專利名稱：奶牛隱性乳房炎診斷試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奶牛隱性乳房炎診斷試劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
奶牛隱形乳房炎因無肉眼可見的臨床癥狀，容易被人們忽視。但發(fā)病率較高，且易于轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎。據(jù)美國報(bào)道，一般48-49％的奶?；加须[形乳房炎。國內(nèi)由于管理水平及衛(wèi)生條件較差，情況更為嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)65-70％以上，患牛奶產(chǎn)量及質(zhì)量顯著降低，故其危害性特大。
在隱性乳房炎牛的奶汁中，除了組成成分及理化性狀理化性質(zhì)改變的同時。體細(xì)胞數(shù)也大量增加。目前使用的診斷方法多檢查其體細(xì)胞數(shù)。直接鏡檢法工作量大而費(fèi)時。奶汁體細(xì)胞自動計(jì)數(shù)儀成本高。因此，多采用間接法以了解其體細(xì)胞增數(shù)范圍。間接法自30年代起應(yīng)用，經(jīng)過改進(jìn)，到50年代后期創(chuàng)立了美國加州乳房炎試驗(yàn)法(CMT)。以后各國多采用CMT或自創(chuàng)改良的方法。國內(nèi)研究奶牛乳房炎起步較晚。80年代始有報(bào)道，如蘭州中獸醫(yī)研究所研制的蘭州乳房炎診斷液(LMT)。北京的BMT、上海的SMT等。但以上諸種均為溶液或濃縮液，運(yùn)輸和貯存不方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種奶牛隱性乳房炎診斷試劑及其制備方法。
奶牛隱性乳房炎診斷試劑含有190-210份十二烷基硫酸鈉、50-70份硼砂、47-49份硼酸和1份溴鉀酚紫。
奶牛隱性乳房炎診斷試劑的制備方法是將50-70份硼砂、47-49份硼酸和1份溴鉀酚紫混合均勻，再與190-210份十二烷基硫酸鈉混合均勻，即成淡黃色固體粉末。
本發(fā)明試劑和CMT相同可以間接測定牛奶的體細(xì)胞含量，操作簡便，可以在現(xiàn)場進(jìn)行檢測，特別是其粉劑具有更多的優(yōu)點(diǎn)，如體積小，重量輕，便于攜帶和貯存等，極其適合進(jìn)行大批量檢測之用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將50份硼砂、47份硼酸和1份溴鉀酚紫混合均勻，再與190份十二烷基硫酸鈉混合均勻，即成淡黃色固體粉末。將該粉末分裝在塑料瓶中，每瓶含粉末15.45克，備用。
使用前將1瓶中的粉末溶于溫?zé)崴?，最終體積為500毫升，pH為7.3～7.5，此液體可用于奶牛隱性乳房炎的診斷。
實(shí)施例2將70份硼砂、49份硼酸和1份溴鉀酚紫混合均勻，再與210份十二烷基硫酸鈉混合均勻，即成淡黃色固體粉末。將該粉末分裝在塑料瓶中，每瓶含粉末15.45克，備用。
使用前將1瓶中的粉末溶于溫?zé)崴?，最終體積為500毫升，pH為7.3～7.5，此液體可用于奶牛隱性乳房炎的診斷。
實(shí)施例3將硼酸(上海光鏵科技有限公司產(chǎn)品)240克，硼砂(江蘇太倉化工二廠產(chǎn)品)300克和溴鉀酚紫(上海三思試劑有限公司產(chǎn)品)5克混合均勻，再和十二烷基硫酸鈉(廈門星隆達(dá)(Sanland)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)1000克混合均勻，即成淡黃色固體粉末。將該粉末分裝在塑料瓶中，每瓶含粉末15.45克，備用。
使用前將1瓶中的粉末溶于溫?zé)崴校罱K體積為500毫升，pH為7.3～7.5，此液體可用于奶牛隱性乳房炎的診斷。
實(shí)施例4三種奶牛隱性乳房炎診斷方法的的比較一、材料與方法(一)試劑和儀器1、本發(fā)明奶牛乳房炎診斷固體粉劑，臨用前用蒸餾水溶解成500毫升的溶液。
2、美國加州乳房炎診斷劑(CMT)，為1品脫原裝濃縮液，根據(jù)用法說明，以蒸餾水按1∶7稀釋應(yīng)用。
3、乳房炎塑料診斷盤。
4、定量加樣器。
5、Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器，ZM型，英國Coulter公司制造。使用100微米孔經(jīng)管，根據(jù)儀器說明書調(diào)節(jié)儀器。一次計(jì)數(shù)的進(jìn)樣量為100微升。
6、Somafix試劑和Somaton試劑，Coulter公司出品。
7、100微升定量移液器附塑料吸頭。
8、100℃和65℃水浴箱各1只。
(二)試驗(yàn)方法1、奶樣采集奶樣采自本校及杭州市五福、定海、四季青4個奶牛場。每個乳區(qū)取前乳15毫升于試管中，加蓋橡皮塞后，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行檢查。
2、本發(fā)明試劑和CMT檢查在乳房炎塑料診斷盤的兩個圓盤中各加2毫升奶樣，再分別加入2毫升本發(fā)明試劑和CMT試劑，然后搖動診斷盤，觀察判定反應(yīng)等級。
反應(yīng)等級判定標(biāo)準(zhǔn)陰性(-)均勻混合，不出現(xiàn)任何沉淀。
可疑(T)微量極細(xì)顆粒，搖動后則消失。
弱陽性(+)少量粘性沉淀，搖動時流動性大，不成膠狀。
陽性(++)沉淀多，呈膠狀。搖動時沉淀物有附著感，并向中心聚集，強(qiáng)陽性(+++)迅速呈膠狀，搖動時向中心聚集，呈中心凸起，粘稠性大，粘著盤底。
3、牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)按儀器說明書進(jìn)行；具體操作步驟如下(1)固定體細(xì)胞膜首先在試管中加4滴Somafix試劑，再加入10毫升奶樣，置電動混合器上將奶樣和試劑混合均勻試管加蓋有小孔的橡皮塞；然后置于60℃水浴中加熱5分鐘，取出后讓它自行冷卻至室溫。(2)破壞脂肪球先在干凈的試管中加入10毫升Somaton試劑，再用定量加樣器加入已固定細(xì)胞膜的奶樣100微升。試管加蓋帶有小孔的橡皮塞后，放在80℃水浴中加熱10分鐘取出，待自行冷卻至室溫。(3)體細(xì)胞計(jì)數(shù)將經(jīng)過上述處理的樣品倒入10毫升的小燒杯中，放到Coulter計(jì)數(shù)器上測定，每份樣品檢測兩次，結(jié)果取其平均值。
每毫升體細(xì)胞數(shù)＝200×(儀器讀數(shù)-空白計(jì)數(shù))二、結(jié)果(一)本發(fā)明試劑反應(yīng)等級和體細(xì)胞數(shù)的關(guān)系。應(yīng)用本發(fā)明試劑和Coulter體細(xì)胞計(jì)數(shù)器同時檢測了797份奶樣。經(jīng)過顯著性檢驗(yàn)，梯度極為顯著(P＜0.001＝，說明本發(fā)明試劑的反應(yīng)等級隨乳中體細(xì)胞數(shù)目的增加而升高。本發(fā)明試劑各等級奶樣的體細(xì)胞含量見表1。
表1 本發(fā)明試劑各個等級奶樣的體細(xì)胞含量


(二)本發(fā)明試劑與CMT對比試驗(yàn)。其結(jié)果見表2。通過卡方檢驗(yàn)，兩種方法測定的各反應(yīng)等級的例數(shù)無顯著差異(P＞0.05)表2 本發(fā)明試劑和CMT對比試驗(yàn)結(jié)果

*有17份奶樣因數(shù)量太少，未作CMT檢查。
三、討論(一)奶?；既榉垦讜r，大量的炎癥細(xì)胞向患病乳區(qū)聚集，從而使乳中的體細(xì)胞數(shù)增加，其數(shù)量多少可以反映患病的程度嚴(yán)重與否。本次試驗(yàn)是應(yīng)用比較先進(jìn)精確的Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器來測定奶樣中的體細(xì)胞數(shù)目。這種儀器的檢測過程和原理是牛奶經(jīng)過處理，體細(xì)胞即懸浮在電解質(zhì)溶液中；將處理過的樣品放入計(jì)數(shù)器后，裝于儀器內(nèi)部的定量進(jìn)樣機(jī)件即使適量的樣品流經(jīng)一個特殊的小孔戶這種小孔的兩邊各裝有一個鉑電極，兩個電極之間有桓流電流通過。體細(xì)胞的電阻較大，當(dāng)它經(jīng)過小孔時，就會形成脈沖電壓，對儀器的計(jì)數(shù)電路發(fā)生作用，使它工作，進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將結(jié)果顯示出來。Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，目前在一些發(fā)達(dá)國家已被廣泛應(yīng)用。
(二)由表1中所列的結(jié)果可以看出，本發(fā)明試劑測定為-、T、+、++、+++各級的奶樣含有體細(xì)胞數(shù)分別平均每毫升為78,000、277,000、758,000、1,930,000和6,590,000。按Schalm等所制定的標(biāo)準(zhǔn)，CMT各級每毫升含有的體細(xì)胞數(shù)應(yīng)為0-2000,000,150,040-500,000、400,000-1,500,000、800,000-5,000,000和＞5,000,000。由此可見，本次試驗(yàn)應(yīng)用本發(fā)明試劑測定的各個等級奶樣每毫升所含體細(xì)胞的均數(shù)都在CMT相應(yīng)等級應(yīng)有的體細(xì)胞數(shù)范圍之內(nèi)。表2中的數(shù)值表明，本發(fā)明試劑和CMT兩種方法測定出的各個等級樣品的份數(shù)基本一致，與以前所作對比試驗(yàn)結(jié)果相等。因此可以證明HMT粉劑的檢測性能與CMT相同，作為快速診斷奶牛隱沒乳房炎的試劑，完全可以代替后者使用。
(三)按照國際奶牛聯(lián)合會的規(guī)定，每毫升中牛奶中的體細(xì)胞數(shù)超過50萬者，即為乳房炎患奶，應(yīng)加以處理或不供食用。一些發(fā)達(dá)國家對這一規(guī)定已遵照執(zhí)行。為了保護(hù)人體健康，我國必格制定相應(yīng)的規(guī)定，并嚴(yán)格貫徹執(zhí)行。本發(fā)明試劑和CMT相同可以間接測定牛奶的體細(xì)胞含量，操作簡便，可以在現(xiàn)場進(jìn)行檢測，特別是其粉劑具有更多的優(yōu)點(diǎn)，如體積小，重量輕，便于攜帶和貯存等，極其適合進(jìn)行大批量檢測之用。
四、結(jié)論本發(fā)明試劑測定的奶樣等級隨乳中體細(xì)胞數(shù)的增加而升高。本發(fā)明試劑測定的各個等級奶樣的體細(xì)胞含量與應(yīng)用美國原裝CMT試劑檢測的基本一致。因此，本發(fā)明試劑完全可以代替CMT用作快速檢驗(yàn)乳房炎的試劑。
權(quán)利要求
1.一種奶牛隱性乳房炎診斷試劑，其特征在于，它含有190-210份十二烷基硫酸鈉、50-70份硼砂、47-49份硼酸和1份溴鉀酚紫。
2.一種奶牛隱性乳房炎診斷試劑的制備方法，其特征在于，將50-70份硼砂、47-49份硼酸和1份溴鉀酚紫混合均勻，再與190-210份十二烷基硫酸鈉混合均勻，即成淡黃色固體粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶牛隱性乳房炎診斷試劑及其制備方法。它將50－70份硼砂、47－49份硼酸和1份溴鉀酚紫混合均勻，再與190－210份十二烷基硫酸鈉混合均勻，即成淡黃色固體粉末。取該粉末15.45克溶解于500毫升水中，形成一種紫紅色的液體，可用于診斷奶牛的隱性乳房炎。本發(fā)明試劑和CMT相同可以間接測定牛奶的體細(xì)胞含量，操作簡便，可以在現(xiàn)場進(jìn)行檢測，特別是其粉劑具有更多的優(yōu)點(diǎn)，如體積小，重量輕，便于攜帶和貯存等，極其適合進(jìn)行大批量檢測之用。
文檔編號G06M11/04GK1724998SQ200510049389
公開日2006年1月25日 申請日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日
發(fā)明者胡松華, 朱平民, 蔣次升 申請人:浙江大學(xué)