專利名稱:用Δ133p53β檢驗(yàn)被認(rèn)為傾向于具有轉(zhuǎn)移性癌癥的受試者的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢驗(yàn)被認(rèn)為傾向于具有轉(zhuǎn)移性癌癥(優(yōu)選乳腺癌或結(jié)腸癌)的受試者的方法。
背景技術(shù)：
盡管已努力改善癌癥患者的治療和處理，對(duì)于多種癌癥類型而言，在過(guò)去二十年中癌癥患者的生存率并沒(méi)有改善。腫瘤發(fā)生期間的一個(gè)關(guān)鍵事件是原發(fā)性局部腫瘤轉(zhuǎn)化為侵襲性轉(zhuǎn)移腫瘤。多數(shù)具有轉(zhuǎn)移腫瘤的患者死于轉(zhuǎn)移腫瘤。新近檢測(cè)出的患者只有35%沒(méi)有轉(zhuǎn)移腫瘤。
侵襲過(guò)程是細(xì)胞形態(tài)改變的結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)改變開始于因上皮連接的破壞導(dǎo)致的粘附性喪失。然后，細(xì)胞通過(guò)重塑肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架獲得遷移能力，重塑細(xì)胞骨架中涉及小 GTP酶的他0家族。腫瘤細(xì)胞能應(yīng)用兩種模式的遷移需要整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的粘附動(dòng)力學(xué)及表面蛋白酶以降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的間充質(zhì)遷移或更有效地而無(wú)需ECM消化或整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的粘附但涉及RhoA/ROCK通路的阿米巴樣遷移(amoeboid migration)。腫瘤抑制劑p53 通過(guò)調(diào)節(jié)Mio GTP酶介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)防止癌癥進(jìn)行至侵襲階段。
最佳治療基于診斷和預(yù)后信息的組合。需要準(zhǔn)確而可重復(fù)的診斷性檢驗(yàn)以提供預(yù)后評(píng)估，其將提供關(guān)于生存的特定信息。
在乳腺癌中，普遍使用的預(yù)測(cè)原發(fā)性手術(shù)治療生存率的臨床和生物學(xué)變量有區(qū)域性淋巴結(jié)侵襲、組織學(xué)級(jí)別及激素受體表達(dá)。所有這些參數(shù)是已良好鑒定的預(yù)后和預(yù)測(cè)因
ο
然而，這些變量不能建立特定的及完整的生存率預(yù)后。實(shí)際上，在罹患同類型乳腺癌的患者中有重要的異質(zhì)性。
因此，存在提供另外的生物標(biāo)記的需要，該生物標(biāo)記能夠增強(qiáng)乳腺癌患者生存率的預(yù)測(cè)。[0008]生物標(biāo)記可用在生物學(xué)中區(qū)分正常醫(yī)學(xué)狀態(tài)和病理狀態(tài)，或評(píng)價(jià)病理進(jìn)展。允許癌癥早期檢測(cè)的技術(shù)得益于生物標(biāo)記，在癌癥搜索和臨床護(hù)理中是非常有益的。
腫瘤標(biāo)記的重要性在于建立、評(píng)估及驗(yàn)證人類腫瘤的分子分類，因而從診斷可以允許
-更好地評(píng)價(jià)癌癥的亞臨床(infraclinic)轉(zhuǎn)移潛力，從而避免存在低風(fēng)險(xiǎn)的患者的過(guò)度治療并從而允許分離存在進(jìn)化高風(fēng)險(xiǎn)的患者；
-從群體評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)換為個(gè)體評(píng)價(jià)，從而給以可能的個(gè)性化治療；
-指導(dǎo)存在進(jìn)化高風(fēng)險(xiǎn)并對(duì)常規(guī)治療不敏感或幾乎不敏感的患者進(jìn)行治療革新； 及
-允許評(píng)估可選的治療性分子的效果。
乳腺癌每年影響大約一百萬(wàn)人，代表婦女中最普遍的癌癥形式，影響著西方世界中處于一生某階段中的所有婦女的大約10%。男性也能發(fā)展乳腺癌，盡管他們的風(fēng)險(xiǎn)小于千分之一。
世界衛(wèi)生組織已計(jì)劃，在2010年前癌癥將成為世界范圍內(nèi)死亡的首要原因，處于心血管病之前。法國(guó)的最近發(fā)病率和死亡率數(shù)據(jù)顯示相同的進(jìn)化情況(Communication 2008 of Francim,the Institut de Veille Sanitaire,the Hospice Civils of Lyon and the Institut National du Cancer)。
在乳腺癌中，依照患者腫瘤的生物病理特征治療患者是重要的。因此目標(biāo)是提供可信的預(yù)測(cè)因素以選擇僅針對(duì)化療敏感(chimiosensive)患者的靶向化療 (chimiotherapy)及依照特定腫瘤生物標(biāo)記選擇特定藥物。因此，化療的效果依賴于細(xì)胞特征和敏感性生物標(biāo)記(如激素受體，UPA、PAIU Her2及拓?fù)洚悩?gòu)酶II α表達(dá))的存在。 腫瘤抑制劑Ρ53是在人類腫瘤中最常突變的基因。然而，影響ρ53基因的突變應(yīng)被仔細(xì)解釋，特別是因?yàn)樗念A(yù)測(cè)價(jià)值取決于乳腺癌類型。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明者現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制劑ρ53同種型的表達(dá)模式由異常剪切(印issage)引起， 與預(yù)后不佳相關(guān)。
換句話說(shuō)，發(fā)明者已鑒定了與轉(zhuǎn)移癌特異相關(guān)的標(biāo)記。因此，這些p53同種型允許將轉(zhuǎn)移癌與非轉(zhuǎn)移癌區(qū)分開。
本發(fā)明涉及一種檢驗(yàn)被認(rèn)為傾向于患有癌癥的受試者的方法，其包括步驟i)分析來(lái)自所述受試者的生物樣品來(lái)檢測(cè)選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型的存在，所述Ρ53同種型的存在是癌癥、優(yōu)選轉(zhuǎn)移性癌癥的指示物。
優(yōu)選地，所述方法是一種檢驗(yàn)被認(rèn)為傾向于患有轉(zhuǎn)移性癌癥的受試者的方法。
在一特定實(shí)施方案中，ρ53同種型的存在與確定ρ53同種型的表達(dá)水平相對(duì)應(yīng)。
能夠通過(guò)檢測(cè)ρ53同種型多肽或其片段、或通過(guò)檢測(cè)ρ53同種型mRNA或其片段評(píng)價(jià)P53同種型的存在。
此外，所述方法可以包括將檢測(cè)到的p53同種型的表達(dá)水平和閾值比較的又一步驟。所述閾值可以與陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照相對(duì)應(yīng)。
例如，陰性對(duì)照可以是患有非轉(zhuǎn)移癌癥受試者的p53同種型表達(dá)水平或健康受試者的P53同種型表達(dá)水平。
優(yōu)選地，高于陰性對(duì)照的表達(dá)水平指示轉(zhuǎn)移性癌癥。
例如，陽(yáng)性對(duì)照可以是患有轉(zhuǎn)移性癌癥受試者的p53同種型表達(dá)水平。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法是體外方法。
優(yōu)選地，所述癌癥是轉(zhuǎn)移性癌癥。
另一方面，本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定受試者中癌癥侵襲性的方法，其包括步驟i) 確定來(lái)自受試者的生物樣品中選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型的存在，所述Ρ53同種型的存在是侵襲性癌癥的指示物，優(yōu)選地，所述同種型是轉(zhuǎn)移性癌癥的指示物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種確定受試者對(duì)于抗癌治療的反應(yīng)的方法，所述受試者正在接受或已接受對(duì)于癌癥相關(guān)狀態(tài)的治療，其包括步驟[0031]i)確定來(lái)自受試者的生物樣品中的選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的 Ρ53同種型的表達(dá)水平，及
ii)將其與閾值相比較。
所述閾值可以與如上所定義的陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照相對(duì)應(yīng)，或與來(lái)自受試者的樣品中所測(cè)的、在所述受試者接受治療之前的表達(dá)水平相對(duì)應(yīng)。
優(yōu)選地，此方法包括確定受試者是否對(duì)于治療有反應(yīng)的又一步驟。
例如，當(dāng)所述p53同種型表達(dá)水平低于在所述受試者接受治療之前的來(lái)自受試者樣品中所測(cè)表達(dá)水平時(shí)，所述同種型的存在是受試者對(duì)于治療有反應(yīng)的指示物?；蛘撸?dāng)所述P53同種型表達(dá)水平等于或低于來(lái)自沒(méi)有癌癥的受試者的樣品中所測(cè)表達(dá)水平時(shí)，所述 P53同種型的存在是受試者對(duì)于治療有反應(yīng)的指示物。
本發(fā)明的上述方法能與其他癌癥診斷或預(yù)后方法組合使用。
在此所用的術(shù)語(yǔ)“p53同種型”指由剪接缺陷引起的、分別與具有序列SEQ ID 7的 p53多肽或與具有cDNA序列SEQ ID NO 8的p53mRNA不同的多肽或mRNA。本發(fā)明的p53 同種型選自 Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ 和 Δ 133ρ53 β。
優(yōu)選地，所述ρ53同種型為Δ 133ρ53 β。
優(yōu)選地，Δ 133ρ53 β多肽以序列SEQ ID :1為代表，而Δ 133ρ53 β mRNA具有cDNA 序列 SEQ ID NO :2。
優(yōu)選地，Δ 133ρ53多肽以序列SEQ ID 3為代表，而Δ 133p53mRNA具有cDNA序列 SEQ ID NO :4。
優(yōu)選地，Δ 133ρ53 γ多肽以序列SEQ ID 5為代表，而Δ 133p53ymRNA具有cDNA 序列 SEQ ID NO :6。
“癌癥”包括以失調(diào)或失控的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的惡性腫瘤。術(shù)語(yǔ)“癌癥”包括原發(fā)性惡性腫瘤(例如那些其細(xì)胞還未遷移到受試者體內(nèi)初始腫瘤位點(diǎn)以外的位點(diǎn)的腫瘤)和繼發(fā)性惡性腫瘤(例如那些由腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的，腫瘤細(xì)胞遷移到與初始腫瘤位點(diǎn)不同的第二位點(diǎn))O
在本發(fā)明方法中，此類癌癥優(yōu)先選自特別是人類受試者的乳腺癌、卵巢癌、消化道癌及喉癌，更優(yōu)選的是乳腺癌或結(jié)腸癌，而更優(yōu)選乳腺癌。
術(shù)語(yǔ)剪接過(guò)程由從前體信使RNA去除內(nèi)含子以產(chǎn)生能被細(xì)胞翻譯機(jī)制所使用的成熟信使RNA組成(SHARP，Cell, vol. 77，p. 805-815，1994)。在可選剪接的情況下，同一前體可作為編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)的信使RNA的來(lái)源(BLACK，Annu. Rev. Biochem. vol. 72，p.291-336,2003)。
“剪接缺陷”意思是能導(dǎo)致異常同種型形成的異常剪接過(guò)程。
在此所用的關(guān)于癌癥的術(shù)語(yǔ)“侵襲性” (agrressive)(或“侵襲性”(invasive))指腫瘤超越其邊界擴(kuò)張至鄰近組織的傾向性，或指腫瘤關(guān)于轉(zhuǎn)移的特征。侵襲性癌癥能夠與器官限定型癌癥對(duì)照。例如，皮膚基底細(xì)胞癌是非侵襲性的或最小侵襲性的腫瘤，局限于原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)并擴(kuò)張大小但不轉(zhuǎn)移。與之相反，黑色素瘤對(duì)于鄰近及遠(yuǎn)端組織是高度侵襲性的。腫瘤的侵襲性質(zhì)往往伴隨蛋白水解酶(如膠原酶)的作用，蛋白水解酶降解基質(zhì)材料和基底膜材料以使腫瘤得以擴(kuò)張超越被膜的限制及超越腫瘤所在特定組織的限制。
在此所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移”或“轉(zhuǎn)移的”指在患者體內(nèi)癌癥從初始器官向另外的遠(yuǎn)端位點(diǎn)傳播的情況。腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程是多階段事件，包括局部侵襲和細(xì)胞間基質(zhì)破壞、向血管、淋巴管或其他轉(zhuǎn)運(yùn)管道內(nèi)的內(nèi)滲、循環(huán)系統(tǒng)中的生存、從管道外滲至繼發(fā)位點(diǎn)及在新位置的生長(zhǎng)。
術(shù)語(yǔ)“受試者”包括哺乳動(dòng)物，例如人類、犬、奶牛、馬、袋鼠、豬、綿羊、山羊、貓、小
鼠、兔、大鼠及轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，優(yōu)選人類受試者，并更優(yōu)選女性。
術(shù)語(yǔ)“生物樣品”包括固體和體液樣品。本發(fā)明的生物樣品可能包括細(xì)胞、蛋白質(zhì)、 血液或生物液如骨髓、腹水液或腦液(例如腦脊液)。
固體生物樣品的例子包括取自糞便、直腸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨、乳腺組織、腎組織、 宮頸、子宮內(nèi)膜、頭/頸、膽囊、腮腺組織、前列腺、腦、垂體腺、腎組織、肌肉、食道、胃、小腸、 結(jié)腸、肝、脾、胰臟、甲狀腺組織、心臟組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、淋巴結(jié)組織、子宮、卵巢組織、腎上腺組織、睪丸組織、扁桃體及胸腺的樣品?！绑w液樣品”的例子包括取自血液、血清、精液、前列腺液、精液(seminal fluid)、尿液、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴和眼淚的樣品。 用于本發(fā)明的測(cè)定的樣品能以標(biāo)準(zhǔn)方法(包括靜脈穿刺和手術(shù)活檢)獲得。在一具體實(shí)施方案中，生物樣品是通過(guò)穿刺活檢獲得的乳腺組織樣品。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的方法的生物樣品選自骨髓、血清、血漿、 血液、淋巴或來(lái)自癌變或疑似癌變組織或其鄰近組織的細(xì)胞，優(yōu)選骨髓樣品。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)水平”或“水平”意指樣品中表達(dá)產(chǎn)物(例如多肽或mRNA)的濃度。
如下面更詳細(xì)地描述的，本發(fā)明的檢測(cè)方法能用于體外檢測(cè)生物樣品中的本發(fā)明 P53同種型的mRNA、本發(fā)明p53同種型多肽或其特定片段。例如，用于檢測(cè)所述p53同種型的mRNA的體外技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。用于檢測(cè)p53同種型及更具體地 Δ 133ρ53 β多肽的體外技術(shù)包括免疫組化、定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) ,Western 印跡、免疫沉淀及免疫熒光。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中p53同種型是 Δ 133ρ53β。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明所述的方法是基于檢測(cè)或定量ρ53同種型mRNA，還優(yōu)選所述mRNA的存在的確定包括又一步驟
擴(kuò)增所述p53同種型mRNA或cDNA、其互補(bǔ)序列或其具有至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段(該片段特異于所述P53同種型)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“mRNA”指成熟mRNA，即已經(jīng)進(jìn)行過(guò)剪接事件的mRNA。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“ cDNA，，應(yīng)指mRNA的DNA拷貝。
還優(yōu)選以PCR或RT-PCR反應(yīng)完成擴(kuò)增Δ 133ρ53 β mRNA或cDNA的步驟。
此檢測(cè)可通過(guò)自樣品分離mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)使用mRNA檢測(cè)時(shí)，方法可能通過(guò)下述步驟進(jìn)行根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將分離的mRNA轉(zhuǎn)換成cDNA ；在容器中以擴(kuò)增反應(yīng)試劑(如cDNA PCR反應(yīng)試劑)和核酸引物的適當(dāng)混合物一起處理轉(zhuǎn)換的cDNA ；容器的內(nèi)容物進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；及分析擴(kuò)增產(chǎn)物以檢測(cè)生物樣品中本發(fā)明P53同種型的特異核酸的存在。
優(yōu)選地，所述引物具有序列SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“引物”指無(wú)論是自然發(fā)生(如在純化的限制酶消化物中)還是合成生產(chǎn)的寡核苷酸，并且其在放置在適當(dāng)條件(即，有核苷酸和誘發(fā)劑如DNA聚合酶存在時(shí)，及在合適的溫度和PH)下時(shí)能夠起始互補(bǔ)于核酸的鏈的合成。引物可能是單鏈或雙鏈的，并且必須足夠長(zhǎng)以在誘發(fā)劑存在時(shí)啟動(dòng)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度取決于多種因素，包括溫度、引物的序列和/或同源性及所用方法。例如，在診斷應(yīng)用中，寡核苷酸引物通常包含10到25個(gè)或更多個(gè)核苷酸，取決于靶序列的復(fù)雜度，盡管引物可包含更少的核苷酸。
在此選擇引物“實(shí)質(zhì)上”互補(bǔ)于特定靶標(biāo)DNA序列。其意思是引物必須足夠互補(bǔ)以雜交于其分別的鏈。因此，引物序列不需要反映模板的精確序列。例如，非互補(bǔ)核苷酸片段 (即包含限制位點(diǎn)的)可被連接至引物的5’端，而引物序列的剩下部分互補(bǔ)于鏈。可選地， 非互補(bǔ)堿基或更長(zhǎng)的序列可以被穿插進(jìn)引物，只要引物序列與待雜交并形成用于合成延伸產(chǎn)物的模板的序列足夠互補(bǔ)。
“擴(kuò)增”指模板依賴性過(guò)程和載體介導(dǎo)的增殖，其導(dǎo)致特定核酸分子相對(duì)其最初濃度的濃度增加，或?qū)е驴蓹z測(cè)信號(hào)濃度的增加。在此使用的術(shù)語(yǔ)模板依賴性過(guò)程意指涉及引物分子模板依賴性延伸的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)模板依賴性過(guò)程指RNA或DNA分子的核酸合成，其中核酸新合成鏈的序列由廣為人知的互補(bǔ)堿基配對(duì)規(guī)則(見(jiàn)，例如，Watson，J.D.等，In =Molecular Biology of the Gene，第 4 版，W. A. Benjamin, Inc.，Menlo Park, Calif. (1987))決定。通常，載體介導(dǎo)的方法學(xué)包括引入核酸片段至DNA或RNA載體中，克隆擴(kuò)增該載體，并回收擴(kuò)增的核酸片段。 此類方法學(xué)的例子由 Maniatis T.等，Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. i^i"共。
多種模板依賴性過(guò)程可供擴(kuò)增樣品中存在的相關(guān)靶序列。熟知的擴(kuò)增方法之一是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其在Mullis等，美國(guó)專利號(hào)4，683，195、Mullis等，美國(guó)專利號(hào) 4，683，202 和 Mullis 等，美國(guó)專利號(hào) 4，800，159，和在 Innis 等，PCR Protocols, Academic Press, Inc.，San Diego Calif.，1990中有詳細(xì)描述。簡(jiǎn)單講，PCR中，制備兩條互補(bǔ)于靶序列的相反互補(bǔ)鏈區(qū)域的引物序列。將過(guò)量的脫氧核苷三磷酸連同DNA聚合酶(例如Taq 聚合酶)加入到反應(yīng)混合物中。如果靶序列在樣品中存在，引物會(huì)結(jié)合于靶標(biāo)，并且聚合酶會(huì)通過(guò)加上核苷酸導(dǎo)致引物沿著靶序列被延伸。通過(guò)提高和降低反應(yīng)混合物溫度，延伸的引物會(huì)從靶標(biāo)解離以形成反應(yīng)產(chǎn)物，過(guò)量引物會(huì)結(jié)合于靶標(biāo)和反應(yīng)產(chǎn)物并重復(fù)該過(guò)程。優(yōu)選地，可能進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增步驟以定量擴(kuò)增的mRNA量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。
依據(jù)本發(fā)明，可能使用在GB申請(qǐng)?zhí)? 202 328和PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US89/01025中公開的其他擴(kuò)增方法。在前一個(gè)申請(qǐng)中，在類PCR的模板和酶依賴性合成中使用了“修飾” 引物。可能通過(guò)以捕獲部分(例如生物素)和/或檢測(cè)部分(例如酶)進(jìn)行標(biāo)記來(lái)修飾引物。在后一個(gè)申請(qǐng)中，過(guò)量的標(biāo)記探針被加入到樣品。在靶序列存在時(shí)，探針結(jié)合并被催化切割。切割后，釋放的完整靶標(biāo)序列被過(guò)量探針結(jié)合。標(biāo)記探針的切割示意靶序列的存在。
擴(kuò)增后，可能檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在?？赡芤员绢I(lǐng)域所知的任何方法測(cè)序擴(kuò)增的產(chǎn)物。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中通過(guò)探針進(jìn)行選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型的存在的確定，該探針能特異雜交所述Ρ53同種型mRNA、其互補(bǔ)序列或其具有特異于所述ρ53同種型的至少10、15、20、25、 30、35、40、45、50或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段，優(yōu)選雜交人類Δ 133ρ53 β mRNA,并更優(yōu)選雜交具有序歹Ij SEQ ID NO 2 的 Δ 133ρ53 β mRNA。
有利的是，探針選自序列SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10或SEQ IDNO :11，優(yōu)選序列 SEQ ID NO :11。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中通過(guò)下面的方法進(jìn)行P53同種型mRNA、更優(yōu)選Δ 133ρ53 β mRNA的存在的確定，該方法包括步驟
(a)在雜交條件下，將生物檢驗(yàn)樣品接觸特異于選自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53 β的ρ53同種型的核酸探針，該樣品包括
-分離自人類受試者生物樣品的RNA分子，其中生物樣品疑似包含腫瘤細(xì)胞，或
-自分離的RNA分子合成的核酸分子如cDNA，
其中核酸探針具有包括p53同種型序列的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段、或其片段、 或其互補(bǔ)的核苷酸序列，及
(b)檢測(cè)核酸探針和檢驗(yàn)樣品的雜交物的形成，
其中雜交物的存在表明獲自人類受試者的組織中腫瘤細(xì)胞的存在。
基于本發(fā)明核酸分子序列的探針能被用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于選自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ 和Δ 133ρ53 β的ρ53同種型的mRNA的轉(zhuǎn)錄物。例如，核酸探針可以是全長(zhǎng)cDNA、或其片段 (如具有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下特異性雜交于本發(fā)明P53同種型mRNA的足夠長(zhǎng)度的寡核苷酸)。 mRNA與探針的雜交表明討論中的標(biāo)記正在被表達(dá)。在一具體實(shí)施方案中，探針包括連接其上的標(biāo)記基團(tuán)，例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。
一種方式是，mRNA固定于固體表面并與探針接觸，例如通過(guò)將分離的mRNA跑樣于瓊脂凝膠并將mRNA從凝膠轉(zhuǎn)移至(如硝酸纖維素)膜上。另一種方式是，固定探針于固體表面并用探針接觸mRNA，例如在Affymetrix基因芯片列陣中。技術(shù)人員能容易地調(diào)適已知的mRNA檢測(cè)方法以用于檢測(cè)由本發(fā)明標(biāo)記物編碼的mRNA的表達(dá)水平。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明所述的方法是基于檢測(cè)或定量p53同種型多肽表達(dá)水平時(shí)，還優(yōu)選以使用能特異識(shí)別所述P53同種型的抗體的免疫組化或免疫測(cè)定來(lái)確定所述p53同種型的存在。
在一具體實(shí)施方案中，通過(guò)用特異于選自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和Δ133ρ53β 的ρ53同種型或其片段的抗體接觸生物樣品并確定抗體與生物樣品的結(jié)合來(lái)進(jìn)行選自 Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ 133ρ53β的ρ53同種型的存在的確定。
“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性決定簇，即包含特異結(jié)合(免疫反應(yīng)于)抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)(表位)的分子。在H和L鏈的可變(V)決定簇中發(fā)現(xiàn)大量及多樣化的抗體的結(jié)合特異性。抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、整個(gè)免疫球蛋白和免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段。
通過(guò)分析自然產(chǎn)生的抗體片段定位包括抗體(即抗體的抗原結(jié)合功能)的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。因此，抗原結(jié)合片段也擬被指定為術(shù)語(yǔ)“抗體”。術(shù)語(yǔ)抗體所涵蓋的結(jié)合片段的例子包括由VL、VH、CL和Cm結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；由VH和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；及F(ab’)2 片段(其是包括在鉸鏈區(qū)以二硫鍵連接的兩個(gè)Fab’片段的二價(jià)片段)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)可得到這些抗體片段，并且以與完整抗體同樣的方式篩選片段的實(shí)用性。術(shù)語(yǔ)“抗體”還意在包括具有至少一個(gè)來(lái)源于抗體分子的抗原結(jié)合決定簇的雙特異性和嵌合分子。
在本發(fā)明的診斷和預(yù)后測(cè)定中，抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并優(yōu)選單克隆抗體。
優(yōu)選地，所述抗體被標(biāo)記。
通過(guò)酌情以多次皮下或腹腔內(nèi)注射免疫原(抗原)和佐劑免疫動(dòng)物(通常為哺乳動(dòng)物)生產(chǎn)多克隆抗體。作為說(shuō)明性實(shí)施方案，通常通過(guò)將大約Iyg到Img能引起免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)和增強(qiáng)載體制備物(如弗氏完全佐劑)或凝聚劑(如明礬)組合到一起并將該組合物皮下注射到多個(gè)位點(diǎn)而將動(dòng)物進(jìn)行針對(duì)蛋白質(zhì)、肽或衍生物的免疫。稍后，通過(guò)皮下注射至多個(gè)位點(diǎn)，以至少一次弗氏不完全佐劑(或其它合適佐劑)中的較低量(如起初量的1/5到1/10)免疫原的后續(xù)給藥來(lái)加強(qiáng)免疫動(dòng)物。隨后給動(dòng)物抽血，測(cè)定血清以確定特異性抗體滴度，并且再次加強(qiáng)免疫動(dòng)物并測(cè)定直至抗體滴度不再增加(即穩(wěn)定期)。
此種抗體分子群體稱為“多克隆”，因?yàn)樵撊后w包括大量抗體，其中每一個(gè)均特異于免疫原中發(fā)現(xiàn)的多個(gè)不同表位之一，并且其中每一個(gè)的特征均為對(duì)于那個(gè)表位的特異性親和性。表位是抗原性的最小決定因素，對(duì)于一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其可能包括六到八個(gè)殘基長(zhǎng)度的肽(Berzofsky J.禾口 1. Berkower (1993) in Paul, W.,編，F(xiàn)undamental Immunology, Raven Press, N. Y.，p. 246)。親和性范圍從低(例如I(T6M)到高(例如IO"11)。
通過(guò)熟知的技術(shù)(例如通過(guò)具有選擇性結(jié)合免疫球蛋白分子的親和基質(zhì)如蛋白A 的層析)分離收集自哺乳動(dòng)物血清的多克隆抗體部分以獲得IgG部分。為增強(qiáng)抗體的純度和特異性，還可以通過(guò)使用固相固定免疫原的免疫親和層析進(jìn)一步純化特異性抗體?？贵w與固相固定的免疫原接觸一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使得免疫原能免疫反應(yīng)于抗體分子而形成固相固定的免疫復(fù)合物。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如通過(guò)使用降低PH或增加離子強(qiáng)度的緩沖液) 自固相洗脫結(jié)合的抗體，測(cè)定洗脫部分，并合并那些包含特異性抗體的部分。
在此使用的“單克隆抗體”指單分子組合物的抗體分子制備物。單克隆抗體組合物顯示對(duì)于特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。能使用通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)中的細(xì)胞以生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)制備單克隆抗體。這些包括但不限于最初由Kohler和Milstein 所述的雜交瘤技術(shù)(1975，Nature, 256 :495-497 ；還見(jiàn) Brown 等，1981，J. Immunol.，127 539-46 ；Brown 等，1980，J. Biol. Chem.，255 :4980-83 ；Yeh 等，1976，PNAS 76 :2927-31 ；和 Yeh 等，1982，Int. J. Cancer, 29 :269-75)和更近的人 B 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor 等，1983， Immunol. Today 4 72) > EBV- 1 ^ ^ ^ ^ (Cole φ, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss,Inc. ,pp. 77-96)和三源雜交瘤技術(shù)。用于生產(chǎn)雜交瘤的技術(shù)眾所周知(一般見(jiàn)Current Protocols in Immunology,Coligan等編，John Wiley&Sons, New York, 1994) 0通過(guò)(例如使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定)篩選雜交瘤培養(yǎng)上清中的結(jié)合目標(biāo)多肽的抗體來(lái)檢測(cè)生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
能夠通過(guò)下列步驟生產(chǎn)單克隆抗體。在所有步驟中，如上面用于制備多克隆抗體所述，以抗原(如蛋白質(zhì)(或其肽))免疫動(dòng)物。通常通過(guò)以免疫有效劑量(即足夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)的量)將免疫原給藥至具有免疫能力的哺乳動(dòng)物來(lái)完成免疫。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物如兔、大鼠或小鼠。然后，于所述加強(qiáng)免疫日程維持哺乳動(dòng)物一段足夠的時(shí)期， 以使哺乳動(dòng)物生成高親和性抗體分子。在生成高親和性抗體的一段足夠時(shí)間之后，處死動(dòng)物(如小鼠)并從淋巴結(jié)、脾臟和外周血的一個(gè)或多個(gè)獲得生產(chǎn)抗體的淋巴細(xì)胞。優(yōu)選脾細(xì)胞，并且能夠用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法在生理培養(yǎng)基中將脾細(xì)胞機(jī)械分離為單個(gè)的細(xì)胞。通過(guò)融合于小鼠骨髓瘤系細(xì)胞永生化生產(chǎn)抗體的細(xì)胞。
小鼠淋巴細(xì)胞給出了高百分比的與小鼠同源骨髓瘤的穩(wěn)定融合，然而也能使用大鼠、兔和蛙體細(xì)胞。一般在融合劑如聚乙二醇存在下，通過(guò)融合于骨髓瘤細(xì)胞永生化生產(chǎn)所需抗體的動(dòng)物的脾細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，能夠使用適于做融合配偶體的若干骨髓瘤細(xì)胞系的任意一個(gè)，例如，P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8. 653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤系，可從美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)，羅克維爾，馬里蘭州獲得。
在被設(shè)計(jì)用于消除未融合親本骨髓瘤或淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)基(如 HAT培養(yǎng)基)中培養(yǎng)包括所需雜交瘤的融合產(chǎn)物細(xì)胞。選擇雜交瘤細(xì)胞并在限制稀釋條件下使其生長(zhǎng)以獲得分離的克隆。例如，通過(guò)用以確定所需抗原如用于免疫的抗原的免疫測(cè)定技術(shù)，篩選每個(gè)克隆雜交瘤的上清中所需特異性和親和性抗體的生產(chǎn)。通過(guò)傳統(tǒng)方法 (如硫酸銨沉淀、離子交換層析和親和層析)從生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離單克隆抗體(Zola 等，Monoclonal Hybridoma Antibodies :Techniques And Applications, Hurell (編)， pp. 51-52，CRC Press,1982)。
能使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)在體外或體內(nèi)(在腹水液中)培養(yǎng)中繁殖根據(jù)這些方法生產(chǎn)的雜交瘤。
替代制備分泌單克隆抗體的雜交瘤，能夠通過(guò)用目標(biāo)多肽篩選重組的組合免疫球蛋白庫(kù)(例如抗體噬菌體展示庫(kù))來(lái)鑒定和分離針對(duì)本發(fā)明多肽的單克隆抗體。用于生成和篩選噬菌體展示庫(kù)的試劑盒是市場(chǎng)上可買到的(例如法瑪西亞重組噬菌體抗體系統(tǒng)， 目錄號(hào)27-9400-01 ；及Mratagene SutfZ4P噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)M0612)。此外， 能夠在例如美國(guó)專利號(hào)5，223，409 ;PCT公開號(hào)WO 92/18619 ;PCT公開號(hào)WO 91/17271 ； PCT 公開號(hào) WO 92/20791 ;PCT 公開號(hào) WO 92/15679 ;PCT 公開號(hào) WO 93/01288 ;PCT 公開號(hào) W092/01047 ；PCT 公開號(hào) WO 92/09690 ；PCT 公開號(hào) WO 90/02809 ；Fuchs 等(1991)Bio/ Technology 9 :1370-1372 ；Hay 等(1992)Hum. Antibod. Hybridomas,3 :81-85 ；Huse 等 (1989) Science 246 :1275-1281 ；Griffiths 等(1993) EMBO J. ,12 :725-734.中找到特別經(jīng)得起考驗(yàn)的適用于生成和篩選抗體展示庫(kù)的方法和試劑的例子。
此外，包括人類和非人類部分的重組抗體(如嵌合和人源化單克隆抗體)，其能夠用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制得，落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)(例如使用在PCT公開號(hào)WO 87/02671 ；歐洲專利申請(qǐng)0 184 187;歐洲專利申請(qǐng)0 171 496 ；歐洲專利申請(qǐng)0 173 494;PCT公開號(hào)W086/01533;美國(guó)專利號(hào)4，816，567;歐洲專利申請(qǐng)0 125 023 ；Better等(1988)中公開的方法)能夠生產(chǎn)此類嵌合和人源化單克隆抗體。在此使用的“標(biāo)記抗體”包括以可檢測(cè)的手段標(biāo)記的抗體，并包括以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種不同方法的任意方法酶法地、放射性地、熒光地、化學(xué)發(fā)光地和/或生物發(fā)光地標(biāo)記的抗體。
能夠可檢測(cè)地標(biāo)記抗體的方式之一是通過(guò)將抗體連接于酶。此酶(當(dāng)之后暴露于其底物時(shí))反過(guò)來(lái)會(huì)以產(chǎn)生能被檢測(cè)的(例如通過(guò)分光光度法、熒光儀或目測(cè)方法)化學(xué)部分的方式與底物反應(yīng)。能被用于可檢測(cè)地標(biāo)記P53同種型特異性抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、金黃色葡萄球菌核酸酶、△-V-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天門冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、 B-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡萄糖糖化酶和乙酰膽堿酯酶。
可以用多種免疫測(cè)定的任意一種實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。例如，通過(guò)放射性標(biāo)記抗體，可能通過(guò)使用放射性免疫測(cè)定檢測(cè)該抗體。在Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,由 Work T. S.等編，North Holland Publishing Company，NY(1978)、
Chard T. )^111^ "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques”的一章，可以找到放射性免疫測(cè)定(RIA)的描述。通過(guò)如使用Y計(jì)數(shù)儀或閃爍計(jì)數(shù)儀或通過(guò)放射性自顯影的方法能夠檢測(cè)放射性同位素。能特別用于本發(fā)明的目的的同位素有3H、131I、35S、14C，并優(yōu)選 125I0
還可能以熒光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記抗體暴露于合適波長(zhǎng)的光下時(shí)，因?yàn)闊晒獾拇嬖趶亩軝z測(cè)它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物之中有熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、異藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛(ophthaldehyde)和熒光胺。
通過(guò)使用熒光發(fā)射金屬如152Eu或其他鑭系金屬也能檢測(cè)性標(biāo)記抗體。這些金屬能夠通過(guò)使用如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬螯合基團(tuán)連接于抗體。
還能通過(guò)偶聯(lián)抗體于化學(xué)發(fā)光化合物來(lái)檢測(cè)性標(biāo)記抗體。然后通過(guò)檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)出的光的存在確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子有魯米那、熒光素、異魯米那、theromatic吖啶酯(theromatic acridinium ester)、 咪唑、吖啶鹽和草酸鹽酯。
同樣地，可能使用生物發(fā)光化合物標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是一類在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光，其中催化蛋白質(zhì)增加了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過(guò)檢測(cè)發(fā)光的存在確定生物發(fā)光蛋白質(zhì)的存在。用于標(biāo)記目的的重要的生物發(fā)光化合物有熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
在本發(fā)明的檢測(cè)測(cè)定中，抗體與生物樣品的結(jié)合量能通過(guò)標(biāo)記抗體所發(fā)出的信號(hào)強(qiáng)度和/或通過(guò)生物樣品中結(jié)合于標(biāo)記抗體的細(xì)胞數(shù)來(lái)確定。
生物樣品中選自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型的檢測(cè)或表達(dá)水平可通過(guò)放射性免疫測(cè)定、免疫放射分析和/或酶免疫測(cè)定來(lái)確定。
“放射性免疫測(cè)定”是使用標(biāo)記(即放射性標(biāo)記)形式的抗原(即Δ 133ρ53 β多肽)檢測(cè)和測(cè)定抗原濃度的技術(shù)。用于抗原的放射性標(biāo)記的例子包括3H、14c、和1251。生物樣品中P53同種型的濃度通過(guò)讓樣品中的抗原與標(biāo)記(即放射性的)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗原抗體的結(jié)合來(lái)測(cè)定。為保證標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，標(biāo)記抗原以足夠濃度存在以飽和抗體的結(jié)合位點(diǎn)。樣品中抗原濃度越高，將結(jié)合于抗體的標(biāo)記抗原的濃度將會(huì)越低。
在放射性免疫測(cè)定中，為確定結(jié)合于抗體的標(biāo)記抗原的濃度，抗原-抗體復(fù)合物必須從游離抗原分開。一個(gè)用于自游離抗原分開抗原-抗體復(fù)合物的方法是通過(guò)用抗同種型抗血清沉淀抗原-抗體復(fù)合物。另一用于自游離抗原分開抗原-抗體復(fù)合物的方法是通過(guò)用福爾馬林殺死的金黃色葡萄球菌沉淀抗原-抗體復(fù)合物。還有另一個(gè)用于自游離抗原分開抗原-抗體復(fù)合物的方法是通過(guò)進(jìn)行“固相放射性免疫測(cè)定”，其中抗體(即共價(jià)地) 連接于kpharose珠子、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微量滴定孔。通過(guò)與基于具已知濃度的抗原的樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線比較結(jié)合于抗體的標(biāo)記抗原的濃度，可以確定生物樣品中的抗原濃度。[0106]“免疫放射分析”(IRMA)是其中抗體試劑被放射性標(biāo)記的免疫測(cè)定。IRMA需要通過(guò)如偶聯(lián)于蛋白質(zhì)(如兔血清白蛋白(RSA))的技術(shù)生產(chǎn)多價(jià)抗原偶聯(lián)物。多價(jià)抗原偶聯(lián)物必須每個(gè)分子具有至少2個(gè)抗原殘基，并且抗原殘基必須有足夠的分開距離以允許至少兩個(gè)抗體結(jié)合于抗原。例如，在IRMA中多價(jià)抗原偶聯(lián)物可以被連接到如塑料球體的固體表面。
將未標(biāo)記“樣品”抗原和已被放射性標(biāo)記的抗原的抗體加入到包含多價(jià)抗原偶聯(lián)物包被的球體的試管中。樣品中的抗原與多價(jià)抗原偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)。在適當(dāng)?shù)姆跤诤?，通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物并確定固相上的放射性量。結(jié)合的放射性抗體的量與樣品中抗原濃度成反比。
最普遍的酶免疫測(cè)定是“酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) ”?！懊嘎?lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) ”是用于使用標(biāo)記(即酶連接)形式的抗體來(lái)檢測(cè)和測(cè)定抗原濃度的技術(shù)。
在“夾心ELISA”中，抗體(即抗-Δ133ρ53β肽)被連接于固相(即微量滴定板) 并暴露于含抗原(即Δ133ρ53β肽)的生物樣品。然后洗滌固相以去除未結(jié)合抗原。然后標(biāo)記的(即酶連接的)抗體結(jié)合于結(jié)合的抗原(如果存在的話)形成抗體-抗原-抗體夾心層。能被連接于抗體的酶的例子有堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、熒光素酶、尿素酶和 3-半乳糖苷酶。酶連接的抗體與底物反應(yīng)以生成能被分析的有色反應(yīng)產(chǎn)物。
在“競(jìng)爭(zhēng)性ELISA”中，抗體與包含抗原(即ρ53同種型肽)的樣品孵育。然后將抗原-抗體混合物接觸抗原包被的固相(即微量滴定板)。樣品中存在的抗原越多，可獲得的結(jié)合于固相的游離抗體越少。然后加入標(biāo)記(即酶連接)的二抗到固相以確定結(jié)合于固相的一抗的量。
在“免疫組化測(cè)定”中，通過(guò)暴露組織于特異于待測(cè)定蛋白質(zhì)的抗體，來(lái)檢驗(yàn)部分組織的特定蛋白質(zhì)。然后通過(guò)大量方法的任意一個(gè)可視化抗體以確定存在的蛋白質(zhì)的存在和量。用于可視化抗體的方法的例子例如通過(guò)連接于抗體的酶(如熒光素酶、堿性磷酸酶、 辣根過(guò)氧化物酶或P-半乳糖苷酶)或化學(xué)法(例如DAB/產(chǎn)色原底物)或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的多種不同方法的任意方法的金、熒光或標(biāo)記抗體。
另一方面，本發(fā)明涉及一種篩選潛在抗癌化合物并優(yōu)選抗轉(zhuǎn)移癌化合物的方法， 其包括步驟
a)可選地測(cè)定已知表達(dá)選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ 133ρ53β的ρ53同種型的細(xì)胞中所述Ρ53同種型的表達(dá)水平；
b)將待檢驗(yàn)化合物與所述細(xì)胞接觸；
c)通過(guò)上述檢測(cè)所述p53同種型的方法確定所述p53同種型的表達(dá)水平；及
d)如果p53同種型在細(xì)胞中未表達(dá)或具有低于步驟a)之前的表達(dá)水平，則選擇所述化合物作為潛在的抗癌化合物。可選地，所述篩選方法還可以包括步驟e)在細(xì)胞中、優(yōu)選在轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中檢驗(yàn)步驟d)中所選的化合物，以證實(shí)所選化合物的抗癌性質(zhì)、優(yōu)選抗轉(zhuǎn)移癌性質(zhì)。
例如，所述步驟e)能對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2006/134305中公開的方法，即一種方法，其包括步驟將在其細(xì)胞膜上不表達(dá)E-鈣黏著蛋白的腫瘤細(xì)胞與所選化合物接觸， 并確定細(xì)胞表面E-鈣黏著蛋白的存在，所述存在是抗轉(zhuǎn)移活性的指示物。
所述步驟e)還能對(duì)應(yīng)于SmithHW,Marra P,Marshall CJ. J Cell Biol. 2008 Aug25 ； 182 (4) :777-90中公開的方法，即在所選化合物存在時(shí)檢驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞向三維膠原基質(zhì)中侵襲的方法。
優(yōu)選地，待檢驗(yàn)化合物是反義RNA或干擾RNA (iRNA)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)特異識(shí)別選自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53β的ρ53同種型多肽的多克隆抗體的方法，其中此方法包括步驟
a)以免疫有效劑量的選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型多肽(或抗所述多肽的至少9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的特定表位片段，可選地具有增強(qiáng)載體制備物) 免疫哺乳動(dòng)物；
b)可選地，體外確定動(dòng)物血清或血漿中特異抗體的存在；及
c)自動(dòng)物血清或血漿純化或分離特異性抗-Δ 133ρ53、抗-Δ 133ρ53 γ或抗-Δ133ρ53β多肽的抗體。
本發(fā)明的一部分還涉及一種用于生產(chǎn)能分泌特異識(shí)別選自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ 和Δ133ρ53β多肽的ρ53同種型的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的方法，其中此方法包括步驟
a)以免疫有效劑量的選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型多肽(或抗所述多肽的至少9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的表位片段，可選地具有增強(qiáng)載體制備物)免疫哺乳動(dòng)物；
b)自哺乳動(dòng)物的脾、淋巴結(jié)或外周血分離生產(chǎn)抗p53同種型肽的抗體的淋巴細(xì)胞；及
c)通過(guò)融合所述淋巴細(xì)胞和同種哺乳動(dòng)物骨髓瘤系的細(xì)胞永生化生產(chǎn)抗-Δ133ρ53、抗-Δ133ρ53γ或抗-Δ133ρ53β多肽抗體的淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明的一部分還涉及一種用于生產(chǎn)特異識(shí)別選自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ133ρ53β多肽的ρ53同種型的單克隆抗體的方法，其中此方法包括步驟
a)根據(jù)本發(fā)明的上述方法，生產(chǎn)能分泌特異識(shí)別選自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53 β多肽的ρ53同種型的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；
b)在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)此雜交瘤細(xì)胞；
c)自此培養(yǎng)基純化或分離分泌的單克隆抗體。
在另一部分中，本發(fā)明包括以用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多克隆或單克隆抗體的方法獲得的多克隆或單克隆抗體，其中所述抗體特異識(shí)別選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和 Δ 133ρ53β的ρ53同種型。
另一方面，本發(fā)明涉及一個(gè)用于檢測(cè)或定量選自Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ 133ρ53 β mRNA或多肽的ρ53同種型的試劑盒，其中此試劑盒包括
a)根據(jù)本發(fā)明所述的多克隆或單克隆抗體；或
b)選自能夠擴(kuò)增序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6或其具有至少 10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段的一對(duì)引物的一對(duì)引物；或
c)具有包括選自Δ 133ρ53、Δ 133ρ53 γ和Δ 133ρ53β的ρ53同種型序列的至少 10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)物的核苷酸序列的探針。
對(duì)于基于抗體的試劑盒，該試劑盒能包括，例如(1)結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明所述的 Ρ53同種型多肽的(例如，溶液中的或連接于固體支持物的)一抗；及，可選地，(2)偶聯(lián)于可檢測(cè)標(biāo)記的第二個(gè)、不同的抗體，其結(jié)合P53同種型多肽或一抗。
對(duì)于基于寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒能包括，例如(1)雜交于p53同種型核酸序列(mRNA或cDNA，或其特定片段)的寡核苷酸，例如可檢測(cè)標(biāo)記的寡核苷酸，或(2)用于擴(kuò)增本發(fā)明P53同種型核酸分子的一對(duì)引物。該試劑盒還能包括，例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。該試劑盒還能包括檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記(如酶或底物)必需的組分。該試劑盒還能包含能夠被測(cè)定和與生物樣品比較的對(duì)照樣品或系列對(duì)照樣品。該試劑盒的每個(gè)組分均能封在一個(gè)獨(dú)立容器中，并且所有不同容器能連同用于解釋使用該試劑盒進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的說(shuō)明書放在一個(gè)單個(gè)包裝內(nèi)。
本發(fā)明還涉及一種用于補(bǔ)充形態(tài)學(xué)診斷的方法，其通過(guò)檢測(cè)或定量哺乳動(dòng)物生物樣品中的選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型，通過(guò)上述方法或通過(guò)技術(shù)人員熟知的方法如免疫組化或免疫測(cè)定檢測(cè)上述肽或通過(guò)檢測(cè)任意類型(例如乳腺、結(jié)腸、胰腺、頭頸等)腫瘤中的上述核苷酸序列的任意方法(例如RT-PCR、定量RT-PCR、FISH
寸乂 O


圖1顯示在患者表達(dá)或不表達(dá)Δ 133ρ53β的時(shí)間內(nèi)的無(wú)病生存率(圖la)和生存函數(shù)(圖lb)。
圖2顯示在患者取決于Δ133ρ53β和ER表達(dá)的時(shí)間內(nèi)的無(wú)病生存率(圖2a)和生存函數(shù)(圖2b)。
圖3顯示依賴于Δ 133ρ53 β表達(dá)的侵襲百分?jǐn)?shù)(圖3a)和遷移百分?jǐn)?shù)(圖北)。 圖3c是代表p53和Δ 133ρ53 β同種型的示意圖(NLS 核定位信號(hào))。
圖如顯示在GFP陽(yáng)性細(xì)胞中出泡細(xì)胞(blelibing cell)對(duì)貼壁細(xì)胞的定量分析。
圖4b和c顯示在用于E-鈣黏著蛋白和β -整合蛋白western印跡的細(xì)胞中myc 標(biāo)記的構(gòu)建體表達(dá)的t Western印跡分析。Adh 仍與支持物粘附的細(xì)胞；bleb 顯示出泡運(yùn)動(dòng)并已從支持物脫落的細(xì)胞。用抗GAPDH抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
給出下列實(shí)施例和附圖的目的在于說(shuō)明本發(fā)明不同具體實(shí)施方案，而無(wú)意于以任何方式限制本發(fā)明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
實(shí)施例1 材料和方法
DNA構(gòu)建體、試劑和抗體
人p53同種型構(gòu)建體由J. C. Bourdon饋贈(zèng)。它們被亞克隆到pEGFPCl (Clonetech) 的EcoRI和BamHI位點(diǎn)以給出GFP-標(biāo)記的蛋白質(zhì)或亞克隆到pLPCmyc的BamHI和 EcoRI位點(diǎn)以給出myc-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。根據(jù)廠商說(shuō)明使用Nucleobond PC 500試劑盒 (Macherey-Nagel)擴(kuò)增構(gòu)建體。
Y27632購(gòu)自calbiochem并在所有實(shí)驗(yàn)中以10 μ M使用。
小鼠抗-E-鈣黏著蛋白(克隆36)、小鼠抗β 1-整合蛋白、小鼠抗-ROCK I和小鼠抗-ROCK II抗體購(gòu)自BD-轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室并分別以1/400° ,1/2500° ,1/250°和1/250°進(jìn)行稀釋。小鼠抗jhoA和兔抗-ECT2抗體購(gòu)自Santa Cruz (分別為和C-20)并分別以1/500°和1/200°進(jìn)行稀釋。小鼠抗-GEF-Hl抗體由K. Matter饋贈(zèng)并以1/50°進(jìn)行稀釋。兔抗-P53抗體(CMl)由J. C. Bourdon饋贈(zèng)并以1/1000°進(jìn)行稀釋。
辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗IgG抗體購(gòu)自GE-Healthcare并以1/5000°進(jìn)行稀釋。
Western Lightning Chemiluminescence (ECL)試劑購(gòu)自 PerkinElmer0
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
Hctll6細(xì)胞由B. Vogelstein饋贈(zèng)并在有5% C02存在時(shí)、在37°C培養(yǎng)于添加了 10%胎牛血清(FCS)的McCOY，5A培養(yǎng)基(Sigma)。
根據(jù)廠商說(shuō)明使用JetPei試劑盒(Qbiogen)進(jìn)行同種型的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使用9μ g 的DNA轉(zhuǎn)染一個(gè)70%鋪滿率細(xì)胞的IOOmm盤。在轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，以倍率稀釋細(xì)胞并且所有試驗(yàn)在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行。根據(jù)廠商說(shuō)明使用Lterferin(P0Iyplus)進(jìn)行50ηΜ siRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
延時(shí)成像
在配有自動(dòng)快門和GFP濾光鏡組、63χ油浸物鏡(HC χ PL APO 1. 32-0. 6油CS) Leica DMIRE2倒置顯微鏡，樣品加熱器(37°C )和國(guó)產(chǎn)C02培養(yǎng)箱上進(jìn)行延時(shí)諾馬爾斯基 (nomarski)顯微術(shù)。Wmicromax CCD相機(jī)(1300Y/HS)成像軟件捕獲圖像，轉(zhuǎn)換成TIFF文件并以metamorph進(jìn)行編輯和編纂。對(duì)于GFP曝光時(shí)間為500ms而對(duì)于光為300ms。在5 分鐘內(nèi)每3秒捕獲一次影像或12小時(shí)內(nèi)每4分鐘捕獲一次。
FACS
用未用于侵襲測(cè)定的以GFP標(biāo)記的p53同種型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以1200rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘并通過(guò)加入ImL的70% KOH在-20°C進(jìn)行固定。進(jìn)行碘化丙啶染色，并通過(guò)用CellQuest 軟件和FACS定量和每個(gè)條件下的總細(xì)胞相比較的表達(dá)GFP的細(xì)胞的數(shù)目。
細(xì)胞抽提、Western印跡
以1200rpm旋轉(zhuǎn)包含出泡細(xì)胞的培養(yǎng)基5分鐘并裂解由出泡侵襲細(xì)胞構(gòu)成的沉淀。在裂解緩沖液中輕柔刮掉剩余的貼壁細(xì)胞。分別分析每個(gè)條件下的兩群細(xì)胞(見(jiàn)圖示)。以BCA試劑盒(promega)定量每一提取物中的總蛋白質(zhì)量。使用8% SDS-PAGE凝膠檢測(cè)E-鈣黏著蛋白、β 1-整合蛋白、ROCK 1、ROCK 2、ECT2和GEF-Hl，并用12 % SDS-PAGE 凝膠檢測(cè)ΜιοΑ。在每一泳道上樣等量(30yg)的蛋白質(zhì)。然后通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素(對(duì)于P53、E-鈣黏著蛋白、β 1-整合蛋白、ROCK UROCK 2、ECT2和GEF-H1)或 PVDF (對(duì)于GTP-IihoA)膜。在包含3%牛奶的TBS/0，1 % Tween 20中封閉膜一個(gè)小時(shí)，并隨后以稀釋在包含3%牛奶的TBS/0，Tween 20中的一抗孵育過(guò)夜。在TBS/Tween中洗滌幾次后，以連接于HRP的抗-兔或抗-小鼠Ig抗體孵育膜。根據(jù)廠商說(shuō)明，以ECL顯影膜。
使用AIDA/2D密度測(cè)定軟件定量掃描的放射自顯影。
IihoA活性測(cè)定
對(duì)于RhoA 活性測(cè)定，在 50mM Tris, ρΗ7· 2,1% Triton Χ_100、0· 5%脫氧膽酸鈉、 500mM NaClUOmM MgC12、lmM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物中裂解細(xì)胞。在4°C、以25yg 的包含Miotekin的IihoA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的商業(yè)化GST融合蛋白質(zhì)(GST-RBD，細(xì)胞骨架)珠子孵育凈化的裂解物 30 分鐘。在含 Triton X_100、150mM NaClUOmM MgC12、0. ImM PMSF的Tris緩沖液中洗滌沉淀的復(fù)合物四次，以SDS樣品緩沖液洗脫、并以特異于Mio A的抗體進(jìn)行免疫印跡和分析。同時(shí)跑樣用于沉淀的一等份總裂解物以定量細(xì)胞裂解物中存在的總ΜιοΑ。使用Aida/2D密度測(cè)定軟件定量掃描的放射自顯影，并標(biāo)準(zhǔn)化為MioA蛋白表達(dá)的函數(shù)。
侵襲分析
在包含熒光封閉聚碳酸酯微孔膜插入(Fluoroblock ；#351152 ；BD Biosciences ； 孔徑8μπι)的Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室中進(jìn)行細(xì)胞侵襲的定量。在"Transwell中制備 100 μ 1的含減少的(reduced)生長(zhǎng)因子(來(lái)自Englebreth-Holm-Swarm腫瘤的商業(yè)制備的重組 BM，#；354230 ;BD Biosciences)的 2mg/mL Matrigel。在胰酶消化和于 Transwell 上層小室中包含的Matrigel的厚層(約500 μ m)頂部鋪板上于含2% FCS的培養(yǎng)基中鋪板 (10. IO4)之前，細(xì)胞作為單層被轉(zhuǎn)染并以Y27632處理或不以Y27632處理。留下對(duì)照不予處理。然后將上層和下層小室分別填充含2% FCS的培養(yǎng)基和含10% FCS的培養(yǎng)基，從而建立允許細(xì)胞通過(guò)Matrigel的侵襲的化學(xué)吸引劑的可溶性梯度。在3. 7%甲醛中固定15 分鐘之前，允許細(xì)胞在37°C、5% CO2下侵襲通過(guò)凝膠。通過(guò)GFP熒光檢測(cè)過(guò)濾器下方的侵襲通過(guò)Matrigel的細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)過(guò)濾器的所有表面，并在每個(gè)條件下的三重復(fù)中進(jìn)行兩次的每一個(gè)測(cè)定。
乳腺癌患者
分析來(lái)自具有達(dá)到診斷要求的足夠腫瘤組織剩余物和完整的臨床和病理資料的 171名白人婦女(年齡范圍M-89歲，年齡中值64歲)的原發(fā)性、以前未經(jīng)治療的可行手術(shù)的乳腺腫瘤。由專門的乳房病理學(xué)家顯微解剖(macrodissect)腫瘤組織并在_80°C存儲(chǔ)前速凍于液氮。從無(wú)乳腺癌個(gè)人或家族病史的正進(jìn)行縮乳術(shù)的患者處獲得正常的乳腺組織。經(jīng)由泰賽德組織銀行(Tayside Tissue Bank)授予權(quán)力的當(dāng)?shù)匮芯總惱砦瘑T會(huì)(Local Research Ethics Committee)的批準(zhǔn)檢查樣品。
RT-PCR 分析
在750 μ 1 QIAzol 裂解試劑(Qiagen Ltd, Crawley, West Sussex,英國(guó))中勻漿大約IOmg的腫瘤組織(> 40%的腫瘤細(xì)胞)，并用BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto，CA，美國(guó))證實(shí)抽提的RNA質(zhì)量，證明在RT-PCR之前有兩個(gè)尖峰的 28S/18S 彡 1. 5。
p53同種型cDNA太長(zhǎng)而不能用RT-qPCR特異定量，因此我們使用需要高質(zhì)量總 RNA(28S/18S比例> 1.5)的半定量RT-PCR法。在使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄500ng總RNA之后， 以PCR擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白cDNA以驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄效率。(AMV RT，45C，隨機(jī)引物)反轉(zhuǎn)錄來(lái)自每一腫瘤樣品的0. 5 μ g總RNA并通過(guò)以30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白確定cDNA質(zhì)量。使用之前所述的(Bourdon等，2005a)特異于每一同種型的引物通過(guò)30個(gè)循環(huán)的兩個(gè)巢式PCR 擴(kuò)增P53同種型cDNA。在測(cè)序相應(yīng)PCR片段之后認(rèn)為腫瘤表達(dá)每個(gè)p53同種型。
P53 突變分析 AmpliChip p53 試驗(yàn)
AmpliChip p53 1 ! ^!:^- Roche Molecular Systems, Inc (Pleasanton, California，美國(guó))開發(fā)中的產(chǎn)品。此試驗(yàn)需要福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織的一個(gè) 10微米切片或是來(lái)自新鮮冷凍腫瘤的IOOng純化的基因組DNA。在此研究中，抽提自勻質(zhì)化的冷凍組織的IOOng基因組DNA被用于在兩個(gè)反應(yīng)(A和B)中擴(kuò)增涵蓋p53基因的編碼區(qū)的產(chǎn)物。反應(yīng)A擴(kuò)增外顯子2、5、8、10、及具有內(nèi)對(duì)照的外顯子4上游序列，而反應(yīng)B擴(kuò)增外顯子3、6、7、9、11、及具有同樣的內(nèi)對(duì)照的外顯子4下游序列。合并從A反應(yīng)和B反應(yīng)中生成的PCR產(chǎn)物用于DNA酶I切割以生成平均大小為50-100個(gè)核苷酸的小DNA片段。隨后通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶以生物素標(biāo)記片段化的DNA擴(kuò)增物。將生物素標(biāo)記的p53靶DNA片段加入到雜交緩沖液中。使用 Affymetrix GeneChip Fluidics Station 450Dx 和 AmpliChip p53 特異規(guī)程雜交混合物于位于AmpliChipp53芯片上的寡核苷酸。洗滌雜交的AmpliChip p53 芯片并用鏈霉親和素偶聯(lián)的熒光染料(藻紅蛋白)染色。染色后，以Affymetrix GeneChip karmerfOOODx、使用激發(fā)結(jié)合于雜交的p53靶DNA片段的熒光標(biāo)記的激光掃描AmpliChip P53芯片。發(fā)射光的量與探針芯片上每個(gè)位置的結(jié)合的靶DNA成正比。
芯片設(shè)計(jì)和芯片信號(hào)的數(shù)據(jù)分析
Roche Molecular System設(shè)計(jì)的AmpliChip p53芯片由對(duì)于外顯子2-11編碼區(qū)的總共1268個(gè)核苷酸位置所鋪設(shè)的220，000以上的單獨(dú)寡核苷酸的超過(guò)33，000個(gè)探針組組成。探尋堿基位置的單個(gè)探針組包括五個(gè)探針，一個(gè)探針用以雜交野生型，三個(gè)探針來(lái)檢測(cè)三個(gè)可能的單堿基對(duì)突變，還有一個(gè)探針用以檢測(cè)單個(gè)刪除。對(duì)于每個(gè)核苷酸位置有至少M(fèi)個(gè)探針組，包括正義和反義探針序列。AmpliChip p53芯片由AfTymetrix使用結(jié)合光刻方法和組合化學(xué)的技術(shù)制造。通過(guò)Roche Molecular System開發(fā)的p53突變檢測(cè)算法確定P53突變狀態(tài)，該算法設(shè)計(jì)用于檢測(cè)在野生型P53DNA探針強(qiáng)度背景下的樣品的單堿基對(duì)置換和單堿基對(duì)刪除。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
用卡方SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(需要ref)、雙尾Fisher精確檢驗(yàn)和Kaplan-Meier分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。置信度大于95% (P ^ 0. 05)的結(jié)果被判定具有顯著性。
實(shí)施例2 分析乳腺癌患者中的Δ 133ρ53 β表達(dá)
分析來(lái)自具有達(dá)到診斷要求的足夠腫瘤組織剩余物和完整的臨床和病理資料的 171名白人婦女(年齡范圍Μ-89歲，年齡中值64歲)的原發(fā)性、以前未經(jīng)治療的可行手術(shù)的乳腺腫瘤。
結(jié)果
在171個(gè)乳腺癌中，鑒定到50/171( % )中表達(dá)Δ 133p53,20/171 (11 % )中表達(dá)Δ133ρ53β及27/171 (16%)中表達(dá)Δ 133ρ53 γ，而在正常乳腺組織中未檢測(cè)到這三個(gè)同種型。
Δ 133ρ53 β表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(Marm-Whitney分析，精確單尾，ρ
<0.036)，并且與此一致，具有表達(dá)Δ133ρ53β的腫瘤的患者有顯著的惡化無(wú)病生存率 (worse disease free survial) (log-rank, Cox-Mantel, ρ < 0. 025)(圖 la)禾口總生存率 (log-rank, Cox-Mantel, ρ < 0. 025)(圖 lb)。
Δ133ρ53β與低ER表達(dá)顯著相關(guān)(χ2 = 4. 1，χ d. f.，分別為ρ < 0. 043)，特別是對(duì)于侵襲性導(dǎo)管癌(乳腺癌的最常見(jiàn)病理類型)來(lái)說(shuō)(142/171例)(成對(duì)t-檢驗(yàn)，ρ
<0. 015)。
圖加顯示，表達(dá)Δ 133ρ53 β的ER陽(yáng)性患者比無(wú)Δ 133ρ53 β表達(dá)的ER陽(yáng)性患者具有顯著惡化的無(wú)病生存率(log rank, Cox-Mantel, ρ < 0.0002，成對(duì)比較 Δ 133ρ53 β +ER+ X^t Δ 133ρ53 β -ER+, ρ < 0. 003) 此外，圖 2b 顯示表達(dá) Δ 133ρ53 β 的 ER陽(yáng)性患者相對(duì)于ER陰性患者具有意想不到的低生存率(生存率log rank, Cox-Mantel, ρ < 0.0003，成對(duì)比較 A133p53^+ER+^ER-, ρ < 0.658)。
因此Δ133ρ53β與原發(fā)性乳腺癌的不良預(yù)后特征(腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，ER陰性)、 較短無(wú)病生存率和更差預(yù)后相關(guān)。
實(shí)施例3 在侵襲過(guò)程中Δ 133ρ53 β同種型的主要作用
首先，使用侵襲測(cè)定(見(jiàn)方法)檢驗(yàn)了 GFP標(biāo)記的Δ133ρ53、Δ 133ρ53 γ和 Δ133ρ53β同種型的表達(dá)對(duì)于保留上皮特征并表達(dá)野生型ρ53的結(jié)腸和乳腺癌細(xì)胞 (hctll6用于結(jié)腸癌及MCF7用于乳腺癌)侵襲的影響。
GFP單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被用作陰性對(duì)照。在再現(xiàn)生理基底膜的matrigel的厚層頂部鋪細(xì)胞。此體外測(cè)定目的在于模擬腫瘤細(xì)胞穿過(guò)基底膜的進(jìn)程。
圖3a顯示，Δ133ρ53β同種型的表達(dá)顯著增加了侵襲。以MCF7獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這意味著異位Δ133ρ53β同種型的過(guò)表達(dá)可以克服內(nèi)源性ρ53的抗遷移活性。
為確定表達(dá)ρ53同種型的細(xì)胞使用何種方式的遷移以侵襲經(jīng)過(guò)matrigel，對(duì)表達(dá) GFP標(biāo)記的同種型的HCT 116細(xì)胞進(jìn)行攝影。觀察到了兩群細(xì)胞貼附在玻璃上的粘合上皮細(xì)胞和粘合細(xì)胞之上的圓形細(xì)胞(位于上層焦點(diǎn))。以GFP標(biāo)記的Δ133ρ53β同種型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在其表面生成動(dòng)力學(xué)泡樣結(jié)構(gòu)。在攝像期間，一些圓形細(xì)胞移動(dòng)了而一些粘合貼壁細(xì)胞逐步從上皮細(xì)胞脫離并變成圓形(數(shù)據(jù)未顯示)。粘附結(jié)構(gòu)的喪失和同時(shí)獲得的圓形出泡運(yùn)動(dòng)與上皮阿米巴樣轉(zhuǎn)換(印ithelial-amoeboid transition, EAT)驚人地相似。以 FACS對(duì)照認(rèn)識(shí)到這些出泡運(yùn)動(dòng)不是因?yàn)榈蛲鏊?數(shù)據(jù)未顯示)。
為定量表型的外顯率，從粘合細(xì)胞中分離圓形的細(xì)胞并用FACS計(jì)數(shù)兩個(gè)群體中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)于Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ，出泡細(xì)胞的數(shù)目分別比貼壁細(xì)胞數(shù)目升高了 2. 5和2. 25倍，而對(duì)于Δ 133ρ53 β，出泡細(xì)胞的數(shù)目比貼壁細(xì)胞數(shù)目升高了 4倍(圖 4a)。總結(jié)一下，此表型是顯著外顯性的，即表達(dá)GFP標(biāo)記的Δ133ρ53β同種型的細(xì)胞大部分采取圓形形態(tài)且細(xì)胞從上皮細(xì)胞脫落。
在EAT期間，首先分離緊密連接，然后是之后的粘著接消失。由于E-鈣黏著蛋白是粘著連接的基本組分，它被廣泛用作這些連接完整性的特異標(biāo)記。在表達(dá)Ρ53的細(xì)胞中， E-鈣黏著蛋白在貼壁粘合細(xì)胞中以高水平表達(dá)而在出泡細(xì)胞中E-鈣黏著蛋白表達(dá)喪失 (圖4b)，證明出泡細(xì)胞喪失了關(guān)鍵的表皮細(xì)胞特征。
已經(jīng)歷EAT的腫瘤細(xì)胞表達(dá)低水平的β 1-整合蛋白，并因此采取不依賴于整合蛋白-粘附過(guò)程的阿米巴樣遷移。評(píng)估了在表達(dá)Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β同種型的hctll6細(xì)胞中β 1-整合蛋白的表達(dá)。對(duì)于E-鈣黏著蛋白，出泡細(xì)胞不表達(dá)β -整合蛋白(圖4c)。用myc-或GFP-標(biāo)記的同種型獲得了同樣的結(jié)果。以使用抗myc抗體的 western印跡調(diào)控myc-標(biāo)記的同種型的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些結(jié)果顯示，N末端刪除的p53同種型的表達(dá)促進(jìn)了 hctll6細(xì)胞中上皮-阿米巴樣轉(zhuǎn)換，其因此通過(guò)圓形出泡運(yùn)動(dòng)進(jìn)行遷移。這種方式的遷移比間充質(zhì)遷移更為有效，說(shuō)明腫瘤中這些Δ133ρ53β變體的表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。這加強(qiáng)了這樣的觀點(diǎn)，即適當(dāng)調(diào)節(jié)ρ53同種型表達(dá)的失敗對(duì)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移造成巨大的后果。
因?yàn)閳A形出泡相關(guān)的運(yùn)動(dòng)模式依賴于ROCKO^ho激酶)信號(hào)，在ROCK抑制劑Y27632存在時(shí)進(jìn)行侵襲測(cè)定。規(guī)程如上所述。
結(jié)果顯示，Y27632處理高度降低了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲性，表明ROCK活性為Δ 133p53 同種型表達(dá)所提供的侵襲性所必需。
近來(lái)，據(jù)報(bào)道兩個(gè)同源ROCK可能在功能上不等同。為確定是否兩個(gè)ROCK同種型對(duì)于P53同種型依賴性圓形出泡相關(guān)運(yùn)動(dòng)有相同的影響，研究了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中ROCK I和ROCK II的表達(dá)。結(jié)果顯示，粘附細(xì)胞中ROCK I表達(dá)增加(與對(duì)照細(xì)胞相比，T)但在出泡細(xì)胞中顯著降低。相反，在所有情況下ROCK II均高水平表達(dá)，并且特別是在出泡細(xì)胞中維持。這意味著，ROCK II為出泡運(yùn)動(dòng)所優(yōu)先需要，而ROCK I可能在上皮-阿米巴樣轉(zhuǎn)換的前期步驟中涉及。盡管其具有高序列同源性(65%的總體同一性和在其激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的92%同一性)，ROCK I和ROCK II不以冗余的方式作用在敲除小鼠內(nèi)ROCK I不能補(bǔ)償ROCK II的損失，并且兩個(gè)同種型調(diào)控肌球蛋白II活性的不同方面。因此第一次顯示了兩個(gè)ROCK同種型在阿米巴樣遷移和隨后的侵襲中的不同意義。
在圓形出泡運(yùn)動(dòng)中ROCK-驅(qū)動(dòng)的肌動(dòng)蛋白重組在很大程度上依賴于MioGTP酶家族蛋白MioA。
為研究p53同種型在ROCK信號(hào)上行使其功能的機(jī)制，檢查了表達(dá)3個(gè)Δ 133ρ53 同種型的粘附或出泡細(xì)胞的MioA表達(dá)。
當(dāng)細(xì)胞表達(dá)或不表達(dá)ρ53 Δ 133同種型的時(shí)候，RhoA的總水平是相同的(數(shù)據(jù)未顯示)。此表達(dá)在出泡細(xì)胞中得以維持。然而，該蛋白質(zhì)的表達(dá)水平不反映激酶活性。使用只捕獲活性的GTP結(jié)合形式的IihoA的pull-down測(cè)定比較了表達(dá)或不表達(dá)Δ 133ρ53同種型的粘附對(duì)出泡細(xì)胞的MioA活性。首先，我們觀察了粘附上皮細(xì)胞中的MioA基礎(chǔ)活性。 然而，在出泡細(xì)胞中此活性大大增加。有趣的是，以Δ 133 β-ρ53獲得的增加比那些以其他同種型(Δ 133-ρ53和Δ 133 γ -ρ53)獲得的增加高2. 5-3倍，其與Δ 133 β -ρ53表達(dá)細(xì)胞喪失表面粘附的重要能力相關(guān)。
問(wèn)題在于，是否Δ 133-ρ53同種型表達(dá)的細(xì)胞中MioA的激活是由于鳥嘌呤交換激活因子(GEF)的過(guò)表達(dá)引起。研究聚焦于MioA的兩個(gè)GEF，它們均涉及介導(dǎo)MioA的ρ53依賴性調(diào)控=GEF-Hl，其被發(fā)現(xiàn)被突變?chǔ)?3激活，并且其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞中的ρ53狀態(tài)強(qiáng)烈相關(guān)；及ECT2，其已知是野生型ρ53的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)并且其涉及上皮連接的調(diào)控。
已發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)3個(gè)ρ53同種型的出泡細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了 GEF-Hl。相比而言，與貼壁細(xì)胞相比，在出泡細(xì)胞中ECT2的表達(dá)降低。在出泡細(xì)胞中ECT2的此下調(diào)與其已知作為上皮連接調(diào)節(jié)劑的功能相適應(yīng)，但不涉及MioA激活，該激活可能依賴于GEF-Hl的上調(diào)。這表明了在上皮-阿米巴樣轉(zhuǎn)換期間GEF-Hl和ECT2的不同作用。結(jié)果與當(dāng)轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞時(shí)GEF-Hl的轉(zhuǎn)化能力及當(dāng)在裸鼠中注射以GEF-Hl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)腫瘤相一致。I^hoA 下游的兩個(gè)相反途徑對(duì)于粘附連接的調(diào)控起作用R0CK依賴性途徑涉及破壞上皮連接，及 Dia依賴性路徑促進(jìn)鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物的形成及連接的穩(wěn)定。一個(gè)可能是這兩個(gè)通路為I^hoA的兩個(gè)不同GEF所激活ECT2能激活I(lǐng)^hoA-Dia途徑以促進(jìn)粘附連接，因?yàn)榇?GEF調(diào)控上皮極性，而GEF-Hl能激活MioA-ROCK途徑以破壞細(xì)胞-細(xì)胞連接并促進(jìn)上皮-阿米巴樣轉(zhuǎn)換。P53是這兩個(gè)通路的上游介導(dǎo)物，而且p53的Δ 133同種型的表達(dá)在腫瘤發(fā)生期間使兩個(gè)通路的平衡失去調(diào)控。
數(shù)據(jù)顯示，Δ133ρ53同種型(在N端結(jié)構(gòu)域刪除的同種型)的失調(diào)表達(dá)賦予給腫瘤細(xì)胞增加的活動(dòng)性和侵襲性。這表明改變P53同種型的比例有利于增加腫瘤細(xì)胞的腫瘤侵略性并增強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力，并且突出了癌癥發(fā)展期間剪接事件的重要性。
權(quán)利要求
1.一種檢驗(yàn)被認(rèn)為是傾向于具有轉(zhuǎn)移性癌癥的受試者的方法，其包括步驟i)分析來(lái)自所述受試者的生物樣品來(lái)檢測(cè)選自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ 的ρ53同種型的存在，所述同種型的存在是轉(zhuǎn)移性癌癥的指示物。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中ρ53同種型的存在對(duì)應(yīng)于ρ53同種型表達(dá)水平的確定，所述方法包括將檢測(cè)的Ρ53同種型表達(dá)水平與閾值相比較的另一步驟。
3.一種用于測(cè)定受試者中癌癥侵襲性的方法，其包括步驟i)確定來(lái)自所述受試者的生物樣品中選自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的 Ρ53同種型的存在，所述同種型的存在是侵襲性癌癥的指示物，優(yōu)選地，所述同種型是轉(zhuǎn)移性癌癥的指示物。
4.一種用于確定受試者對(duì)于抗癌治療的反應(yīng)的方法，所述受試者正接受或已接受對(duì)癌癥相關(guān)狀態(tài)的治療，其包括步驟i)確定來(lái)自受試者的生物樣品中選自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同種型的表達(dá)水平，及 )將其與閾值相比較。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求
任一項(xiàng)所述的方法，其中p53同種型是Δ133ρ53β。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求
任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)ρ53同種型多肽或其片段、或通過(guò)檢測(cè)Ρ53同種型mRNA或其片段評(píng)估檢測(cè)選自Δ 133ρ53 β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的 ρ53同種型存在的步驟。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求
任一項(xiàng)所述的方法，包括擴(kuò)增所述ρ53同種型mRNA或cDNA、其互補(bǔ)序列或其具有特異于所述P53同種型的至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段的另一步驟。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求
任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)能特異雜交于所述p53同種型 mRNA、其互補(bǔ)序列或其具有特異于所述p53同種型的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多核苷酸長(zhǎng)度的片段、優(yōu)選雜交于具有序列SEQ ID N0:2的A133p53i3mRNA的探針進(jìn)行選自Δ 133ρ53 β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同種型存在的確定。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1至7任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)下列方法確定選自Δ133ρ53β、 Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同種型的mRNA的存在，該方法包括步驟(a)在雜交條件下將生物檢驗(yàn)樣品于特異于所述p53同種型的核酸探針接觸，該樣品包括-分離自人類受試者生物樣品的RNA分子，其中生物樣品疑似包含腫瘤細(xì)胞，或-自分離的RNA分子合成的核酸分子如cDNA ；其中核酸探針具有包括P53同種型序列的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段、或其片段、或其互補(bǔ)物，及(b)檢測(cè)核酸探針和檢驗(yàn)樣品的雜交物的形成；其中雜交物的存在表明獲自人類受試者的組織中轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1至7任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)將特異于P53同種型多肽或其片段的抗體接觸生物樣品并確定抗體與生物樣品的結(jié)合來(lái)確定選自Δ 133ρ53β、Δ 133ρ53 和Δ133ρ53γ的ρ53同種型存在。
11.一種篩選潛在抗轉(zhuǎn)移性癌的化合物的方法，其包括步驟a)可選地測(cè)定已知表達(dá)選自Δ 133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同種型的細(xì)胞中所述P53同種型的表達(dá)水平；b)將待檢驗(yàn)化合物與所述細(xì)胞接觸；c)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求
1至10所述的檢測(cè)所述p53同種型的方法確定所述p53同種型的表達(dá)水平；及d)如果p53同種型在細(xì)胞中未表達(dá)、或具有低于步驟a)之前的表達(dá)水平，選擇所述化合物作為潛在的抗轉(zhuǎn)移性癌的化合物。
12.一種根據(jù)上述權(quán)利要求
任一項(xiàng)所述的方法，其中癌癥是乳腺癌或結(jié)腸癌。
13.一種用于生產(chǎn)特異識(shí)別選自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ多肽的ρ53同種型多肽的多克隆抗體的方法，其中此方法包括步驟a)以免疫有效量的選自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同種型多肽、或針對(duì)所述多肽的至少9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的特定表位片段，可選地與增強(qiáng)載體制備物一起免疫哺乳動(dòng)物；b)可選地，體外確定動(dòng)物血清或血漿中特異抗體的存在；及c)自動(dòng)物血清或血漿純化或分離特異性抗-Δ133ρ53 β、抗-Δ 133ρ53或抗-Δ133ρ53γ多肽的抗體。
14.一種用于生產(chǎn)能分泌特異識(shí)別選自Δ133ρ53β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ多肽的 Ρ53同種型的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的方法，其中此方法包括步驟a)以免疫有效量的選自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和Δ 133ρ53 γ的ρ53同種型多肽、或針對(duì)所述多肽的至少9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的表位片段，可選地與增強(qiáng)載體制備物一起免疫哺乳動(dòng)物；b)自該哺乳動(dòng)物的脾、淋巴結(jié)或外周血分離生產(chǎn)抗p53同種型肽的抗體的淋巴細(xì)胞；及c)通過(guò)將所述淋巴細(xì)胞融合于同種哺乳動(dòng)物骨髓瘤系永生化生產(chǎn)抗_Δ133ρ53β、 抗- Δ 133ρ53或抗- Δ 133ρ53 γ多肽的抗體的淋巴細(xì)胞。
15.一種用于生產(chǎn)特異識(shí)別選自Δ 133ρ53 β、Δ 133ρ53和Δ 133ρ53 γ多肽的ρ53同種型的單克隆抗體的方法，其中此方法包括步驟a)根據(jù)權(quán)利要求
15所述的方法，生產(chǎn)能分泌特異識(shí)別選自Δ133ρ53β、Δ133ρ53和 Δ 133ρ53 γ多肽的ρ53同種型的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；b)在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)此雜交瘤細(xì)胞；c)自此培養(yǎng)基純化或分離分泌的單克隆抗體。
16.一種用于檢測(cè)或定量選自Δ 133ρ53β、Δ 133p53和Δ 133p53 γ mRNA或多肽的p53 同種型的試劑盒，其中此試劑盒包括a)特異識(shí)別所述p53同種型的多克隆或單克隆抗體；或b)選自能夠擴(kuò)增序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6、或其具有至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段的一對(duì)引物的一對(duì)引物；或c)具有包括選自Δ133ρ53、Δ133ρ53γ和Δ133ρ53β的ρ53同種型序列至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)物的核苷酸序列的探針。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種檢驗(yàn)被認(rèn)為傾向于具有轉(zhuǎn)移性癌癥的受試者的方法，其包括步驟i)分析來(lái)自所述受試者的生物樣品以檢測(cè)選自Δ133p53、Δ133p53γ和Δ133p53β的p53同種型的存在，所述p53同種型的存在是轉(zhuǎn)移性癌癥的指示。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102471801SQ201080029421
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年6月30日
發(fā)明者C·安吉耶, G·加德亞, J-C·鮑登, K·費(fèi)爾南德斯, P·魯, S·維諾 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan