘧疾的宿主的樣本，以及ii)包括核酸的探針，其中所述的核酸適于用來檢測(cè)并且區(qū)分惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)，以及卵形瘧原蟲(P. ovale)；在適于使所述探針與目標(biāo)發(fā)生雜交的條件下，將所述樣本與所述探針進(jìn)行接觸；并且確定在所述樣本中惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)，以及卵形瘧原蟲(P. ovale)是否存在。
在前述的任意一個(gè)實(shí)施方式中，所使用到的探針可以是本發(fā)明所公開的完整的核苷酸序列或者是該序列的互補(bǔ)鏈，也可以是所述探針中的至少5個(gè)、至少10個(gè)或者至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的互補(bǔ)序列。
發(fā)明的具體實(shí)施方式
本發(fā)明的特征在于用于在例如雜交檢測(cè)中檢測(cè)瘧原蟲寄生蟲(例如，惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)，以及卵形瘧原蟲(P. ovale))的核酸探針。本發(fā)明所述的探針可以被用于在生物樣本中檢測(cè)瘧原蟲的存在的方法中。在這類方法中，在雜交檢測(cè)中將本發(fā)明所述的探針與一種生物樣本或者組織樣本(例如，全血，腦脊液(CSF))進(jìn)行接觸，并且對(duì)與所述樣本中的所述核酸發(fā)生結(jié)合的所述探針進(jìn)行檢測(cè)，用來指示所述樣本中瘧原蟲的存在。
本發(fā)明中所包括的探針可以通過下述方法進(jìn)行識(shí)別
A⑴制備一種核酸片段(DNA，RNA)或者多肽核酸(PNA)(即，探針)，使其對(duì)應(yīng)于或者互補(bǔ)于一種序列，所述的序列是來自于惡性瘧原蟲(P. falciparum)的核酸中的至少5個(gè)核苷酸、至少10個(gè)核苷酸；至少13個(gè)核苷酸或者至少15個(gè)核苷酸，并且(2)對(duì)比所述探針在雜交檢測(cè)中檢測(cè)所有瘧原蟲種類的能力。與其他三個(gè)種類相比，與惡性瘧原蟲(P. falciparum)更順利的進(jìn)行雜交的探針被包括在本發(fā)明之內(nèi)。
B(I)制備一個(gè)核酸片段(DNA，RNA)或者多肽核酸(PNA)(即，探針)，使其對(duì)應(yīng)于或者互補(bǔ)于一種序列，所述的序列是來自于間日瘧原蟲(P. vivax)的核酸中的至少5個(gè)核苷酸、至少10個(gè)核苷酸、至少13個(gè)核苷酸或者至少15個(gè)核苷酸，并且(2)對(duì)比所述探針在雜交檢測(cè)中檢測(cè)所有瘧原蟲種類的能力。與其他三個(gè)種類相比，與間日瘧原蟲(P. vivax)更順利的進(jìn)行雜交的探針被包括在本發(fā)明之內(nèi)。
C(I)制備一個(gè)核酸片段(DNA，RNA)或者多肽核酸(PNA)(即，探針)，使其對(duì)應(yīng)于或者互補(bǔ)于一個(gè)序列，所述的序列是來自于三日瘧原蟲(P.malariae)的核酸中的至少5個(gè)核苷酸、至少10個(gè)核苷酸、至少13個(gè)核苷酸或者至少15個(gè)核苷酸；并且(2)對(duì)比所述探針在雜交檢測(cè)中檢測(cè)所有瘧原蟲種類的能力。與其他三個(gè)種類相比，與三日瘧原蟲(P. malariae)更順利的進(jìn)行雜交的探針被包括在本發(fā)明之內(nèi)。
D(I)制備一個(gè)核酸片段(DNA，RNA)或者多肽核酸(PNA)(即，探針)，使其對(duì)應(yīng)于或者互補(bǔ)于一種序列，所述的序列是來自于卵形瘧原蟲(P. ovale)的核酸中的至少5個(gè)核苷酸、至少10個(gè)核苷酸、至少13個(gè)核苷酸或者至少15個(gè)核苷酸；并且(2)對(duì)比所述探針在雜交檢測(cè)中檢測(cè)所有瘧原蟲種類的能力。與其他三個(gè)種類相比，與卵形瘧原蟲(P. ovale)更順利的進(jìn)行雜交的探針被包括在本發(fā)明之內(nèi)。
惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)，以及卵形瘧原蟲(P.ovale)核酸可以通過來自于被感染的個(gè)體的生物樣本(例如全血，骨髓，腦脊液(CFS))而獲得，其中利用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的核酸分離方法獲得。惡性瘧原蟲(P. falciparum)(以及間日瘧原蟲(P. vivax)，三日瘧原蟲(P. malariae)和卵形瘧原蟲(P. ovale))還可以通過培養(yǎng)獲得。例如，DNA編碼的瘧原蟲核糖體RNA可以通過對(duì)DNA進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增來獲得，其中所述的DNA是從被感染患者的全血樣本中制備得到的，利用這里所描述的以及本領(lǐng)域已知的方法和引物。
可以選擇任意的瘧原蟲序列(例如，編碼58、5. 8SU8S或者^S核糖體RNA的序列)作為候選序列用于進(jìn)行探針的識(shí)別。優(yōu)選的序列是那些與非人類瘧原蟲或者其他原生動(dòng)物寄生蟲中的類似序列存在差異的序列，所述的其他原生動(dòng)物寄生蟲像是例如巴貝西蟲(Babesia)或者牛泰勒原蟲(Thileria)，所述的差異是由系統(tǒng)發(fā)育比較來確定的。本發(fā)明所述的核酸探針具有至少10個(gè)核苷酸的長度并且可以含有脫氧核糖核苷酸(DNA探針)，核糖核苷酸(RNA探針)，肽核酸(PNA探針)或者上述物質(zhì)的組合或者修飾。所述的探針可以是單鏈的或者是雙鏈的，并且可以通過本領(lǐng)域的各種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何一種進(jìn)行制備。例如，所述的探針可以通過下述方法來制備化學(xué)合成，載體(例如，含有與所述探針相應(yīng)的序列的質(zhì)粒)的限制性內(nèi)切核酸酶消化反應(yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，或者含有與所述探針相應(yīng)的序列的載體的體外轉(zhuǎn)錄(參見，例如，Ausubel等人于1994年的CurrentProtocols in Molecular Biology《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，Greene出版社，紐約N. Y.，在此引入作為參考)。所述的探針可以在合成的過程中或者合成之后進(jìn)行標(biāo)記。例如，可以在合成的過程中向所述探針中插入含有例如放射性同位素(例如，p32，S35，或者H3)、生物素或者地高辛配基的被標(biāo)記的核苷酸。使用例如卵白素或者鏈霉親和素的二級(jí)試劑檢測(cè)含有生物素的探針，所述的二級(jí)抗體含有一種可檢測(cè)到的標(biāo)記，例如熒光染料(例如，熒光素或者若丹明)或者酶(例如，堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶)。類似的，含有地高辛配基的探針可以通過使用被標(biāo)記的抗地高辛配基抗體來檢測(cè)。探針還可以在合成之后進(jìn)行標(biāo)記，通過例如切口平移或者利用T4 RNA連接酶，多聚腺苷酸聚合酶，末端轉(zhuǎn)移酶或者T4多核苷酸激酶用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行標(biāo)記(參見，例如Ausubel等人的如上所述的著作)。為了增強(qiáng)所述探針的穩(wěn)定性，所述的探針還可以含有被修飾的核苷酸。例如，可以使用在核糖基團(tuán)中含有2’-0_烷基基團(tuán)的核糖核苷酸。所述的探針還可以含有能夠促進(jìn)所述探針在固體支持物上進(jìn)行捕獲的修飾。例如，為了促進(jìn)探針與一種固體支持物進(jìn)行結(jié)合，可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在所述探針的3’末端加入聚-dA或者聚-脫氮-鳥苷尾巴，其中所述的固體支持物是例如由聚-dT或者聚-dC標(biāo)記的磁性粒子。所述的探針可以在使用之前通過標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行純化，所述的標(biāo)準(zhǔn)方法是例如改性聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效液相色譜或者凝膠過濾色譜(參見，例如，Ausubel等人的如上所述的著作)。本發(fā)明所述的探針可以被用于任何標(biāo)準(zhǔn)的雜交檢測(cè)當(dāng)中，用以檢測(cè)樣本中瘧原蟲的存在。例如，可以使用的方法有=Southern印跡，斑點(diǎn)印跡，原位雜交，由生物傳感器或者雙重探針檢測(cè)的實(shí)時(shí)雜交，夾心雜交檢測(cè)(參見，例如，美國專利申請(qǐng)第07/擬6657號(hào)[現(xiàn)在是美國專利第5519127號(hào)]以及美國專利第56四156號(hào)[國際公開號(hào)WO 94/10335]，上述全部內(nèi)容在此引入作為參考)?；蛘?，所述的探針可以在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)中作為引物(參見，例如，Ausubel等人的如上所述的著作)?？梢岳帽景l(fā)明所述的探針以及方法進(jìn)行分析的生物樣本包括全血，腦脊液(CSF)，骨髓以及例如來自于脾臟的組織樣本。利用標(biāo)準(zhǔn)方法(除了在原位雜交的情形中，在該情形中所述細(xì)胞是保持完整的)從上述樣本中分離出核酸并且利用在上述列出的檢測(cè)中所使用的所述探針進(jìn)行分析。在所述檢測(cè)中可以使用單個(gè)的探針或者這些探針的組合。利用這類探針進(jìn)行的雜交反應(yīng)的條件(例如，在本發(fā)明所述的方法中)落入如下的范圍之內(nèi)，例如，在25°C至42°C下的30-50%的甲酰胺，或者在大約25-37°C下的異硫氰酸胍(GuSCN)與甲酰胺的混合物。正如“本領(lǐng)域技術(shù)人員所知”，對(duì)于雜交條件的選擇取決于所使用的探針的長度以及核苷酸的含量(即，GC以及AT的相對(duì)量)。因此，可以依照這些因素對(duì)雜交條件進(jìn)行調(diào)整。除此之外，使用不同的鹽類(例如，與氯化鈉相對(duì)比的異硫氰酸胍或者鹽酸胍)以及改性試劑(例如，NP-40，十二烷基硫酸鈉)時(shí)可能需要調(diào)整所述的鹽濃度以及所述的溫度，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易確定的。
本發(fā)明可以使用的雜交條件的非限制性例子如下。在Southern印跡分析中，可以使用如下的雜交條件在大約42°C下，存在于h SSC中的30%-50%的甲酰胺。雜交反應(yīng)之后，利用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)所述的過濾器進(jìn)行洗滌。例如，在大約25°C下，在h SSC至0. Ix SSC中和0.1%的十二烷基硫酸鈉(SDQ中進(jìn)行三次15分鐘的雜交后洗滌，用以除去未結(jié)合的探針。在RNA印跡雜交中，在室溫下利用30%的甲酰胺反應(yīng)過夜。通過在h SSC中利用0. 的十二烷基硫酸鈉(SDQ進(jìn)行三次15分鐘的洗滌來除去過量的探針。
所述的術(shù)語“雜交反應(yīng)”指的是互補(bǔ)核酸的配對(duì)。雜交反應(yīng)以及所述雜交反應(yīng)的強(qiáng)度(即，在所述核酸之間發(fā)生結(jié)合的強(qiáng)度)受到下列因素的影響所述核酸之間的互補(bǔ)程度，相關(guān)的條件的嚴(yán)格性，所形成的雜交的Tm值，以及在所述核酸中的G-C比例。在單個(gè)分子的結(jié)構(gòu)中含有的互補(bǔ)核酸的配對(duì)被稱為“自體雜交”。
已經(jīng)熟知的是，可以利用眾多的等價(jià)條件來構(gòu)成適當(dāng)?shù)碾s交條件；考慮的因素是例如所述探針的長度以及性質(zhì)(DNA，RNA，堿基組合物)以及所述目標(biāo)的性質(zhì)(DNA，RNA，堿基組合物，存在于溶液中或者是被固定的，等等)以及所述鹽的濃度以及其他組分(例如，是否存在甲酰胺，硫酸葡聚糖，聚乙二醇)，并且所述的雜交溶液可以是多種多樣的，以形成不同于但是等價(jià)于上述列出的條件的低度嚴(yán)格的雜交條件。除此之外，本領(lǐng)域已知在高度嚴(yán)格的條件下促進(jìn)雜交反應(yīng)的條件(例如，增加雜交的溫度和/或洗滌步驟，在所述雜交溶液中使用甲酰胺，等等)。
對(duì)于原位雜交而言，可以使用如下所述的條件，如美國專利No. 6165723以及美國專利申請(qǐng)No. 11/494430(在此引入作為參考)中所描述的在室溫至37°C之間的異硫氰酸胍(1. 5至3. 5M，取決于所述探針的序列)，或者在室溫至37°C之間的甲酰胺與異硫氰酸胍混合物，30分鐘至1小時(shí)，隨后在SSC (2X至0. IX)以及0. 的十二烷基硫酸鈉(SDS)中進(jìn)行洗滌。
適用于本發(fā)明的熒光標(biāo)記物(染料)包括，但是不局限于，例如，Alexa 488，羅丹明、德州粉紅、熒光素、俄勒R綠、東京綠以及其他在本發(fā)明時(shí)已經(jīng)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的染料。
實(shí)施例
無需更加詳盡的細(xì)節(jié)，可以相信，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述，能夠?qū)⒈景l(fā)明利用到最完善的程度。因此，下面的具體實(shí)施方式
僅僅被解釋為描述性的，并不能以何種的形式構(gòu)成對(duì)所述公開的其余內(nèi)容的限制。
探針PF4、PVl、PMl和POl各自對(duì)惡性瘧原蟲(P. falciparum)，間日瘧原蟲(P. vivax)，卵形瘧原蟲(P. ovale)，以及三日瘧原蟲(P. malariae)樣品的雜交作用。
斑點(diǎn)印跡的分析數(shù)據(jù)在表1中有所表示。斑點(diǎn)印跡的方法和分析手段在本領(lǐng)域內(nèi)是己知的，參見，例如，Brown，T.，Dot and Slot Blotting DNA, Curr. Protoc, Mol. Biol.,2001五月；第2章單元2. 9B以及其中的參考文獻(xiàn)。在本實(shí)施例中，在每點(diǎn)使用大約0.1維克的包含編碼各個(gè)18S rRNA亞單位的核苷酸序列的血漿。在上面描述的雜交條件下使斑點(diǎn)與地高辛標(biāo)記的探針雜交。
在其他實(shí)施方案中，可以使用熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)本發(fā)明探針。熒光原位雜交(FISH)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，參見，Volpi，and Bridger, FISH glossary An overview of the fluorescence in situ Hydridization Technique,Biotechniques,2008 Oct ；45 (4) :385_6，388，390各處，以及其中的參考文獻(xiàn)。
在本實(shí)施例中，使用斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)。在利用RNA的情況中，對(duì)RNA進(jìn)行合成并且在硝酸纖維素膜上利用存在于6x SSC中的0.1微克的RNA形成斑點(diǎn)。在室溫下在甲酰胺中與所述的地高辛配基標(biāo)記的探針(dig-labeled probes)進(jìn)行雜交過夜。這種方法被用來在不同的生物體以及探針中對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行比較。
瘧原蟲種類18S rRNA特異性探針
本發(fā)明所述的瘧原蟲種類特異性探針包括具有選自PV1、PF4、PM1和POl或其完整長度互補(bǔ)序列的探針。
間日瘧原蟲(p. vivax)特異性探針
PVl 5，-AGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACGAAGTATC-3，[SEQ ID N0. 1]
惡性瘧原蟲(P. falciparum)特異性探針
PF4 5，-TTACAAAACCAAAAATTGGCCTTGCATTGTTATTT-3，[SEQ ID N0. 2]
三日瘧原蟲(P. malariae)特異性探針
PMl 5，-GAAACACTCATATATAAGAATGTCTC-3，[SEQ ID N0. 3]
卵形瘧原蟲(P. ovale)特異性探針
POl 5，-AATTTCCCCGAAAGGAATTTTC-3，[SEQ ID N0. 4]
表 1[0049]
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣本中間日瘧原蟲的存在的方法，所述方法包括如下步驟a)將所述樣本與一種探針進(jìn)行接觸，所述探針用于在雜交檢測(cè)中檢測(cè)間日瘧原蟲，其中所述的探針由SEQ ID NO. :1或其互補(bǔ)序列組成，在允許所述探針與間日瘧原蟲核酸發(fā)生雜交的條件下進(jìn)行接觸；并且b)對(duì)與所述樣本中的所述間日瘧原蟲核酸發(fā)生結(jié)合的探針進(jìn)行檢測(cè)，用來指示所述樣本中間日瘧原蟲的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的探針是一種序列，所述序列選自SEQIDNO 1的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的探針是一種序列，所述序列選自SEQIDNO 1的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的探針是一種序列，所述序列選自SEQIDNO 1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。
5.一種由SEQ ID NO 1的核苷酸序列組成的探針。
6.一種由SEQ ID NO 1的互補(bǔ)核苷酸序列組成的探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1、2、3、4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述檢測(cè)方法是熒光原位雜、-父。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1、2、3、4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述檢測(cè)方法是斑點(diǎn)印跡試
專利摘要
本發(fā)明涉及新的基于核酸的探針以及檢測(cè)生物樣品中瘧原蟲寄生蟲的方法，以及檢測(cè)不同種瘧原蟲寄生蟲的方法，這些不同種的瘧原蟲寄生蟲具有各自不同的選擇性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102597270SQ201080049463
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年10月28日
發(fā)明者D·若斯卡, H·威奧特曼, J·S·沙阿, N·哈里斯, O·馬克, S·斯謝爾尼-沃德 申請(qǐng)人:Id-菲什技術(shù)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan