帶gfp標(biāo)記pnc的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，及基于腫瘤侵襲性新靶標(biāo)PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型及其應(yīng)用。帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株，通過GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株構(gòu)建。本發(fā)明的優(yōu)點在于：帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞模型無需其他體外標(biāo)記和特殊試劑及耗材，可直接用于抗轉(zhuǎn)移中藥單體篩選，篩選步驟簡便，方法快捷，費用低，且易于操作，穩(wěn)定性好。
【專利說明】帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，及基于腫瘤侵襲性新靶標(biāo)PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國肝癌發(fā)病率居全球首位，肝癌病死率一直居高不下。針對早期局灶性肝癌，臨床上一般采取手術(shù)結(jié)合放化療的治療方法。但是常規(guī)化療藥物，例如阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、氟脲嘧啶脫氧核苷酸等，在殺傷腫瘤細胞的同時，也對機體正常細胞造成嚴重傷害，具有明顯毒副作用。特別是肝癌晚期患者，化療的毒副作用會對病人本來虛弱的身體造成更大的傷害。另外，肝癌晚期常發(fā)現(xiàn)血行或淋巴轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致癌細胞擴散，而目前尚無明確有效的抗轉(zhuǎn)移藥物。因此探索腫瘤治療的新靶點，并開發(fā)毒副作用較低的化療新藥，對于提高腫瘤治療的靶向性以及減少腫瘤化療的副反應(yīng)具有重要意義。
[0003]侵襲性(浸潤-轉(zhuǎn)移)作為惡性腫瘤的重要標(biāo)志之一，是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因。而抗癌新藥，尤其是抗轉(zhuǎn)移藥物長期處于市場需求“饑渴狀態(tài)”。近來研究發(fā)現(xiàn)，PNC (perinucleolar compartment)是一個與腫瘤侵襲性密切相關(guān)的細胞核亞結(jié)構(gòu),其主要由MRP等非編碼RNA和PTB、CUG-BP1等RNA結(jié)合蛋白所組成。由于腫瘤細胞核中PNC比例與其侵襲性呈正相關(guān)，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)。因此以PNC為探針，建立具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的抗癌新藥的篩選模型具有潛在優(yōu)勢。
[0004]我國傳統(tǒng)的中 藥，例如靈芝、當(dāng)歸、黃芪、三七等，因其抗腫瘤效應(yīng)、放化療增敏作用以及在減輕放化療毒副方面獨具效果而越來越受到人們的重視。但中藥作為一個復(fù)雜組分其具體的作用機制尚不明確，目前，隨著對中藥提取物，尤其是中藥單體的抗腫瘤機制研究的不斷深入，中藥單體在腫瘤治療中的前景日益受到關(guān)注。已有研究顯示中藥單體在肝癌治療中的作用，但面對龐大的中藥單體庫，如何簡便高效地選擇出具有降低肝癌侵襲性潛能的中藥單體，又是一個亟待解決的重要問題，對于藥物的選擇性開發(fā)至關(guān)重要。因此基于新型腫瘤轉(zhuǎn)移分子標(biāo)記物PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞模型的建立，對于從傳統(tǒng)中藥中發(fā)掘具有抗肝癌轉(zhuǎn)移作用的中藥單體，或以此為先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)修飾型藥物的開發(fā)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是通過建立基于新型腫瘤轉(zhuǎn)移分子標(biāo)記物PNC的藥物體外篩選模型，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的中藥單體的選擇性開發(fā)提供技術(shù)平臺。
[0006]首先，本發(fā)明提供了一種帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株及其構(gòu)建方法。
[0007]帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株，通過GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株構(gòu)建。
[0008]帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的構(gòu)建方法:包括如下步驟:
[0009]I)通過腫瘤細胞株體外培養(yǎng)獲得高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株H印G2M ；[0010]2)構(gòu)建帶GFP標(biāo)記的PTB表達質(zhì)粒GFP-PTB:通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在HindIII和BamHl位點處插入GFP表達質(zhì)粒pEGFP-Cl，獲得帶GFP標(biāo)記的PTB融合蛋白表達質(zhì)粒；
[0011]3)步驟2)的GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟I)的高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株，得到帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株，并通過G418篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株!fepG2M-GFP-PTB。
[0012]進一步的，所述在步驟I)為通過腫瘤細胞株原位接種-分離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶-體外培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞株-再次原位接種，重復(fù)5次，獲得高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株HepG2M0
[0013]另外，本發(fā)明還提供了帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的應(yīng)用。 [0014]帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株用于制備肝癌診斷試劑。
[0015]帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株用于制備肝癌藥物篩選模型。
[0016]本發(fā)明還提供了一種抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型及其構(gòu)建和使用方法。
[0017]基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型，所述篩選模型采用帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株，通過中藥單體對帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的PNC抑制率進行篩選。
[0018]基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0019]I)通過腫瘤細胞株原位接種-分離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶-體外培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞株-再次原位接種，如此重復(fù)5次，獲得高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株H印G2M ；
[0020]2)通過PTB抗體的免疫熒光實驗，檢測上述高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株中的PNC比例，3株細胞的PNC比例均在95%以上；
[0021]3)帶GFP標(biāo)記的PTB表達質(zhì)粒(GFP-PTB)的構(gòu)建:通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在HindIII和BamHl位點處插入GFP表達質(zhì)粒pEGFP-Cl，即得到帶GFP標(biāo)記的PTB融合蛋白表達質(zhì)粒；
[0022]4)上述GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒通過Lipofofectamine? 2000分別轉(zhuǎn)染步驟I中的3株細胞，并通過G418篩選2-3周獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細胞株；HepG2M-GFP-PTB ；
[0023]5)采用熒光顯微鏡驗證上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中的PNC比例，與步驟2的PTB免疫熒光檢測結(jié)果一致，即得到可用于抗轉(zhuǎn)移中藥單體篩選的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞模型。
[0024]基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的使用方法，包括如下步驟:
[0025]I)采用CCK8法分析備選中藥單體對帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的生長抑制情況，計算48h時間點對細胞生長抑制達50% (GI50% )和99% (GI99% )的藥物濃度；
[0026]2)帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株爬片過夜后，分別加入GI50%和GI99%濃度的中藥單體作用24小時后，用4%多聚甲醛固定，并水洗封片后于鏡下觀察；
[0027]3)采用熒光顯微鏡檢測中藥單體作用后的PNC比例，每次計數(shù)100個細胞，計數(shù)3次后取平均值；或采用激光共聚焦顯微鏡成像后，配合Stereo Investigator軟件計數(shù)中藥單體作用后的腫瘤細胞PNC比例；
[0028]4)計算PNC抑制率:PNC抑制率=(助溶劑DMSO組的PNC比例-中藥單體組的PNC比例)/助溶劑DMSO組的PNC比例X 100%，再行統(tǒng)計分析；
[0029]5)以中藥單體的PNC抑制率作為篩選依據(jù):在GI50%濃度時達到30%以上PNC抑制率的作為優(yōu)先選擇，以GI99%濃度達到30%以上PNC抑制率的作為第二選擇。
[0030]抗癌新藥，尤其是抗轉(zhuǎn)移藥物長期處于市場需求“饑渴狀態(tài)”。近年來，中藥單體在肝癌治療中的前景日益受到關(guān)注。但如何簡便高效地從龐大的中藥單體庫篩選出具有降低腫瘤侵襲性潛能的中藥單體，又是一個亟待解決的重要問題。而肝癌細胞核中PNC比例與其侵襲性呈正相關(guān)，因此有望作為新型的腫瘤轉(zhuǎn)移分子標(biāo)記物而用于抗轉(zhuǎn)移新藥的篩選。因此基于PNC標(biāo)記的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞模型的建立，對于從傳統(tǒng)中藥中發(fā)掘具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的中藥單體具有重要意義。
[0031]另外，PTB作為PNC的主要組成蛋白之一，可明確顯示PNC在細胞核中的定位和大小，穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP標(biāo)記PTB的腫瘤細胞可直觀反映細胞中的PNC比例，因此在高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞中導(dǎo)入GFP-PTB可作為抗轉(zhuǎn)移中藥單體的有效篩選模型。本發(fā)明所提供的基于該類細胞的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型，對于藥物的選擇性開發(fā)至關(guān)重要。
[0032]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0033]1、帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞模型無需其他體外標(biāo)記和特殊試劑及耗材，可直接用于抗轉(zhuǎn)移中藥單體篩選，篩選步驟簡便，方法快捷，費用低，且易于操作，穩(wěn)定性好；
[0034]2、中藥較之常 規(guī)化療藥物具有低毒副作用的優(yōu)勢，因此基于PNC指針的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞模型的建立，對于具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的中藥單體的高通量篩選及選擇性開發(fā)至關(guān);
[0035]3、帶GFP標(biāo)記的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞模型亦能用于動物實驗的活體成像分析，為抗轉(zhuǎn)移中藥單體的體內(nèi)驗證提供良好的肝癌細胞模型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為HepG2M-GFP_PTB (高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株)中的PNC亞細胞定位圖，細胞核仁周邊的亮點，即為PNC結(jié)構(gòu)。
[0037]圖2為中藥單體槲皮素、異甘草素、姜黃素處理H印G2M-GFP-PTB細胞后的PNC比例柱狀圖:其中，PNC比例在中藥單體處理后顯著降低，且呈劑量依賴性。
具體實施例
[0038]下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。
[0039]本發(fā)明實施例中所需要的材料、試劑均可市場購得。
[0040]實施例1
[0041]一、將H印G2細胞(購至ATCC)，于肝臟原位接種-分離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶-體外培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)移性肝癌細胞-再次肝臟原位接種(重復(fù)5次)，獲得高侵襲性的肝癌細胞株H印G2M ；
[0042]二、采用PTB抗體(購至Invitrogen，1:1000稀釋)進行免疫熒光檢測，HepG2M細胞中的PNC比例為97.5% ;
[0043]三、構(gòu)建帶GFP標(biāo)記的PTB表達質(zhì)粒(GFP-PTB):通過高保真DNA聚合酶PCR擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在HindIII和BamHl位點處插入GFP表達質(zhì)粒pEGFP-Cl (購至上海和元生物技術(shù)有限公司)，即得到帶GFP標(biāo)記的PTB融合蛋白表達質(zhì)粒；
[0044]四、上述GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒通過Lipof ectamine? 2000 (購至Invitrogen)轉(zhuǎn)染H印G2M細胞，并通過G418篩選約3周獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株H印G2M-GFP-PTB。該細胞中的PNC比例與H印G2M細胞中的基本一致，為97.8%。即得到可用于抗轉(zhuǎn)移中藥單體篩選的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞模型；五、!fepG2M-GFP-PTB細胞(按5000個/孔)接種96孔板，貼壁過夜后，加入梯度濃度的中藥單體(槲皮素、異甘草素、姜黃素、柚皮素、山奈酚等，均購至成都瑞芬思生物科技有限公司，以DMSO助溶)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，采用CCK8法分析中藥單體對H印G2M-GFP-PTB細胞的生長抑制情況，并采用GraphPadPrism5軟件計算細胞生長抑制達50% (GI50% )和99% (GI99% )時的藥物濃度，見下表:
[0045]
【權(quán)利要求】
1.帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株，其特征在于:通過GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株構(gòu)建。
2.權(quán)利要求1所述的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的構(gòu)建方法:包括如下步驟: 1)制備高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株H印G2M； 2)構(gòu)建帶GFP標(biāo)記的PTB表達質(zhì)粒GFP-PTB:通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在HindIII和BamHl位點處插入GFP表達質(zhì)粒pEGFP-Cl，獲得帶GFP標(biāo)記的PTB融合蛋白表達質(zhì)粒； 3)步驟2)的GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟I)的高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株，得到帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株，并通過G418篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株!fepG2M-GFP-PTB。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于:所述在步驟I)為肝癌細胞株原位接種-分離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶-體外培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞株-再次原位接種，重復(fù)5次，獲得高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株H印G2M。
4.權(quán)利要求1所述的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株用于制備肝癌診斷試劑。
5.權(quán)利要求1所述的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株用于制備肝癌藥物篩選模型。
6.基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟: 1)通過腫瘤細胞株原位接種-分離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶-體外培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞株-再次原位接種，如此重復(fù)5次，獲得高轉(zhuǎn)移性的肝癌細胞株H印G2M ； 2)通過PTB抗體的免疫熒光實驗，檢測上述高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株中的PNC比例，3株細胞的PNC比例均在95%以上； 3)帶GFP標(biāo)記的PTB表達質(zhì)粒(GFP-PTB)的構(gòu)建:通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴增人PTB cDNA序列，擴增后的片斷在Hindi 11和BamHl位點處插入GFP表達質(zhì)粒pEGFP-Cl，即得到帶GFP標(biāo)記的PTB融合蛋白表達質(zhì)粒； 4)上述GFP-PTB融合蛋白表達質(zhì)粒通過Lipofeetamine?2000分別轉(zhuǎn)染步驟I中的3株細胞，并通過G418篩選2-3周獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細胞株；!fepG2M-GFP-PTB ； 5)采用熒光顯微鏡驗證上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中的PNC比例，與步驟2的PTB免疫熒光檢測結(jié)果一致，即得到可用于抗轉(zhuǎn)移中藥單體篩選的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞模型。
7.一種基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型，其特征在于:所述篩選模型采用帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株，通過中藥單體對帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的PNC抑制率進行篩選。
8.權(quán)利要求7所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的使用方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)采用CCK8法分析備選中藥單體對帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株的生長抑制情況，計算48h時間點的GI50%和GI99%藥物濃度； 2)帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞株爬片過夜后，分別加入GI50%和GI99%濃度的中藥單體作用24小時；3)用4%多聚甲醛固定，并水洗封片； 4)采用熒光顯微鏡檢測中藥單體作用后的PNC比例，每次計數(shù)100個細胞，計數(shù)3次后取平均值；或采用激光共聚焦顯微鏡成像后，配合Stereo Investigator軟件計數(shù)中藥單體作用后的腫瘤細胞PNC比例； 5)計算PNC抑制率:PNC抑制率=(助溶劑DMSO組的PNC比例-中藥單體組的PNC比例)/助溶劑DMSO組的PNC比例X 100%，再行統(tǒng)計分析； 6)以中藥單體的PNC抑制率作為篩選依據(jù):在GI50%濃度時達到30%以上PNC抑制率的作為優(yōu)先選擇，以GI99%濃度達到30%以上PNC抑制率的作為第二選擇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于PNC 的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的使用方法，其特征在于:步驟4)具體為:細胞爬片用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘后，PBS洗2次，超純水洗I次，每次3分鐘。然后每張細胞爬片加10 μ I防熒光淬滅封片劑進行封片。
【文檔編號】C12Q1/02GK103966170SQ201410202228
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】劉艷寧, 陳智, 樓國華, 王靜, 吳珊珊 申請人:浙江大學(xué)