本發(fā)明涉及一種應用于光鑷測量測試系統(tǒng)的微球自動捕獲方法。特別涉及在狹小視場與低景深成像下的微球自動識別、捕獲的方法。

背景技術(shù)：

光鑷技術(shù)基于光的力學效應，能夠捕獲操縱微米、納米級的微粒，并對所施加的力進行測量，具有非接觸、無損傷、高精度的特點，被廣泛用于生物單分子、細胞等測量領(lǐng)域中，極大的促進了定量生物學的發(fā)展。光鑷技術(shù)主要利用高度聚焦的激光光束產(chǎn)生三維勢阱從而對微小粒子產(chǎn)生吸引，通過測量微球與光阱中心的距離計算相應受到的作用力。微球往往均勻分布于樣品池中，傳統(tǒng)的光鑷系統(tǒng)在使用時缺少選擇性和排他性，處于光阱附近的任何介電粒子都有可能被捕獲。為防止同時捕獲多個微粒而影響實驗測試過程，目標樣品必須以非常低的濃度分散在液體中。對于手動操作與半自動操作的光鑷，往往需要花費較多時間用于微球的捕獲上面，大大降低了實驗效率，加重了操作者的實驗負擔。光鑷技術(shù)的自動化因而成為研究的重點。

光鑷技術(shù)的自動化技術(shù)目前已有很多成果與進展。Grover等人利用圖像處理技術(shù)實現(xiàn)了一種自動分揀單細胞的方法，Wu等人實現(xiàn)了一種A*算法用于單細胞搬運的路徑規(guī)劃。同樣，Banerjee等人實現(xiàn)了一種自由路徑規(guī)劃算法用于單細胞的搬運。Chapin等人將交通規(guī)則引入粒子的搬運，實現(xiàn)了粒子的排列。CHeah等人建立了包含粒子布朗運動的運動模型，實現(xiàn)了一種用于控制粒子運動的控制器。

以上研究多數(shù)建立在一種過度理想環(huán)境當中，如干凈、穩(wěn)定的液體環(huán)境。并且更多針對的是細胞等較大的粒子在具有較大視場下的運動控制算法，對于測量應用所需的算法還不多。針對用于力譜測量的光鑷系統(tǒng)，其所需微粒直徑更小，一般在1-2um左右；所需光阱的剛度更高，往往需要達到0.5pn/nm,也就意味著使用的物鏡具有更高的數(shù)值孔徑，從而使得觀察視場和景深都變得有限，最終使得粒子重復捕獲的現(xiàn)象更容易發(fā)生。同時由于剛度的提升也需要更高的激光功率，這樣也導致了在樣品池中加熱效應更加明顯，并導致了樣品池中液體的對流。粒子除了布朗運動還要收到液體環(huán)境對流的影響，使得針對性的捕獲粒子變得更加困難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對大剛度、小視場的光鑷測量測試，提供一種自動識別、捕獲800nm-10um的微小粒子，同時防止微小粒子重復捕獲的控制方法，能夠在測量測試粒子及生物單分子等實驗過程自動完成重復較多的捕球工作，有效的提高實驗的效率，減輕實驗者的工作量，并提升實驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種光鑷系統(tǒng)中的微球自動捕獲方法，包括如下步驟：

1)光鑷系統(tǒng)初始化，設(shè)置光阱位置，設(shè)定CCD曝光時間、幀率、圖像格式，設(shè)定微納米位移臺初始位置、最大移動速度、加速度參數(shù)；

2)設(shè)定圖像初始背景；

3)預設(shè)路徑，根據(jù)路徑控制微米位移臺進行搜索；

4)對每幀圖像處理，當視場存在微球，輸出微球位置、直徑、ID特征，具體步驟包括：

(1)采用背景差分法，去除背景的干擾，背景圖像需要每隔5幀對背景與當前幀進行一次平均運算作為新的背景，若當前幀存在微球，則將微球的位置除掉，再對背景進行更新，得到背景差分圖像；

(2)使用全局固定閾值對背景差分圖像二值化；

(3)采用形態(tài)學處理方法，對二值圖像進行閉運算，得到粒子填充圖案；

(4)進行粒子輪廓的提取以及輪廓外接圓的擬合，初步得到單幀圖像的粒子輪廓位置信息；

(5)獲得首幀含有粒子圖像后，對每個粒子進行編號，每個粒子獲得唯一的ID；

(6)在下一幀圖像中重復粒子提取的過程，然后將兩幅圖像的粒子的半徑與位置信息作為特征向量進行比較，計算兩個特征向量的端點距離，端點距離最小的粒子取同一個ID，將未找到匹配結(jié)果的粒子取新的編號，當同一ID的粒子連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)達到預設(shè)次數(shù)，則認為該粒子信息準確并對模塊外輸出，否則認為是圖像噪聲，并刪除該編號以及相關(guān)信息；

5)得到視場內(nèi)微球的特征后，中斷搜索路徑生成捕獲路徑，對粒子按照規(guī)劃的路徑進行PI閉環(huán)控制，直至粒子被成功捕獲，否則重新返回搜索路徑進行搜索，捕獲路徑的生成算法包括：

(1)在視場中以兩個光阱為中心劃定兩個包含光阱且相鄰的矩形區(qū)域，根據(jù)兩個矩形區(qū)域的位置關(guān)系生成其余幾個周邊矩形區(qū)域，從而將視場分為八個矩形區(qū)域，然后將各個區(qū)域分別編號；

(2)以所述的幾個周邊矩形區(qū)域的中心為關(guān)鍵點，生成一個通過各個關(guān)鍵點的圖形作為粒子的轉(zhuǎn)移路徑；

(3)將兩個光阱所在點與粒子轉(zhuǎn)移路徑使用水平線與豎直線相連，并作為粒子進入光阱的連接路徑；

(4)確定目標粒子位置所在的矩形區(qū)域，移動到該區(qū)域的中心點，從而進入轉(zhuǎn)移路徑；

(5)根據(jù)粒子要進入的光阱目標，按照就近原則以及優(yōu)先上方路徑的原則，選擇連接路徑，并通過轉(zhuǎn)移路徑進入連接路勁，將粒子轉(zhuǎn)移至目標光阱；

6)在捕獲粒子執(zhí)行后需要判斷粒子是否被成功捕獲，判定依據(jù)通過統(tǒng)計光阱所在矩形區(qū)域內(nèi)的粒子ID的重復出現(xiàn)的次數(shù)，當連續(xù)數(shù)幀某ID的粒子重復出現(xiàn)在光阱所在矩形區(qū)域且位置變化小于一定閾值，可認為粒子被成功捕獲；

7)當粒子捕獲判定成功，則中斷捕獲路徑轉(zhuǎn)入保護模式，對每幀圖像進行監(jiān)測；當捕獲粒子附近出現(xiàn)其它多余粒子，需要生成躲避路徑。

優(yōu)選地，7)中躲避路徑的生成算法包括：

(1)若多余粒子數(shù)大于一，選擇與光阱距離最近的粒子作為優(yōu)先躲避目標，稱其為目標粒子；

(2)若目標粒子在移動路徑包圍區(qū)域之外，就近通過水平或垂直移動或?qū)⒘Ｗ右瞥鲆晥觯?/p>

(3)若目標粒子在移動路徑包圍區(qū)域之內(nèi)，依據(jù)目標粒子所在矩形區(qū)域，將粒子就近移動至轉(zhuǎn)移路徑上，移動方式按照所操作粒子的次序水平移動與豎直移動交替進行；

(4)確定移動路徑包圍的區(qū)域內(nèi)部沒有粒子時，將視場內(nèi)的多余粒子就近水平或豎直移動至視場外。

相對于傳統(tǒng)的手動捕獲以及半自動捕獲方法能夠消除手動操作帶來的機械振動以及半自動操作的遲滯性，能夠極大的提高微球的捕獲效率，減少重復捕獲對實驗數(shù)據(jù)的破壞，保證實驗的穩(wěn)定性，對于基于光鑷系統(tǒng)的測量具有重要意義。

附圖說明

圖1是粒子自動捕獲控制模式流程圖

圖2是粒子自動識別跟蹤算法的流程圖

圖3是粒子捕獲路徑規(guī)劃算法示意圖

圖4是光鑷系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中

1：1064nm固體激光 2：光束偏振分離合束系統(tǒng)

3：二項色鏡 4：高數(shù)值孔徑水浸物鏡

5：壓電納米位移臺 6：伺服微米位移臺

7：樣品池 8：力譜測量系統(tǒng)

9：780nmLED 10：COMS相機

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明的基于光鑷系統(tǒng)的微球自動捕獲方法做出詳細說明。

本方法的測試系統(tǒng)采用圖4所示的雙光鑷系統(tǒng)進行的，包括雙光鑷生成模塊、照明模塊、圖像采集模塊和位移臺控制模塊。雙光鑷生成模塊采用單激光(1064nm)分束使用高數(shù)值孔徑物鏡匯聚生成光阱；照明模塊采用透射式同軸均勻照明，照明光源采用780nm波長的LED，照明光路與主光路采用二向色鏡進行耦合，成像模塊使用美國Thorlabs公司的DCC1545M的COMS相機，樣品位移臺臺使用德國PI公司的壓電控制器(P-517.3CL)與美國Newport公司的TRA-12CC促動器結(jié)合進行三維方向的控制。

本發(fā)明利用COMS相機采集粒子的8位灰度圖像進行處理分析，得到粒子的位置、半徑等信息。綜合前后粒子狀態(tài)的變化制定控制位移臺的位移方法，實現(xiàn)微球的自動識別、捕獲，以及捕獲粒子后防止重復捕獲，大大提高了測量過程的效率，減小手動操作造成的不穩(wěn)定性與低效。

本發(fā)明的基于光鑷系統(tǒng)的微球自動捕獲方法，如圖1所示，包括如下步驟：

1)光鑷系統(tǒng)初始化，設(shè)置光阱位置，設(shè)定CCD曝光時間、幀率、圖像格式，設(shè)定微納米位移臺初始位置、最大移動速度、加速度等參數(shù)；

2)手動設(shè)定圖像初始背景或采用默認；

3)開始自動捕獲，自動生成搜索路徑(或手動預設(shè)路徑)，根據(jù)路徑控制微米位移臺進行搜索，具體搜索路徑的生成方法包括：

(1)自動搜索路徑依靠關(guān)鍵點所圍成的多邊形作為搜索區(qū)域；

(2)在搜索區(qū)域內(nèi)使用蛇形路徑對搜索區(qū)域進行遍歷。

4)對每幀圖像處理，當視場存在微球，輸出微球位置、直徑、ID特征，具體處理流程如圖2所示，包括：

(1)采用背景差分法，去除背景的干擾，背景圖像需要每隔5幀對背景與當前幀進行一次平均運算作為新的背景，由于當前幀一般會存在微球，所以需要將微球的位置除掉，再對背景進行更新；

(2)使用全局固定閾值對背景差分圖像二值化；

(3)采用形態(tài)學處理方法，對二值圖像進行閉運算，得到的粒子填充圖案；

(4)根據(jù)Suzuki85輪廓提取算法進行粒子輪廓的提取以及輪廓外接圓的擬合，初步得到單幀圖像的粒子輪廓位置信息；

(5)獲得首幀含有粒子圖像后，對每個粒子進行編號，每個粒子獲得唯一的ID；

(6)在下一幀圖像中重復粒子提取的過程，然后將兩幅圖像的粒子的半徑與位置信息作為特征向量進行比較，計算兩個向量的端點距離，端點距離最小的粒子取同一個ID，將未找到匹配結(jié)果的粒子取新的編號。當同一ID的粒子連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)達到三次，則認為該粒子信息準確并對模塊外輸出，否則認為是圖像噪聲，并刪除該編號以及相關(guān)信息。

5)得到視場內(nèi)微球的特征后，中斷搜索路徑生成捕獲路徑，對粒子按照規(guī)劃的路徑進行PI閉環(huán)控制，直至粒子被成功捕獲。否則重新返回搜索路徑進行搜索，捕獲路徑的生成算法包括：

(1)在視場中以兩個光阱為中心劃定兩個包含光阱且相鄰的矩形區(qū)域，按照兩個矩形區(qū)域的上、下、左(右)生成其余六個周邊矩形區(qū)域，從而將視場分為八個矩形區(qū)域，然后將各個區(qū)域分別編號。

(2)以周邊六個區(qū)域的中心為關(guān)鍵點，生成一個通過六個關(guān)鍵點的矩形作為粒子的轉(zhuǎn)移路徑。

(3)將兩個光阱所在點與粒子轉(zhuǎn)移路徑使用水平線與豎直線相連，并作為粒子進入光阱的連接路徑。

(4)確定目標粒子位置所在的矩形區(qū)域，移動到該區(qū)域的中心點，從而進入轉(zhuǎn)移路徑。

(5)根據(jù)粒子要進入的光阱目標，按照就近原則以及優(yōu)先上方路徑的原則，選擇連接路徑，并通過轉(zhuǎn)移路徑進入連接路勁，將粒子轉(zhuǎn)移至目標光阱。

6)在捕獲粒子執(zhí)行后需要判斷粒子是否被成功捕獲，判定依據(jù)通過統(tǒng)計光阱所在矩形區(qū)域內(nèi)的粒子ID的重復出現(xiàn)的次數(shù)，當某ID的粒子重復出現(xiàn)在光阱所在矩形區(qū)域且位置變化小于一定閾值，連續(xù)5幀之后可認為粒子被成功捕獲。

7)當粒子捕獲判定成功，則中斷捕獲路徑轉(zhuǎn)入保護模式，對每幀圖像進行監(jiān)測。當捕獲粒子附近出現(xiàn)其它粒子，需要生成躲避路徑。躲避路徑的生成算法包括：

(1)若多余粒子數(shù)大于一，選擇與光阱距離最近的粒子作為優(yōu)先躲避目標。

(2)若目標粒子在移動路徑包圍區(qū)域之外，就近通過水平或垂直移動或?qū)⒘Ｗ右瞥鲆晥?

(3)若目標粒子在移動路徑包圍區(qū)域之內(nèi)，依據(jù)目標粒子所在矩形區(qū)域，將粒子就近移動至轉(zhuǎn)移路徑上，移動方式按照所操作粒子的次序水平移動與豎直移動交替進行。

(4)確定移動路徑包圍的區(qū)域內(nèi)部沒有粒子時，將視場內(nèi)的多余粒子就近水平或豎直移動至視場外。