專利名稱：一種用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的條形碼編制方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及ー種用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的條形碼編制方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬肉是我國居民消費(fèi)的最主要肉類產(chǎn)品，我國也是生產(chǎn)和消費(fèi)豬肉量最大的國家。食品安全近年頻發(fā)，已成為輿論焦點(diǎn)。建立可靠的豬肉產(chǎn)品溯源系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)豬場(chǎng)到餐桌全程雙向可追溯，對(duì)獸藥殘留、瘦肉精、重金屬濫用等問題豬肉生產(chǎn)的遏制，傳染性疾病，特別是人畜共患病傳染性疾病的切斷及處理，市場(chǎng)消費(fèi)信心的培育，養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展等，起至關(guān)重要的作用。、豬肉產(chǎn)品溯源的技術(shù)方法很多，由于技術(shù)簡(jiǎn)單、低成本及實(shí)際操作簡(jiǎn)易，目前大都采用耳標(biāo)等標(biāo)簽溯源技術(shù)，但缺點(diǎn)是標(biāo)簽易丟失、受損、易混淆，易在豬活體、胴體和豬肉產(chǎn)品間分離，且缺乏可信度。DNA溯源技術(shù)基于基因組DNA的遺傳與變異，目前用于肉產(chǎn)品溯源技術(shù)主要是 AFLP、SSR 及 SNP 三種。其中，SNP (single-nucleotide polymorphism,單核苷酸多態(tài)性)標(biāo)記是第三代溯源技木。SNP是指同一物種不同成員間或同一個(gè)體的成對(duì)染色體在同一基因組DNA位點(diǎn)上出現(xiàn)的單個(gè)核苷酸之間的變異。例如，如果來自不同個(gè)體的同一基因組位點(diǎn)DNA片段序列分別為AAGCCTA和AAGCTTA，則此段DNA片段序列就存在ー個(gè)SNP位點(diǎn)，等位基因?yàn)镃和T。幾乎所有常見的SNP均只有兩個(gè)等位基因，但就個(gè)體而言，其成對(duì)染色體可能為不同的等位基因。因此，群體中一個(gè)常見的SNP位點(diǎn)通常存在三種基因型。以上述SNP為例，其群體中存在的基因型一般為C/C(個(gè)體的兩條染色體上的等位基因均為C)、T/T (個(gè)體的兩條染色體上的等位基因均為T)和T/C (個(gè)體的兩條染色體上的等位基因分別為C和T)。相對(duì)而言，基因編碼區(qū)比非編碼區(qū)在進(jìn)化上存在更大的壓力，因此SNP通常出現(xiàn)在非編碼區(qū)。由于種群的地理隔絕，可導(dǎo)致SNP在不同種群中的頻率不同，ー個(gè)在某個(gè)地理種群或種族中常見的SNP等位基因可能極少出現(xiàn)在另一個(gè)種群或種族內(nèi)。再者，SNP是可遺傳的變異中最常見的ー種，具有分布廣、密度高的特點(diǎn)，基因組DNA中平均約每lOOObp，甚至高突變區(qū)段每200-300bp就存在I個(gè)SNP位點(diǎn)，因此，SNP常被開發(fā)為DNA指紋，用于動(dòng)物的個(gè)體身份認(rèn)證，因此研發(fā)豬個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品溯源的SNP條形碼及相應(yīng)的數(shù)字條形碼意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的條形碼編制方法。本發(fā)明的另ー目的在于提供利用該方法編制的條形碼。本發(fā)明的又一目的是提供該條形碼編制方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的條形碼編制方法，選擇待識(shí)別動(dòng)物或待溯源肉產(chǎn)品的基因組DNA上的高雜合度的SNP位點(diǎn)并組合成SNP條形碼，然后用十種阿拉伯?dāng)?shù)字O 9隨機(jī)唯一的替代SNP條形碼中的10種SNP基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相應(yīng)的數(shù)字條形碼，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物個(gè)體身份與SNP條形碼以
及數(shù)字條形碼的一一對(duì)應(yīng)。所述的高雜合度SNP位點(diǎn)優(yōu)選雜合度大于等于O. I的SNP位點(diǎn)。所述的高雜合度SNP位點(diǎn)是根據(jù)GenBank登錄的待識(shí)別動(dòng)物或待溯源肉產(chǎn)品的基因組DNA序列設(shè)計(jì)引物，以待識(shí)別動(dòng)物或待溯源肉產(chǎn)品基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并篩選雜合度大于等于O. I的SNP位點(diǎn)。 所述的動(dòng)物優(yōu)選豬，所述的肉產(chǎn)品優(yōu)選豬肉。所述的豬或豬肉產(chǎn)品的基因組DNA上的高雜合度的SNP位點(diǎn)優(yōu)選根據(jù)GenBank登 錄的豬基因組DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)I 7，以豬基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并篩選雜合度大于等于O. I的SNP位點(diǎn)；其中所述的引物對(duì)I的正向引物為SEQ IDNo. 1，反向引物為SEQ ID No. 2 ;所述的引物對(duì)2的正向引物為SEQ ID No. 3，反向引物為SEQ ID No. 4 ;所述的引物對(duì)3的正向引物為SEQ ID No. 5，反向引物為SEQ ID No. 6 ;所述的引物對(duì)4的正向引物為SEQ ID No. 7，反向引物為SEQ ID No. 8 ;所述的引物對(duì)5的正向引物為SEQID No. 9，反向引物為SEQID No. 10 ;所述的引物對(duì)6的正向引物為SEQ ID No. 11，反向引物為SEQ ID No. 12 ;所述的引物對(duì)7的正向引物為SEQ ID No. 13，反向引物為SEQID No. 14。數(shù)字條形碼與SNP條形碼的對(duì)應(yīng)關(guān)系可以是用0、1、2、3、4、5、6、7、8、9依次分別替代 SNP 條形碼中的 10 種 SNP 基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，也可以是其它的隨機(jī)且唯一的對(duì)應(yīng)編碼方式。按照本發(fā)明所述的條形碼編制方法獲得的用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的SNP條形碼和/或相應(yīng)的數(shù)字條形碼。本發(fā)明所述的SNP條形碼和/或相應(yīng)的數(shù)字條形碼，可應(yīng)用于但不僅限應(yīng)用于在家養(yǎng)和/或野生生物個(gè)體身份識(shí)別和/或家養(yǎng)動(dòng)物肉產(chǎn)品溯源；優(yōu)選應(yīng)用于豬個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品的溯源。一種豬個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品溯源方法，包括備份豬樣本，待識(shí)別豬個(gè)體或待溯源的豬肉產(chǎn)品與對(duì)應(yīng)的備份豬樣本同時(shí)按照本發(fā)明所述的方法制作SNP條形碼和/或相應(yīng)的數(shù)字條形碼并進(jìn)行比對(duì)，從而確認(rèn)豬個(gè)體身份或豬肉產(chǎn)品來源。所述的豬樣本優(yōu)選豬毛發(fā)毛囊或組織樣或血樣。有益效果DNA溯源技術(shù)主要包括AFLP、SSR及SNP等多種形式，其中SNP是由基因組DNA單個(gè)核苷酸的變異所引起的基因組DNA序列的多態(tài)性，動(dòng)物基因組中平均每IOOObp就存在一個(gè)SNP，高變區(qū)每200-300bp就存在ー個(gè)SNP，因此編制SNP條形碼，是ー種有效識(shí)別動(dòng)物個(gè)體身份或溯源肉產(chǎn)品的遺傳學(xué)方法。以豬(共19對(duì)染色體)為例，假如ー對(duì)引物僅只擴(kuò)增I個(gè)SNP位點(diǎn)，那么針對(duì)19條染色體的19對(duì)引物擴(kuò)增的19個(gè)SNP位點(diǎn)組成的SNP條形碼就可以用于識(shí)別11億頭豬(319=1162261467)的個(gè)體身份或?qū)ζ淙猱a(chǎn)品溯源。實(shí)際上，針對(duì)高突變區(qū)的ー對(duì)弓I物可擴(kuò)增出多個(gè)SNP位點(diǎn)，雖然這些SNP位點(diǎn)存在連鎖，但由于祖代突變的逐步積累，可擴(kuò)增多個(gè)SNP位點(diǎn)的引物可區(qū)分多種基因型組合。以我們已獲得的7對(duì)引物為例(實(shí)施例1)，7對(duì)引物擴(kuò)增的41個(gè)SNP位點(diǎn)形成的SNP條形碼可用于近500萬頭豬的個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品溯源，即9X11X7X20X3X10X 12=4989600頭豬(7對(duì)引物擴(kuò)增的且可用于個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品溯源的SNP位點(diǎn)分別是4、4、3、10、1、6、13個(gè)，可以區(qū)分的基因型組合分別是9、11、7、20、3、10、12種)。特別提出的是，7對(duì)引物中最佳的I對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物可以區(qū)分20種基因型組合，如果以此引物計(jì)算，生產(chǎn)中只需要4對(duì)不同的引物就可以實(shí)現(xiàn)8萬頭豬的個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品的溯源(204=80000頭豬)，完全可以滿足規(guī)模豬場(chǎng)的豬個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品的溯源。本發(fā)明針對(duì)豬不同染色體，特別是染色體上的高突變區(qū)段，設(shè)計(jì)并篩選可有效且特異進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物對(duì)，優(yōu)化的引物對(duì)I 7所擴(kuò)增的產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果易讀(測(cè)序色譜圖背景干凈，序列閱讀無歧義)，篩選并獲得高雜合度的SNP位點(diǎn)，構(gòu)建豬個(gè)體身份及豬肉產(chǎn)品溯源的條形碼，實(shí)現(xiàn)豬個(gè)體身份識(shí)別及豬肉產(chǎn)品溯源。規(guī)模豬場(chǎng)或屠宰場(chǎng)可以采集毛發(fā)毛囊或組織樣或血樣，制作豬肉產(chǎn)品條形碼，也可以備份所有出售或待屠宰豬樣本(毛發(fā)毛囊或組織樣或血樣)，通過對(duì)待識(shí)別豬個(gè)體或待溯源的豬肉產(chǎn)品與備份豬樣本分別制作條形碼進(jìn)行比對(duì)，可確認(rèn)豬個(gè)體身份或豬肉產(chǎn)品來源。同時(shí)，條形碼編制方法可以用于種豬的個(gè)體身份識(shí)別，以用于行政管理部門的種豬(良種)登記檔案庫建設(shè)；也同樣可以用于其它家養(yǎng)和野生生物個(gè)體身份識(shí)別及家養(yǎng)動(dòng)物肉產(chǎn)品的溯源。


圖I引物對(duì)I擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果中的+171SNP位點(diǎn)(T/C)圖2引物對(duì)2擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果中的+211SNP位點(diǎn)(A/G)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地豬場(chǎng)96頭豬個(gè)體條形碼的制作I. I基因組DNA模板制備撥取5月齡左右的豬(共96頭豬，為7頭種公豬、12頭種母豬所生。其中，1_9、10-17、18-24、25-32、33-37、38-46、47-50、51-54、55-66、67-77、78-87、88-96 分別為全同胞)豬毛數(shù)根5(含毛囊)，并剪短至I. 5cm,插入裝有8. 8 μ I DNA MiniExtract(南京潤(rùn)邦生物技術(shù)有限公司)的PCR管中(毛囊端朝下并浸入MiniExtract)，PCR管置PCR儀中95°C 5min，16°C 5min,加入 I. 2 μ I 蛋白酶 K (10mg/ml)，55°C 2hr 或以上，95°C IOmin, 16°C Imin,離心上清作PCR模板。1.2PCR 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)分別根據(jù)GenBank 中登錄號(hào)為 AF327369、AF034974、AF473820、X68247、AJ251197,AF038553,M29939的基因設(shè)計(jì)引物對(duì)I 7，詳見表I。反應(yīng)體系(20μI):雙蒸水 13. I μ l、25mM Mg2+2. Ομ IUOXBuffer 2. O μ l,5mMdNTP O. 8 μ 1、5 μ M正反向游引物各I. O μ I、Taq酶O. I μ I、基因組DNA模板I. O μ I。反應(yīng)條件95°C先變性2min ;95°C變性30s，退火(不同引物退火溫度不同，見表I)30s，72°C延伸(不同引物延伸時(shí)間不同，見表1)，共35個(gè)循環(huán)；72°C最后延伸IOmin0各引物對(duì)退火溫度及72°C延伸時(shí)間見表I。
各引物退火溫度、時(shí)間及72°C延伸時(shí)間如下表I用于PCR擴(kuò)增的各引物序列及相應(yīng)的退火溫度和延伸時(shí)間
權(quán)利要求
1.一種用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的條形碼編制方法，其特征在于選擇待識(shí)別動(dòng)物或待溯源肉產(chǎn)品的基因組DNA上的高雜合度SNP位點(diǎn)并組合成SNP條形碼，然后用十種阿拉伯?dāng)?shù)字O 9隨機(jī)唯一的替代SNP條形碼中的10種SNP基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相應(yīng)的數(shù)字條形碼，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物個(gè)體身份與條形碼的——對(duì)應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的條形碼編制方法，其特征在于所述的高雜合度SNP位點(diǎn)為雜合度大于等于O. I的SNP位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的條形碼編制方法，其特征在于所述的高雜合度SNP位點(diǎn)是根據(jù)GenBank登錄的待識(shí)別動(dòng)物或待溯源肉產(chǎn)品的基因組DNA序列設(shè)計(jì)引物，以待識(shí)別動(dòng)物或待溯源肉產(chǎn)品的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并篩選雜合度大于等于O. I的SNP位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任意一項(xiàng)所述的條形碼編制方法，其特征在于所述的動(dòng)物為豬，所述的肉產(chǎn)品為豬肉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的條形碼編制方法，其特征在于所述的高雜合度的SNP位點(diǎn)是根據(jù)GenBank登錄的豬基因組DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)I 7，以豬基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并篩選雜合度大于等于O. I的SNP位點(diǎn)；其中所述的引物對(duì)I的正向引物為SEQ ID No. 1，反向引物為SEQ ID No. 2 ;所述的引物對(duì)2的正向引物為SEQ ID No. 3，反向引物為SEQ ID No. 4;所述的引物對(duì)3的正向引物為SEQ ID No. 5，反向引物為SEQ IDNo. 6 ;所述的引物對(duì)4的正向引物為SEQ ID No. 7，反向引物為SEQ ID No. 8 ;所述的引物對(duì)5的正向引物為SEQ ID No. 9，反向引物為SEQ ID No. 10 ;所述的引物對(duì)6的正向引物為SEQ ID No. 11，反向引物為SEQ ID No. 12 ;所述的引物對(duì)7的正向引物為SEQ ID No. 13，反向引物為SEQ ID No. 14。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的條形碼編制方法，其特征在于分別用0、1、2、3、4、5、6、7、8、9依次替代 SNP 條形碼中的 10 種 SNP 基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C0
7.按照權(quán)利要求I或5所述的條形碼編制方法獲得的SNP條形碼和/或相應(yīng)的數(shù)字條形碼。
8.權(quán)利要求7所述的SNP條形碼和/或相應(yīng)的數(shù)字條形碼在家養(yǎng)和/或野生生物個(gè)體身份識(shí)別和/或家養(yǎng)動(dòng)物肉產(chǎn)品溯源中的應(yīng)用；優(yōu)選在豬個(gè)體身份識(shí)別和/或豬肉產(chǎn)品溯源中的應(yīng)用。
9.一種豬個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品溯源方法，其特征在于包括備份豬樣本，待識(shí)別豬個(gè)體或待溯源的豬肉產(chǎn)品與對(duì)應(yīng)的備份豬樣本同時(shí)按照權(quán)利要求5所述的方法制作SNP條形碼和/或相應(yīng)的數(shù)字條形碼并進(jìn)行比對(duì)，從而確認(rèn)豬個(gè)體身份或豬肉產(chǎn)品來源。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的豬個(gè)體身份識(shí)別或豬肉產(chǎn)品溯源方法，其特征在于所述的豬樣本為豬毛發(fā)毛囊或組織樣本或血樣。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的條形碼編制方法及其應(yīng)用。一種用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的條形碼編制方法，選擇待識(shí)別動(dòng)物或待溯源肉產(chǎn)品基因組DNA上的高雜合度的SNP位點(diǎn)并組合成SNP條形碼，然后用十種阿拉伯?dāng)?shù)字0～9隨機(jī)唯一的替代SNP條形碼中的10種SNP基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相應(yīng)的數(shù)字條形碼，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物個(gè)體身份與條形碼的一一對(duì)應(yīng)。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)PCR引物，獲得高雜合度的SNP位點(diǎn)，編制用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別和/或肉產(chǎn)品溯源的SNP條形碼及/或相應(yīng)的數(shù)字條形碼，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別或肉產(chǎn)品溯源。
文檔編號(hào)G06K19/06GK102682322SQ20121013723
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者施振旦, 朱振坤, 王曉曉, 胡肄農(nóng), 趙慶順, 邢光東, 顧洪如 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院