通用抗原修復(fù)化合物及其使用方法
【專利摘要】用于含醛交聯(lián)劑固定的組織中抗原修復(fù)和氨基酸、肽和蛋白質(zhì)或其上表位檢測(cè)改善的抗原修復(fù)劑化合物、混合物和制劑以及方法。固定組織與除醛劑溶液接觸引起與醛的反應(yīng)活性，由此修復(fù)抗原并改善對(duì)氨基酸、肽和蛋白質(zhì)或表位的檢測(cè)。還提供試劑盒，其中包含抗原修復(fù)劑，可選的用于染色或檢測(cè)所述蛋白質(zhì)或抗原或表位的組分，以及試劑盒使用說明。還提供鑒定抗原修復(fù)劑的方法。將固定蛋白質(zhì)與待測(cè)試劑接觸并一同在溶液中加熱。質(zhì)譜法檢得蛋白質(zhì)峰表示待測(cè)試劑是抗原修復(fù)劑。
【專利說明】通用抗原修復(fù)化合物及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C§119(e)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/037,905(申請(qǐng)日：2014年8月15 日，已放棄)和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/915,271(申請(qǐng)日：2013年12月12日，已放棄）的優(yōu)先權(quán)，本申 請(qǐng)通過援引吸納上述兩臨時(shí)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容。
[0003] 聯(lián)邦資助說明
[0004] 本發(fā)明得到國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)給予的第 1R15AG039008-01號(hào)政府資助。政府對(duì)本發(fā)明擁有一定的權(quán)利。
[0005]發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明主要涉及組織學(xué)，涉及經(jīng)含醛交聯(lián)劑（即基于醛的交聯(lián)劑)保存的組合物或 組織中蛋白質(zhì)的檢測(cè)。具體地說，本發(fā)明提供一種抗原修復(fù)的方法，其中用除醛劑來修復(fù)組 合物或組織中因醛類固定劑而化學(xué)改性的蛋白質(zhì)。
[0007] 相關(guān)技術(shù)說明
[0008] 臨床病理實(shí)驗(yàn)室用于保存生物材料的常用固定劑有多種，例如戊二醛、甲醛和丙 酮及其他有機(jī)溶劑。然而，大多數(shù)固定過程用到含醛交聯(lián)劑，如甲醛和戊二醛。固定劑溶液 一般為含水甲醛溶液，其中含有鈉的磷酸鹽，配制成具有緩沖能力且大致等滲的溶液，所述 緩沖能力在加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿后以盡可能小的波動(dòng)將pH穩(wěn)定在PH7.2-7.6。固定溶液將 甲醛或戊二醛加到蛋白質(zhì)的多種基團(tuán)上，例如胺族基團(tuán)、酚類基團(tuán)、硫醇類基團(tuán)和羥基類基 團(tuán)，由此先形成一系列可逆修飾，包括亞胺、烯胺、羥基亞甲基和兩個(gè)胺族基團(tuán)之間的亞甲 基交聯(lián)。隨著甲醛固定的繼續(xù)，會(huì)形成蛋白質(zhì)分子之間或之內(nèi)可逆的分子間和分子內(nèi)交聯(lián)， 由此形成致密的網(wǎng)絡(luò)，這會(huì)妨礙石蠟滲透或/和與抗體分子的接觸。結(jié)果，目標(biāo)抗原可能被 可逆甚至非可逆的掩蔽，或者表位因與含醛固定劑反應(yīng)而化學(xué)改性或破壞。
[0009] 盡管已有多種免疫組化蛋白質(zhì)法和分析蛋白質(zhì)法被廣泛并高實(shí)用性地用于純化 蛋白、蛋白質(zhì)提取物、細(xì)胞或組織樣本，仍迫切需要進(jìn)一步的改進(jìn)。所述改進(jìn)可以是關(guān)于例 如更溫和的細(xì)胞或組織固定、抗原修復(fù)或/和結(jié)果再現(xiàn)性的改進(jìn)、以及標(biāo)準(zhǔn)程序(例如甲醛 固定）中受損的相應(yīng)抗原或表位上抗體應(yīng)用的改進(jìn)。
[0010] 因此，本領(lǐng)域公認(rèn)需要更好方法來消除蛋白質(zhì)掩蔽和修復(fù)抗原。尤其，現(xiàn)有技術(shù)缺 乏這樣的方法和化合物:它們易于經(jīng)設(shè)置或配制用來逆轉(zhuǎn)固定組織中與蛋白質(zhì)發(fā)生的醛反 應(yīng)，具體通過逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)中胺族基團(tuán)（amine groups)上亞胺、稀胺、亞甲基羥基的形成、逆 轉(zhuǎn)氨基之間亞甲基交聯(lián)的形成、以及蛋白質(zhì)上其他可逆醛改性。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了本領(lǐng)域長(zhǎng)期 以來的上述需求。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明是關(guān)于一種針對(duì)用含醛交聯(lián)劑固定的組織修復(fù)抗原并改善氨基酸、肽和蛋 白質(zhì)檢測(cè)的方法。本發(fā)明方法包括:第一步，制備除醛劑溶液。然后，使得用含醛交聯(lián)劑固定 的組織與該溶液接觸;其中，除醛劑與包含交聯(lián)劑的醛類之間反應(yīng)從而修復(fù)固定組織中的 抗原并改善固定組織中氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。由于醛和醛加合物以可逆平衡的狀態(tài) 存在于固定組合物或組織，加熱和最佳pH條件下，除醛劑能使平衡向釋放醛的方向移動(dòng)，由 此去除可逆醛加合物，于是消除蛋白質(zhì)掩蔽。本發(fā)明一種相關(guān)方法進(jìn)一步包括加熱溶液至 約60°C至約125°C，在醛與醛加合物之間達(dá)成可逆平衡。本發(fā)明另一種相關(guān)方法還包括通過 組織染色來檢測(cè)去掩蔽的蛋白質(zhì)或抗原或其所含表位。
[0013] 本發(fā)明還涉及可用于上述方法的制劑，其為包含化合物或化合物之混合物的溶 液。所述化合物可以是除醛劑或除醛劑的混合物。所述制劑包含除醛劑，可選的非離子表面 活性劑和穩(wěn)定劑，它們包含于熱溶液中，濃度為與掩蔽蛋白反應(yīng)的有效濃度。
[0014] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其中包含抗原凈化劑化合物和/或制劑，可用于本發(fā)明 的抗原修復(fù)方法。所述試劑盒還包含染色劑、染料、抗體或能用于檢測(cè)去掩蔽蛋白質(zhì)、肽、表 位或抗原的其他組分，還包含試劑盒的使用說明。
[0015] 本發(fā)明還涉及用本文所述制劑來減少組織中加熱所致自體熒光的方法。本發(fā)明還 涉及在蛋白質(zhì)去掩蔽之后增強(qiáng)熒光強(qiáng)度且同時(shí)用溶液中本文所述可選的非離子表面活性 劑對(duì)石蠟包埋樣品去石蠟的方法。
[0016] 本發(fā)明還涉及鑒定抗原修復(fù)劑的方法。該方法中，于含水溶液中用含醛交聯(lián)劑固 定蛋白質(zhì)，將所得溶液凍干，得到固定蛋白質(zhì)。將固定蛋白質(zhì)加入含有待定是否為抗原修復(fù) 劑的化合物的溶液，加熱含有所述待定化合物和固定蛋白質(zhì)的溶液。用質(zhì)譜法檢測(cè)該蛋白 質(zhì)，檢出該蛋白質(zhì)則表明待定物質(zhì)是抗原修復(fù)劑。
[0017] 后文將述及目前認(rèn)為優(yōu)選的實(shí)施方式，僅以公開為目的，從中可看出本發(fā)明還包 含其他內(nèi)容、特征和優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0018] 籍此，可以獲知并詳細(xì)了解如上所述本發(fā)明特征、優(yōu)點(diǎn)和目的以及其他內(nèi)容如何 展現(xiàn)，對(duì)于以上所概括本發(fā)明更具體的描述可能需要結(jié)合附圖中展示的【具體實(shí)施方式】。這 些附圖是本申請(qǐng)說明書的一部分。然而，附圖所示為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不構(gòu)成本發(fā)明 實(shí)施方式范圍的限制。
[0019] 圖1A-1B展示含取代馬來酸酐（圖1A)和馬來酸或(Z)-2-丁烯二酸（圖1B)的基本結(jié) 構(gòu)。
[0020] 圖2A-2D顯示膠原IV的抗原修復(fù)和免疫檢測(cè)。對(duì)多聚甲醛固定的組織進(jìn)行抗原修 復(fù)，采用TBST(圖2A)，低pH(6.0)檸檬酸鈉（圖2B)，胃蛋白酶預(yù)處理（圖2C)和0.05%馬來酸 酐預(yù)處理（圖2D)。
[0021] 圖3A-3C顯示免疫組化分析所見固定組織中的抗原修復(fù)。用免疫熒光檢看多聚甲 醛固定組織的冷凍切片（圖3A)，用免疫熒光檢看甲醛固定的石蠟包埋組織（圖3B)，用免疫 組化法和DAB發(fā)色團(tuán)檢看甲醛固定的石蠟包埋組織（圖3C)。
[0022]圖4A-4E是固定脈管組織中采用馬來酸（圖4A)、馬來酸酐（圖4B)、2，3-二甲基馬來 酸酐（圖4C)、富馬酸（圖4D)和琥珀酸（圖4E)的抗原修復(fù)比較。
[0023] 圖5A-5D顯示內(nèi)皮素-1(圖5A)、VEGF(圖5B)、馮?威利布蘭德因子（von Wi 1 lebrand)(圖5C)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和膠原IV兩者（圖的修復(fù)。
[0024]圖6A-6B顯示隨馬來酸濃度升高，經(jīng)加熱固定腦組織勻漿中測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度（圖 6A)，與之相比，斑點(diǎn)雜交顯示的GAPDH對(duì)應(yīng)升高（圖6B)。
[0025]圖7中的顯微圖像顯示多聚甲醛固定的成人腦組織經(jīng)抗原修復(fù)后其中血管的膠原 IV染色。
[0026]圖8A-8B中的顯微圖像顯示與僅用0.05%抗壞血酸（圖8A)相比，添加非離子表面 活性劑Triton X-100令抗原修復(fù)后熒光增強(qiáng)（圖8B)。
[0027]圖9 A-9 C中的顯微圖像顯示與不加5 %抗壞血酸的非加熱組織（圖9 A)和經(jīng)加熱組 織（圖9B)相比，加有5%抗壞血酸的經(jīng)加熱組織中自體熒光降低（圖9C)。
[0028]圖10A-10C顯示多聚甲醛固定的石蠟包埋腦組織脫蠟:加熱至70°C，約30分鐘，溶 液中加2.8mM谷胱甘肽（圖10A)，5%抗壞血酸（圖10B)和2.8mM谷胱甘肽+5 %抗壞血酸（圖 10C)〇
[0029] 圖11A-11L顯示經(jīng)福爾馬林處理的血管緊張肽-I(圖11A-11B)抗原修復(fù)效果的質(zhì) 譜圖，采用的是pH=3.5的水(圖llC)，pH=5.5的水(圖11D)，5%咪唑啉酮(圖11E)，5%檸檬 酸（圖 11F)，5%胍（圖 11G)，5% 馬來酸（圖 11H)，5% 的 Tris 緩沖液，pH=3.5(圖 111)，5%抗 壞血酸（圖11J)，5%羥胺（圖11K)和5%半胱氨酸（圖11L)。
[0030] 圖12A-12D顯示經(jīng)福爾馬林處理的ACTH(圖12A)抗原修復(fù)效果的質(zhì)譜圖，采用的是 5%馬來酸（圖12B)，5%抗壞血酸（圖12C)和水（圖12DKACTH經(jīng)福爾馬林室溫下處理48小 時(shí)。
[0031]發(fā)明詳述
[0032]本文中，以下詞匯和表述的含義如下所述。充分另作說明，本文中的科技術(shù)語(yǔ)的含 義即本領(lǐng)域技術(shù)人員通識(shí)所知。
[0033] 本文中，單數(shù)形式涵蓋復(fù)數(shù)含義。權(quán)利要求中，"包含/包括"之類表述后的單數(shù)形 式表示單數(shù)或復(fù)數(shù)。本文中，"另一"或"其他"可以表示就某一權(quán)利要求元素或組分而言相 同或不同的第二份或第二種或更多份、更多種。"包含/包括"等涵蓋性開放式限定表示可含 有更多元素。
[0034] 本文中，權(quán)利要求中的"或"表示"和/或"，除非明示單選或選項(xiàng)間彼此排斥(盡管 本申請(qǐng)公開的內(nèi)容既支持單選也支持"和/或"）。
[0035] 本文中，"約"表示數(shù)值含義，包括例如數(shù)字、分?jǐn)?shù)和百分比，無(wú)論是否明示。"約"一 般表示本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解為與明示數(shù)值等效(例如功能或結(jié)果相同）的一定范圍內(nèi) 的數(shù)值(例如明示值的+/-5-10 % )。有時(shí)，"約"還可以包括與舍入所得有效數(shù)字最接近的舍 入前數(shù)值。
[0036] 本文中，"去掩蔽"指固定組織中抗原修復(fù)和/或改善其中氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的檢 測(cè)。
[0037] 本發(fā)明實(shí)施方式之一中，提供的是固定組織中抗原修復(fù)和改善其中氨基酸、肽和 蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法，其步驟包括:制備除醛劑溶液;使得用含醛交聯(lián)劑固定的組織與所述溶 液接觸;其中，除醛劑與包含交聯(lián)劑的醛反應(yīng)從而修復(fù)固定組織中的抗原并改善固定組織 中氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
[0038] 繼此實(shí)施方式，該方法還可包括將溶液加熱至約60°C至約125°C約30分鐘至約48 小時(shí)，在此溫度，醛與醛加合物之間存在可逆平衡。該進(jìn)一步實(shí)施方式中，這些化合物的溶 液降低了加熱后組織中的自體熒光。繼此實(shí)施方式，該方法還可包括對(duì)組織進(jìn)行染色來檢 測(cè)被修復(fù)的蛋白質(zhì)或抗原或其所包含的表位。
[0039] 各種實(shí)施方式中，除醛劑溶液的濃度為約0.05 %至約30 %。并且，溶液的pH維持在 視具體除醛劑而定的一定范圍內(nèi)。此外，各種實(shí)施方式中，代表性的含醛交聯(lián)劑可以是甲醛 或戊二醛。除醛劑可見表1所列，但不限于此。具體地說，所述化合物可以是:氨基乙醇，N-甲 基氨基乙醇，2-(羥甲基)哌啶，2-(羥甲基)吡咯烷，N-芐基氨基乙醇，亞氨基(二乙醇），2_氨 基-2-甲基-1，3-丙二醇;絲氨酸，蘇氨酸，殼聚糖，三(羥甲基)氨基甲烷，精氨酸，賴氨酸，甘 氨酸，組氨酸，5-羥色氨酸，肌肽，胍，嗎啉，2-(羥甲基)哌啶，氨，碳酸銨，羥胺，0-烷基化羥 胺，N-烷基化羥胺，0，N-烷基化羥胺，羥甲基胺，甲氧基胺，二丁胺，三亞乙基四胺，芐胺，噻 苯咪唑（thiabendazole )，苯并三唑，三唑，二氫吲噪，苯并胍胺，3，4_二氨基苯甲酸，4-氨基 苯甲酸甲酯，苯胺；1-氨基-2-吲哚;聚氧化烯胺;聚酰胺型胺，鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸 甲酯，鄰氨基苯甲酰胺；鄰苯二胺;4-氨基苯甲酸；3,4_二氨基苯甲酸;肼，N-甲基肼，N-苯 肼，甲基酰肼，2，4-二硝基苯基酰肼，脲，尿囊素，咪唑啉酮，苯巴比妥，甘脲，雙縮脲，半胱 胺，半胱氨酸，谷胱甘肽，亞硫酸氫鈉，對(duì)巰基苯甲酰胺，丙二酰胺，草酰胺，乙酰乙酰胺，草 酰胺，焦谷氨酸，琥珀酰胺，乙二胺-N，N'_二乙酰乙酰胺，N-(2-乙基己基）乙酰乙酰胺，N-(3-苯丙基）乙酰乙酰胺，聚酰胺；聚酰胺酯，山梨糖醇，己二醇，葡萄糖，纖維素，羥基香茅 醇，雙甲酮，抗壞血酸，戊二酮，2-丁酮，環(huán)己酮，2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮，2-戊 酮，5，5-二甲基-1，3-環(huán)己二酮，脫氫乙酸，1，3-二羥基丙酮二聚體，沒食子酸甲酯，沒食子 酸乙酯，沒食子酸丙酯，焦掊酚，水楊酰胺；水楊酰苯胺;4，5-二羥基-2，7-萘二磺酸，檸康 酸，馬來酸酐，2，3-二甲基馬來酸酐，1 (E)-2-丁烯二酸二甲酯，2-硫烷基丁-2-烯二酸，丁_ 2-稀二酸，（E)-3_硝基丙-2-稀酸酯，（E)-2,3_二氖化丁-2-稀二酸，（Z)-2_甲氧基丁-2-稀 二酸，（Z)-2-過氧羥基丁-2-烯二酸，2-甲氧基丁-2-烯二酸，（Z)-2-氟丁-2-烯二酸酯，4-氧 代戊 _2_稀酸，（E)-2,3_二氯丁-2-稀二酸，二氯馬來酸，（Z)-2_碘代丁-2-稀二酸，（E)-2,3-二氖化丁 _2_稀二酸，（Z)-2_羥基-3-甲基丁-2-稀二酸，2,3-二氖化丁-2-稀二酸，（E)-3_硝 基丁 _2_稀酸，丁-2-稀二酸酯或鹽，（E)_4_氯-4-氧代丁-2-稀酸酯或鹽，（E)-2,3-二氟丁-2_烯二酸酯或鹽，（E)-4-羥基-4-氧代丁-2-烯酸酯或鹽，氫富馬酸酯或鹽（hydrogen 作111&瓜〖6)，（2)-2-硫烷基丁-2-稀二酸，2,3-二氣富馬酸，化)-4-羥基-2-甲基-4-氧代丁-2_烯酸酯或鹽，一氟代富馬酸酯或鹽，氟代富馬酸，（Z)-2-氯丁-2-烯二酸，2-過氧羥基丁-2-稀二酸，過氧馬來酸，2-氯_3_甲基丁 _2_稀二酸，2-氯_3_甲基丁 _2_稀二酸，2-丁稀二酸， [(E)-3-羧基-1-羥基亞丙-2-烯基]氧鑰，（E)-2-甲基丁-2-烯二酸酯或鹽，2-甲基富馬酸 酯/鹽，檸康酸，2,3_二氯馬來酸，3,4_二氯-5-羥基呋喃-2(5H)_酮，3-氯羰基丙烯酸乙酯， (E)-4-氧代戊-2-烯酸乙酯，[(Z)-3-羧基丙-2-烯酰]氧鑰，（Z)-丁-2-烯二酸，馬來酸二甲 酯，富馬酸二甲酯；活性碳，氧化鋁；二氧化硅;胺官能化的二氧化硅;滑石;沸石；或多官能 有機(jī)物，其中既具有伯胺或仲胺基團(tuán)又具有羧酸、酚、酰胺、羥基、脲、酯或巰基基團(tuán)，至少其 中之一會(huì)與醛反應(yīng);環(huán)糊精;或上述化合物的各種組合。
[0040] 各種實(shí)施方式中，除醛劑溶液還可含有約0.1%至約5%的非離子表面活性劑用于 石蠟包埋樣品脫蠟和增強(qiáng)抗原修復(fù)后的熒光強(qiáng)度。非離子表面活性劑的代表性例子包括但 不限于：聚西托醇1000(Cetomacrogo 1 1000)，鯨蠟硬脂醇，鯨蠟醇，椰油酰胺二乙醇胺，椰 油酰胺單乙醇胺，癸基葡糖苷，IGEPAL CA-630，異鯨蠟醇聚醚-20(Isoceteth-20)，月桂基 葡糖苷，NP-40，Nonidet P-40，壬苯醇醚-9，壬苯醇醚，月桂酸單甘油酯，八乙二醇單十二烷 基醚，油醇，泊洛沙姆，泊洛沙姆407,聚甘油聚蓖麻油酸酯，聚山梨酸酯，脫水山梨醇單硬脂 酸酯，脫水山梨醇三硬脂酸酯；硬脂醇;Triton X-10;吐溫80;辛基-、癸基、十二烷基-吡喃 葡萄糖苷或-麥芽糖苷和脫氧膽酸。
[0041] 這些實(shí)施方式中，溶液中還可包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑的代表性例子包括但不限于:防 腐劑，抗真菌劑，抗細(xì)菌劑，染料，顏料，陰離子洗滌劑，金屬鹽，抗氧化劑，或它們的各種組 合。優(yōu)選實(shí)施方式之一中，穩(wěn)定劑是谷胱甘肽，濃度約2mM至約400mM。
[0042] 本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供的是一種制劑，其中，于溶液中含有一種化合物或多 種化合物的混合物、可選的非離子表面活性劑和穩(wěn)定劑(如上所述），它們包含在熱溶液中， 濃度為與掩蔽蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的有效濃度，pH范圍取決于作為有效除醛劑的具體化合物， 所處溫度使醛與醛加合物之間形成平衡或加速達(dá)到所述平衡。尤其，所述制劑可于含水溶 液中含有所述化合物或化合物混合物，濃度約〇. 05%至約30%，可選地還含有非離子表面 活性劑，濃度約0.1至約5%，以及穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑例如但不限于：防腐劑，抗真菌劑，抗細(xì)菌 劑，染料，顏料，陰離子洗滌劑，金屬鹽，抗氧化劑或其組合。
[0043] 本發(fā)明另一實(shí)施方式提供的是用于修復(fù)固定組織中目標(biāo)蛋白質(zhì)的試劑盒，其中包 含除醛劑(如前文所述），可選的非離子表面活性劑(如前文所述），穩(wěn)定劑(如前文所述），染 色劑，染料或抗體，以及該試劑盒的使用說明。
[0044] 本發(fā)明另一實(shí)施方式提供的是鑒定抗原修復(fù)劑的方法，其步驟包括:于含水溶液 中用含醛交聯(lián)劑固定蛋白質(zhì)，將所得溶液凍干，得到固定蛋白質(zhì);將固定蛋白質(zhì)加入含有待 定是否為抗原修復(fù)劑的化合物的溶液里;加熱含有所述待定化合物和固定蛋白質(zhì)的溶液； 用質(zhì)譜法檢測(cè)該蛋白質(zhì);檢出代表該蛋白質(zhì)的峰則表明待定物質(zhì)是抗原修復(fù)劑。該實(shí)施方 式中，所述含醛交聯(lián)劑包含約4%甲醛的水溶液。所述溶液加熱至約60°C至約125°C約30分 鐘至48小時(shí)。
[0045] 本文中提供了可用于對(duì)含醛交聯(lián)劑固定的組織中被掩蔽蛋白質(zhì)進(jìn)行去掩蔽和檢 測(cè)的方法、化合物和試劑盒。尤其，在特定pH范圍具有除醛劑功能的化合物都能夠用于抗原 修復(fù)。此類化合物具有對(duì)獲釋醛的反應(yīng)活性，所述獲釋醛來自固定劑與組織中蛋白質(zhì)在醛 固定時(shí)所成加合物的水解，反應(yīng)推動(dòng)醛與醛加合物之間的平衡向在組織中產(chǎn)生（甲）醛的方 向移動(dòng)。代表性可用化合物如表1所示。
[0046] 表 1



[0051 ]如實(shí)施例中所述，本文中的方法采用配制于溶液例如水溶液中、濃度約0.05 %至 30 %的化合物。在優(yōu)化pH范圍加熱固定組織能釋放出醛類，釋出的醛能與溶液中的化合物 反應(yīng)從而去除目標(biāo)蛋白質(zhì)上的掩蔽。制劑中可采用一種化合物或多種化合物的混合物。去 掩蔽后，可根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)，用選自以下所述的方法對(duì)一種或多種目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢查：染 色，免疫組化分析或組織病理學(xué)分析或其他本領(lǐng)域已知方法。
[0052] 在固定組織中，這些化合物能夠令蛋白質(zhì)（例如脈管蛋白）被明確檢出，同時(shí)保存 組織形態(tài)。并且，這些化合物能夠原位保留用常規(guī)核酸結(jié)合性染料(例如DAPI)進(jìn)行的DNA檢 測(cè)，由此能夠進(jìn)行組織病理學(xué)分析中的多色成像。
[0053] 因此，還提供了用于本文所述各種方法的新化合物及其制劑。制劑可含有可選的 非離子表面活性劑，這既能增強(qiáng)蛋白質(zhì)去掩蔽后的熒光強(qiáng)度又能去除石蠟包埋樣品的石 蠟，省略了另行脫蠟的步驟。非離子表面活性劑包括但不限于:聚西托醇1〇〇〇,鯨蠟硬脂醇， 鯨蠟醇，椰油酰胺二乙醇胺，椰油酰胺單乙醇胺，癸基葡糖苷，IGEPAL CA-630,異鯨蠟醇聚 醚-20，月桂基葡糖苷，NP-40，Nonidet P-40，壬苯醇醚-9，壬苯醇醚，月桂酸單甘油酯，八乙 二醇單十二烷基醚，油醇，泊洛沙姆，泊洛沙姆407，聚甘油聚蓖麻油酸酯，聚山梨酸酯，脫水 山梨醇單硬脂酸酯，脫水山梨醇三硬脂酸酯；硬脂醇;Triton X-10;吐溫80;以及辛基-、癸 基、十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麥芽糖苷和脫氧膽酸。
[0054] 本文中還提供了用于固定組織中蛋白質(zhì)去掩蔽的試劑盒。此類試劑盒可包含一種 或多種本文所述新型化合物或其制劑，以及抗體或其他用于檢測(cè)的試劑。此類試劑盒可實(shí) 現(xiàn)一步法抗原修復(fù)，可用于多種蛋白質(zhì)的檢測(cè)。用所述試劑盒，使用者可采用多種條件下保 存的固定組織，例如多聚甲醛、福爾馬林、乙醇或石蠟塊等條件下保存的固定組織，對(duì)這些 固定組織進(jìn)行簡(jiǎn)單的化學(xué)處理，然后用蛋白印跡、ELISA等定量技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。這 些應(yīng)用使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠?qū)Υ罅磕壳耙蚬潭▽?dǎo)致感應(yīng)性丟失而不能用于定量 分析的保存樣品進(jìn)行分析。
[0055] 以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的多種實(shí)施方式，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明任何意義上的限 制。
[0056] 實(shí)施例1
[0057] 化合物
[0058]能夠在特定pH范圍與醛反應(yīng)的代表性除醛劑包括但不限于:氨基乙醇衍生物，包 括:氨基乙醇，N-甲基氨基乙醇，2-(羥甲基)哌啶，2-(羥甲基）吡咯烷，N-芐基氨基乙醇，亞 氨基（二乙醇），2_氨基-2-甲基-1，3-丙二醇;絲氨酸，蘇氨酸，殼聚糖，三(羥甲基)氨基甲 烷，氨基酸及其衍生物，包括精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、組氨酸、5-羥色氨酸、肌肽，其他含胺 和含苯胺化合物，包括胍、嗎啉、2_(羥甲基)哌啶、氨、碳酸銨、羥胺、0-烷基化羥胺、N-烷基 化羥胺、〇，N-烷基化羥胺、羥甲基胺、甲氧基胺、二丁胺、三亞乙基四胺、芐胺、噻苯咪唑、苯 并三唑、三唑、二氫吲哚、苯并胍胺、3，4-二氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸甲酯、苯胺；1 _氨基_ 2_吲哚;聚氧化烯胺;聚酰胺型胺，鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸甲酯，鄰氨基苯甲酰胺;鄰 苯二胺;4-氨基苯甲酸;3,4_二氨基苯甲酸;肼和酰肼衍生物，包括:肼、N-甲基肼、N-苯肼、 甲基酰肼、2,4_二硝基苯基酰肼，脲衍生物，包括:脲、尿囊素、咪唑啉酮、苯巴比妥、甘脲、雙 縮脲，硫醇衍生物，包括:半胱胺、半胱氨酸、谷胱甘肽、亞硫酸氫鈉、鄰巰基苯甲酰胺，酰胺 衍生物，包括:丙二酰胺、草酰胺、乙酰乙酰胺、草酰胺、焦谷氨酸、琥珀酰胺、乙二胺-N，N'_ 二乙酰乙酰胺、N-(2-乙基己基）乙酰乙酰胺、N-(3-苯丙基）乙酰乙酰胺、聚酰胺;聚酰胺酯， 羥基化合物，包括：山梨糖醇、己二醇、葡萄糖、纖維素、羥基香茅醇，酮衍生物，包括:雙甲 酮、抗壞血酸、戊二酮、2-丁酮、環(huán)己酮、2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮、2-戊酮、5，5-二 甲基-1，3-環(huán)己二酮、脫氫乙酸、1，3_二羥基丙酮二聚體，酚衍生物，包括:沒食子酸甲酯、沒 食子酸乙酯、沒食子酸丙酯、焦掊酚、水楊酰胺;水楊酰苯胺;4，5-二羥基-2，7-萘二磺酸，酸 和酯衍生物，包括:馬來酸、檸康酸、馬來酸酐、2,3_二甲基馬來酸酐、1(Ε)-2-丁烯二酸二甲 酯、2-硫烷基丁_2_稀二酸、丁_2_稀二酸、（E)-3_硝基丙_2_稀酸酯或鹽、（E)_2，3-二氖化 丁-2-烯二酸、（Z)-2-甲氧基丁-2-烯二酸、（Z)-2-過氧羥基丁-2-烯二酸、2-甲氧基丁-2-烯 二酸、（Z)-2-氟丁-2-稀二酸酯、4-氧代戊-2-稀酸、（E)-2，3-二氯丁-2-稀二酸、二氯馬來 酸、（Z)-2-碘代丁-2-烯二酸、（E)-2,3-二氘化丁-2-烯二酸、（Z)-2-羥基-3-甲基丁-2-烯二 酸、2，3-二氖化丁-2-稀二酸、（E)-3_硝基丁-2-稀酸、丁-2-稀二酸酯或鹽、（E)-4_氯-4-氧 代丁-2-烯酸酯或鹽、（E)-2,3-二氟丁-2-烯二酸酯或鹽、（E)-4-羥基-4-氧代丁-2-烯酸酯 或鹽、氫富馬酸酯或鹽、（Z)-2-硫烷基丁-2-稀二酸、2,3-二氟富馬酸、(E)_4_羥基-2-甲基-4_氧代丁-2-烯酸酯或鹽、一氟富馬酸酯或鹽、氟代富馬酸、（Z)-2-氯丁-2-烯二酸、2-過氧 羥基丁-2-烯二酸、過氧馬來酸、2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸、2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸、2-丁 烯二酸、[(E)-3-羧基-1-羥基亞丙-2-烯基]氧鑰、（E)-2-甲基丁-2-烯二酸酯或鹽、2-甲基 富馬酸酯/鹽、朽 1康酸、2,3-二氯馬來酸、3,4-二氯-5-羥基咲喃-2(5H)_酮、3-氯羰基丙稀酸 乙酯、（E)-4_氧代戊-2-稀酸乙酯、[(Z)-3_羧基丙-2-稀酰]氧鐵、（Z)-丁-2-稀二酸、馬來酸 二甲酯、富馬酸二甲酯；固相材料，包括:活性碳，氧化鋁;二氧化硅;胺官能化的二氧化硅； 滑石;沸石;或多官能有機(jī)物，其中既具有伯(胺)或仲(胺)基團(tuán)又具有羧酸、羥基、脲、酚、酰 胺、酯或巰基基團(tuán)，至少其中之一能與醛反應(yīng);環(huán)糊精;或上述化合物的各種組合。
[0059] 實(shí)施例2
[0060]甲醛固定組織中的抗原修復(fù):一般方法
[0061 ]將少量的一種化合物或多種化合物的混合物（例如選自表1的化合物)加入水中， 濃度為0.05%。將此溶液加熱至約70°C至約95°C約30分鐘。由此發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)化學(xué) 表位的去掩蔽或修復(fù)。將甲醛固定的組織在此熱溶液中放置約30分鐘，然后進(jìn)行清洗。然后 可對(duì)組織進(jìn)行染色來檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，多聚甲醛固定組織中脈管蛋白膠原IV的 抗原修復(fù)和免疫檢測(cè)，用馬來酸酐效果最佳(圖2A-2D)。
[0062] 實(shí)施例3
[0063] 抗原修復(fù)與多種不同免疫組化分析法交叉相容
[0064] 本文所述抗原修復(fù)方法適用于多種形式的組織加工樣本，并增強(qiáng)這些樣本中蛋白 質(zhì)的可視性。顯微圖像顯示，用免疫熒光檢看，多聚甲醛固定的組織冷凍切片可視性增強(qiáng)， 采用DAB發(fā)色團(tuán)的免疫組化法檢看甲醛固定的石蠟包埋組織可視性增強(qiáng)（圖3A-3D)。
[0065] 實(shí)施例4
[0066] 以馬來酸、馬來酸酐和2,3-二甲基馬來酸酐作為抗原修復(fù)劑
[0067] 用琥珀酸酐作為校驗(yàn)。在如實(shí)施例1所述制備的化合物的溶液中加熱多聚甲醛固 定的組織樣本，檢看組織中的血管。馬來酸（圖4A)、馬來酸酐（圖4B)和2,3_甲基馬來酸酐相 關(guān)組織中，顯示抗原修復(fù)成功，血管可見（圖4C)。圖4D顯示采用這些化合物α、β雙鍵處的順 式構(gòu)型獲得的活性顯著高于用富馬酸處理所得活性，富馬酸含反式構(gòu)型，其活性顯著低。作 為對(duì)比，圖4Ε顯示琥珀酸酐處理的組織中未見脈管系統(tǒng)。這表明，就抗原修復(fù)而言，順式構(gòu) 型為優(yōu)。
[0068] 實(shí)施例5
[0069] 成年小鼠腦組織中采用馬來酸酐的脈管抗原修復(fù)
[0070] 12月齡的C57黑色6J小鼠和六月齡的籠養(yǎng)于有控環(huán)境條件下，采用常規(guī)12小時(shí)晝 夜周期。致死后，將腦于4%多聚甲醛中4°C固定72小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液于4°C保存。 對(duì)組織進(jìn)行石蠟處理，采用常規(guī)脫水和包埋，然后進(jìn)行間隔5μπι的切片。冷凍切片組織用"最 佳切片溫度復(fù)合物(〇CT)"（Ti SSue-Tek)包埋后于-80°C冷凍；用冷凍切片機(jī)(Leica)切50μπι 的切片。在對(duì)不同處理方法的研究中，用相鄰切片進(jìn)行比較。
[0071] 對(duì)碳酸酐溶液孵育的切片，將50μπι的切片在含有0.2%Triton Χ-100的ros中孵育 三次，每次10分鐘，然后將切片在已預(yù)熱至95°C、蒸餾水配制的0.05 %馬來酸酐（Sigma Aldrich)溶液中浸45分鐘。將切片冷卻至室溫后換4次roS清洗15min，然后進(jìn)行免疫組化法 處理。
[0072]用馬來酸酐處理甲醛固定的組織，以此去除通常因醛固定而掩蔽的多種脈管相關(guān) 抗原的掩蔽。內(nèi)皮素 -1、VEGF、馮·威利布蘭德因子以及，采用雙重標(biāo)記，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 和膠原IV(圖5A-5D)去掩蔽，采用已知在組織中有效的抗體。
[0073] 實(shí)施例6
[0074]甲醛固定腦組織的組織勻漿的抗原修復(fù)
[0075]因?yàn)闀?huì)造成組織交聯(lián)和改性，醛固定會(huì)明顯損傷固定組織使其不能用于定量分析 技術(shù)以檢測(cè)蛋白質(zhì)，例如不能用于Lowry試驗(yàn)和BCA試驗(yàn)、斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)或蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)。 本實(shí)施例顯示，本發(fā)明能夠恢復(fù)可檢測(cè)蛋白。圖6A顯示，在不同濃度馬來酸存在下加熱由腦 制備的甲醛-固定蛋白質(zhì)勻漿，BCA試驗(yàn)可定量的蛋白質(zhì)水平升高近8倍，表明可得游離氨基 酸增加。然而，非固定蛋白質(zhì)類似地在馬來酸存在下加熱很容易被BCA檢出，且濃度恒定(數(shù) 據(jù)略）。圖6B是可測(cè)知GATOH蛋白的斑點(diǎn)雜交比較，顯示采用這些化合物顯著、可測(cè)地提高特 定蛋白質(zhì)的水平。甲醛處理的組織用濃度從1.6 %到12.8 %的馬來酸處理，并于95 °C加熱30 分鐘，GAPDH檢測(cè)顯示平行升高。相比之下，未處理的甲醛交聯(lián)組織中無(wú)法測(cè)到GAPDH。
[0076] 實(shí)施例7
[0077] 成人腦脈管系統(tǒng)中的抗原修復(fù)
[0078] 多聚甲醛固定的石蠟包埋成人腦組織用2,3_二甲基馬來酸如前文所述進(jìn)行抗原 修復(fù)。用膠原IV檢測(cè)血管（圖7)。
[0079] 實(shí)施例8
[0080] 添加 Triton使得抗原修復(fù)后熒光增強(qiáng)
[0081] 將多聚甲醛固定的石蠟包埋腦組織脫蠟，于溶液中加熱至70°C、30分鐘，然后用膠 原1￥檢測(cè)血管（圖8六-88)。488碰激發(fā)成像。在5.0%抗壞血酸溶液中添加0.5%1^如11父-100，與不加 Trition X-100的樣品（圖8B)相比顯著提升染色均勻度和強(qiáng)度（圖8A)。
[0082] 實(shí)施例9
[0083] 抗原修復(fù)制劑處理降低自體熒光
[0084] 將多聚甲醛固定的石蠟包埋腦組織脫蠟，于溶液中至70°C加熱30分鐘，488nM激發(fā) 成像（圖9A-9C)。成像的曝光和時(shí)間都相同。與不加熱的組織（圖9A)相比，僅于水中加熱的 組織（圖9B)顯示組織自體熒光增強(qiáng)。相同條件下添加5%抗壞血酸顯著降低了可見的自體 熒光(圖9C)。
[0085] 實(shí)施例10
[0086] 添加谷胱甘肽提高化合物穩(wěn)定性
[0087] 將多聚甲醛固定的石蠟包埋腦組織脫蠟，于溶液中至70°C加熱30分鐘，488nM激發(fā) 成像并放大20倍（圖10A-10C)。以相同曝光和時(shí)間獲得各20倍放大圖像。與5%抗壞血酸存 在下加熱組織（陰性對(duì)照）（圖10B)相比，沒有抗壞血酸存在時(shí)，谷胱甘肽對(duì)組織沒有影響 (圖10A)。向5 %抗壞血酸中添加2.8mM谷胱甘肽（圖10C)提高了抗壞血酸的穩(wěn)定性，同時(shí)保 留染色效果。
[0088] 實(shí)施例11
[0089] 采用不同除醛化合物的抗原修復(fù)(血管緊張肽I)
[0090] 血管緊張肽I用福爾馬林室溫下處理48小時(shí)?；衔?ρΗ = 3·5的水（圖llC)，pH = 5.5的水（圖110)，5%咪唑啉酮（圖1把），5%檸檬酸（圖11?)，5%胍（圖116)，5%馬來酸（圖 11H)，pH= 3.5的Tris緩沖液（圖111)，抗壞血酸（圖11J)，輕胺（圖11K)，半胱氨酸（圖11L)， 各自與經(jīng)處理的血管緊張肽I一起95°C加熱45分鐘，以考察各化合物的抗原修復(fù)能力。用質(zhì) 譜法分別于化合物處理前和處理后分析血管緊張肽I的組成。將福爾馬林處理前（圖11A)和 處理后（圖11B)的血管緊張肽I樣品作為試驗(yàn)的對(duì)照。結(jié)果如圖（11A-11L)所示。m/z 1296處 的峰代表非改性血管緊張肽Lm/z 1308處的峰代表帶有1個(gè)亞甲基單元的血管緊張肽I，m/ z 1320處的峰代表帶有2個(gè)亞甲基單元的血管緊張肽Lm/z 1238處的峰代表帶有1個(gè)亞甲 基單元和1個(gè)輕甲基(hydromethyl)的血管緊張肽I α?ιι/ζ 1350處的峰代表帶有2個(gè)亞甲基單 元和1個(gè)羥甲基的血管緊張肽I。
[0091]圖11A-11B顯示血管緊張肽I完全轉(zhuǎn)化為福爾馬林加合物。圖11C-11D揭示，pH = 3.5的水具有修復(fù)福爾馬林加合物的能力，但pH = 5.5的水基本沒有。圖11B、1 ID和11G比較 顯示5%馬來酸和5%咪唑啉酮都能夠顯著減少帶2個(gè)亞甲基的血管緊張肽I(m/z 1320)，由 此得到更多非修飾血管緊張肽I(m/z 1296)。圖10B與圖10F比較顯示5%檸檬酸(45分鐘，95 °C)能夠顯著減少帶2個(gè)亞甲基單元的血管緊張肽I(m/z 1320)和帶1個(gè)亞甲基單元和1個(gè)羥 基亞甲基的血管緊張肽I(m/z 1338)。圖11G顯示5%胍修復(fù)帶1個(gè)亞甲基單元和1該羥基亞 甲基的血管緊張肽I(m/z 1338)的能力最弱，對(duì)于帶2個(gè)亞甲基單元的血管緊張肽I(m/z 1320)的含量沒有影響。并且，圖11B與圖E以及11I-11L比較顯示，5%檸檬酸、pH=3.5的5% Tr is緩沖液、5 %抗壞血酸、5 %羥胺和5 %半胱氨酸都能夠顯著修復(fù)福爾馬林加合物。
[0092] 實(shí)施例12
[0093]用除甲醛劑的抗原修復(fù)(促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH))
[0094] ACTH(18-39)肽室溫下用福爾馬林處理48小時(shí)（圖12A)。然后分別用5%馬來酸（圖 12B)、5 %抗壞血酸（圖12C)和pH= 3.5的水（圖12D)對(duì)經(jīng)福爾馬林處理的ACTH肽于90 °C處理 45分鐘。用質(zhì)譜法分析經(jīng)福爾馬林處理且經(jīng)各處理后的ACTH的組成。用圖12A-12D所示結(jié)果 來考察各試劑逆轉(zhuǎn)甲醛加合物的能力。圖12A顯示ACTH經(jīng)福爾馬林處理后的組成，福爾馬林 處理產(chǎn)生高含量的帶2個(gè)亞甲基單元的ACTH(m/z 2489)和帶1個(gè)亞甲基單元的ACTH(m/z 2477)。僅測(cè)到少量帶3個(gè)亞甲基單元的ACTH。圖12A、12B和12C比較顯示5%馬來酸和5%抗 壞血酸的98°C、45分鐘處理都能夠?qū)⒏男訟CTH(帶1、2或3個(gè)亞甲基的ACTH;分別對(duì)應(yīng)m/z 2477、2489和2501峰）幾乎完全轉(zhuǎn)化為非改性ACTH(m/z 2465)。
[0095]本發(fā)明非常適合實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述以及自身隱含的目的和優(yōu)點(diǎn)。以上所述具體實(shí)施 方式僅用于說明，本發(fā)明有多種不同但等同的變換和實(shí)施方式，都具有本文中所述的優(yōu)點(diǎn) 和效果，這些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見。并且，除了權(quán)利要求所述之外，本文中的 構(gòu)建或設(shè)計(jì)中的細(xì)節(jié)沒有限制。因此，顯然，以上【具體實(shí)施方式】是可以改變的，而所有此類 改變都涵蓋于本發(fā)明構(gòu)思和范圍之內(nèi)。并且，除非專利權(quán)人明確給出了清楚的定義，權(quán)利要 求中的術(shù)語(yǔ)符合其本意和慣常理解的含義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于固定組織中抗原修復(fù)和改善氨基酸、肽和蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法，其步驟包括： 制備含有除醛劑的溶液；以及 令用含醛交聯(lián)劑固定的組織與所述溶液接觸；其中，所述除醛劑與所述包含交聯(lián)劑的 醛之間的反應(yīng)修復(fù)固定組織中的所述抗原并改善固定組織中氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含醛交聯(lián)劑是甲醛或戊二醛。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述除醛劑在所述溶液中的濃度是約0.05%至約 30% 〇4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述溶液的pH處于針對(duì)所述除醛劑的特定范圍。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，還包括： 將所述溶液加熱至約60 °C至約125°C從而在醛與醛加合物之間達(dá)成可逆平衡。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述溶液降低加熱后組織中的自體熒光。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，還包括對(duì)組織進(jìn)行染色來檢測(cè)所述蛋白質(zhì)、肽、抗原或所 述蛋白質(zhì)、肽、抗原包含的表位。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述除醛劑是氨基乙醇，N-甲基氨基乙醇，2-(羥甲 基)哌啶，2_(輕甲基)吡略燒，N-芐基氨基乙醇，亞氨基(二乙醇），2-氨基-2-甲基-1，3_丙二 醇;絲氨酸，蘇氨酸，殼聚糖，三(羥甲基)氨基甲烷，精氨酸，賴氨酸，甘氨酸，組氨酸，5-羥色 氨酸，肌肽，胍，嗎啉，2-(羥甲基)哌啶，氨，碳酸銨，羥胺，0-烷基化羥胺，N-烷基化羥胺，0， N-烷基化羥胺，羥甲基胺，甲氧基胺，二丁胺，三亞乙基四胺，芐胺，噻苯咪唑，苯并三唑，三 唑，二氫D引哚，苯并胍胺，3，4-二氨基苯甲酸，4-氨基苯甲酸甲酯，苯胺；1 -氨基-2-B引噪；聚 氧化烯胺;聚酰胺型胺，鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸甲酯，鄰氨基苯甲酰胺;鄰苯二胺;4-氨基苯甲酸；3，4_二氨基苯甲酸;肼，N-甲基肼，N-苯肼，甲基酰肼，2，4_二硝基苯基酰肼， 脲，尿囊素，咪唑啉酮，苯巴比妥，甘脲，雙縮脲，半胱胺，半胱氨酸，谷胱甘肽，亞硫酸氫鈉， 對(duì)巰基苯甲酰胺，丙二酰胺，草酰胺，乙酰乙酰胺，草酰胺，焦谷氨酸，琥珀酰胺，乙二胺-N， Ν'-二乙酰乙酰胺，N-(2-乙基己基）乙酰乙酰胺，N-(3-苯丙基）乙酰乙酰胺，聚酰胺;聚酰胺 酯，山梨糖醇，己二醇，葡萄糖，纖維素，羥基香茅醇，雙甲酮，抗壞血酸，戊二酮，2-丁酮，環(huán) 己酮，2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮，2-戊酮，5，5-二甲基-1，3-環(huán)己二酮，脫氫乙酸， 1，3-二羥基丙酮二聚體，沒食子酸甲酯，沒食子酸乙酯，沒食子酸丙酯，焦掊酚，水楊酰胺； 水楊酰苯胺;4，5-二羥基-2，7-萘二磺酸，檸康酸，馬來酸酐，2，3-二甲基馬來酸酐，1 (E)-2-丁烯二酸二甲酯，2-硫烷基丁-2-烯二酸，丁-2-烯二酸，（E)-3-硝基丙-2-烯酸 酯或鹽，（E)-2,3_二氖化丁-2-稀二酸，（Z)-2_甲氧基丁-2-稀二酸，（Z)-2_過氧羥基丁-2-稀二酸，2-甲氧基丁-2-稀二酸，（Z)-2_氟丁-2-稀二酸酯，4-氧代戊-2-稀酸，（E)_2，3-二氯 丁-2-稀二酸，二氯馬來酸，（Z)-2_碘代丁-2-稀二酸，（E)_2，3-二氖化丁-2-稀二酸，（Z)-2-羥基-3-甲基丁-2-烯二酸，2，3-二氘化丁-2-烯二酸，（E)-3-硝基丁-2-烯酸，丁-2-烯二酸 酯或鹽，（E)-4_氯-4-氧代丁-2-稀酸酯或鹽，（E)-2,3_二氟丁-2-稀二酸酯或鹽，（E)-4_輕 基-4-氧代丁-2-烯酸酯或鹽，氫富馬酸酯或鹽，（Z)-2-烷基硫丁-2-烯二酸，2,3_二氟富馬 酸，（E)-4-羥基-2-甲基-4-氧代丁-2-烯酸酯或鹽，一氟富馬酸酯或鹽，氟代富馬酸，（Z)-2-氯丁 _2_稀二酸，2-過氧羥基丁 _2_稀二酸，過氧馬來酸，2-氯_3_甲基丁_2_稀二酸，2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸，2-丁烯二酸，[(E)-3-羧基-1-羥基亞丙-2-烯基]氧鑰，（E)-2-甲基丁-2-烯二酸酯或鹽，2-甲基富馬酸酯/鹽，檸康酸，2，3_二氯馬來酸，3，4_二氯-5-羥基呋喃-2 (5H)-酮，3-氯羰基丙烯酸乙酯，（E)-4-氧代戊-2-烯酸乙酯，[(Z)-3-羧基丙-2-烯酰]氧鑰， (Z)-丁-2-烯二酸，馬來酸二甲酯，富馬酸二甲酯;活性碳，氧化鋁;二氧化硅;胺官能化的二 氧化硅;滑石;沸石;或多官能有機(jī)物，其中既具有伯胺或仲胺基團(tuán)又具有羧酸、酚、酰胺、羥 基、脲、酯或巰基基團(tuán)，至少其中之一會(huì)與醛反應(yīng);環(huán)糊精;或上述化合物的各種組合。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述溶液還包含約0.1%至約5%的非離子表面活性 劑，所述非離子表面活性劑去除石蠟包埋樣品中的石蠟并增強(qiáng)抗原修復(fù)后的熒光強(qiáng)度。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述非離子表面活性劑是聚西托醇1000，鯨蠟硬脂 醇，鯨蠟醇，椰油酰胺二乙醇胺，椰油酰胺單乙醇胺，癸基葡糖苷，IGEPAL CA-630，異鯨蠟醇 聚醚-20，月桂基葡糖苷，NP-40，Nonidet P-40，壬苯醇醚-9，壬苯醇醚，月桂酸單甘油酯，八 乙二醇單十二烷基醚，油醇，泊洛沙姆，泊洛沙姆407,聚甘油聚蓖麻油酸酯，聚山梨酸酯，脫 水山梨醇單硬脂酸酯，脫水山梨醇三硬脂酸酯;硬脂醇;Triton X-10;吐溫80;辛基-、癸基、 十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麥芽糖苷或脫氧膽酸。11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述溶液還含有穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑選自防腐劑， 抗真菌劑，抗細(xì)菌劑，染料，顏料，陰離子洗滌劑，金屬鹽，抗氧化劑或其組合。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述抗氧化劑是濃度約2mM至約400mM的谷胱甘 肽。13. -種制劑，其于溶液中包含選自以下所述的化合物:氨基乙醇，N-甲基氨基乙醇，2-(羥甲基）哌啶，2-(羥甲基）吡咯烷，N-芐基氨基乙醇，亞氨基(二乙醇），2_氨基-2-甲基-1， 3-丙二醇;絲氨酸，蘇氨酸，殼聚糖，三(羥甲基)氨基甲烷，精氨酸，賴氨酸，甘氨酸，組氨酸， 5-羥色氨酸，肌肽，胍，嗎啉，2-(羥甲基)哌啶，氨，碳酸銨，羥胺，0-烷基化羥胺，N-烷基化羥 胺，〇，N-烷基化羥胺，羥甲基胺，甲氧基胺，二丁胺，三亞乙基四胺，芐胺，噻苯咪唑，苯并三 唑，三唑，二氫吲哚，苯并胍胺， 3，4-二氨基苯甲酸，4-氨基苯甲酸甲酯，苯胺；1-氨基-2-吲 哚；聚氧化烯胺;聚酰胺型胺，鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸甲酯，鄰氨基苯甲酰胺;鄰苯二 胺;4-氨基苯甲酸;3,4_二氨基苯甲酸;肼，N-甲基肼，N-苯肼，甲基酰肼，2,4_二硝基苯基酰 肼，脲，尿囊素，咪唑啉酮，苯巴比妥，甘脲，雙縮脲，半胱胺，半胱氨酸，谷胱甘肽，亞硫酸氫 鈉，對(duì)巰基苯甲酰胺，丙二酰胺，草酰胺，乙酰乙酰胺，草酰胺，焦谷氨酸，琥珀酰胺，乙二胺-N，N'_二乙酰乙酰胺，N-(2-乙基己基）乙酰乙酰胺，N-(3-苯丙基）乙酰乙酰胺，聚酰胺;聚酰 胺酯，山梨糖醇，己二醇，葡萄糖，纖維素，羥基香茅醇，雙甲酮，抗壞血酸，戊二酮，2-丁酮， 環(huán)己酮，2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮，2-戊酮，5，5-二甲基-1，3-環(huán)己二酮，脫氫乙 酸，1，3-二羥基丙酮二聚體，沒食子酸甲酯，沒食子酸乙酯，沒食子酸丙酯，焦掊酚，水楊酰 胺;水楊酰苯胺;4，5-二羥基-2，7-萘二磺酸，檸康酸，馬來酸酐，2，3-二甲基馬來酸酐，1 (E)-2-丁烯二酸二甲酯，2-硫烷基丁-2-烯二酸，丁-2-烯二酸，（E)-3-硝基丙-2-烯酸 酯或鹽，（E)-2,3_二氖化丁-2-稀二酸，（Z)-2_甲氧基丁-2-稀二酸，（Z)-2_過氧羥基丁-2-稀二酸，2-甲氧基丁-2-稀二酸，（Z)-2_氟丁-2-稀二酸酯，4-氧代戊-2-稀酸，（E)_2，3-二氯 丁-2-稀二酸，二氯馬來酸，（Z)-2_碘代丁-2-稀二酸，（E)_2，3-二氖化丁-2-稀二酸，（Z)-2-羥基-3-甲基丁-2-烯二酸，2，3-二氘化丁-2-烯二酸，（E)-3-硝基丁-2-烯酸，丁-2-烯二酸 酯或鹽，（E)-4_氯-4-氧代丁-2-稀酸酯或鹽，（E)-2,3_二氟丁-2-稀二酸酯或鹽，（E)-4_輕 基-4-氧代丁-2-烯酸酯或鹽，氫富馬酸酯或鹽，（Z)-2-硫烷基丁-2-烯二酸，2,3_二氟富馬 酸，（E)-4-羥基-2-甲基-4-氧代丁-2-烯酸酯或鹽，一氟富馬酸酯或鹽，氟代富馬酸，（Z)-2- 氯丁_2_稀二酸，2-過氧羥基丁-2-稀二酸，過氧馬來酸，2-氯-3-甲基丁-2-稀二酸，2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸，2-丁烯二酸，[(E)-3-羧基-1-羥基亞丙-2-烯基]氧鑰，（E)-2-甲基丁-2-烯二酸酯或鹽，2-甲基富馬酸酯或鹽，檸康酸，2,3_二氯馬來酸，3，4_二氯-5-羥基呋喃-2 (5H)-酮，3-氯羰基丙烯酸乙酯，（E)-4-氧代戊-2-烯酸乙酯，[(Z)-3-羧基丙-2-烯酰]氧鑰， (Z)-丁-2-烯二酸，馬來酸二甲酯，富馬酸二甲酯;活性碳，氧化鋁;二氧化硅;胺官能化的二 氧化硅;滑石;沸石;或多官能有機(jī)物，其中既具有伯胺或仲胺基團(tuán)又具有羧酸、酚、酰胺、羥 基、脲、酯或巰基基團(tuán)，至少其中之一能與醛反應(yīng);環(huán)糊精;或所述化合物的各種混合物，其 中，一種或多種所述化合物以能夠與固定蛋白質(zhì)反應(yīng)的有效濃度處于經(jīng)加熱的、針對(duì)作為 有效除醛劑的所述化合物或化合物的混合物的特定pH范圍的溶液中。14. 如權(quán)利要求13所述的制劑，其中，所述化合物或化合物的混合物在溶液中的所述濃 度是約0.05 %至約30 %。15. 如權(quán)利要求13所述的制劑，還含有濃度約0.05 %至約30 %的非離子表面活性劑，其 中，所述非離子表面活性劑是聚西托醇1000,鯨蠟硬脂醇，鯨蠟醇，椰油酰胺二乙醇胺，椰油 酰胺單乙醇胺，癸基葡糖苷，IGEPAL CA-630，異鯨蠟醇聚醚-20，月桂基葡糖苷，NP-40， Nonidet P-40，壬苯醇醚-9，壬苯醇醚，月桂酸單甘油酯，八乙二醇單十二烷基醚，油醇，泊 洛沙姆，泊洛沙姆407,聚甘油聚蓖麻油酸酯，聚山梨酸酯，脫水山梨醇單硬脂酸酯，脫水山 梨醇三硬脂酸酯;硬脂醇;Triton X-10;吐溫80;辛基-、癸基、十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麥芽糖苷或脫氧膽酸。16. 如權(quán)利要求15所述的制劑，還含有穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑選自防腐劑，抗真菌劑，抗細(xì) 菌劑，染料，顏料，陰離子洗滌劑，金屬鹽，抗氧化劑或其組合。17. 用于固定組織中抗原修復(fù)和改善氨基酸、肽和蛋白質(zhì)檢測(cè)的試劑盒，包含： 除醛劑； 可選的非離子表面活性劑； 穩(wěn)定劑； 染色劑，染料或抗體;和 試劑盒使用說明。18. 如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述除醛劑是氨基乙醇，N-甲基氨基乙醇，2-(羥甲基）哌啶，2-(羥甲基）吡咯烷，N-芐基氨基乙醇，亞氨基(二乙醇），2_氨基-2-甲基-1， 3-丙二醇;絲氨酸，蘇氨酸，殼聚糖，三(羥甲基)氨基甲烷，精氨酸，賴氨酸，甘氨酸，組氨酸， 5-羥色氨酸，肌肽，胍，嗎啉，2-(羥甲基)哌啶，氨，碳酸銨，羥胺，0-烷基化羥胺，N-烷基化羥 胺，〇，N-烷基化羥胺，羥甲基胺，甲氧基胺，二丁胺，三亞乙基四胺，芐胺，噻苯咪唑，苯并三 唑，三唑，二氫吲哚，苯并胍胺， 3，4-二氨基苯甲酸，4-氨基苯甲酸甲酯，苯胺；1-氨基-2-吲 哚；聚氧化烯胺;聚酰胺型胺，鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸甲酯，鄰氨基苯甲酰胺;鄰苯二 胺;4-氨基苯甲酸;3,4_二氨基苯甲酸;肼，N-甲基肼，N-苯肼，甲基酰肼，2,4_二硝基苯基酰 肼，脲，尿囊素，咪唑啉酮，苯巴比妥，甘脲，雙縮脲，半胱胺，半胱氨酸，谷胱甘肽，亞硫酸氫 鈉，對(duì)巰基苯甲酰胺，丙二酰胺，草酰胺，乙酰乙酰胺，草酰胺，焦谷氨酸，琥珀酰胺，乙二胺-N，N'_二乙酰乙酰胺，N-(2-乙基己基）乙酰乙酰胺，N-(3-苯丙基）乙酰乙酰胺，聚酰胺;聚酰 胺酯，山梨糖醇，己二醇，葡萄糖，纖維素，羥基香茅醇，雙甲酮，抗壞血酸，戊二酮，2-丁酮， 環(huán)己酮，2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮，2-戊酮，5，5-二甲基-1，3-環(huán)己二酮，脫氫乙 酸，1，3-二羥基丙酮二聚體，沒食子酸甲酯，沒食子酸乙酯，沒食子酸丙酯，焦掊酚，水楊酰 胺；水楊酰苯胺；4，5-二羥基-2，7-萘二磺酸，檸康酸，馬來酸酐，2，3-二甲基馬來酸酐，1 (E)-2-丁烯二酸二甲酯，2-硫烷基丁-2-烯二酸，丁-2-烯二酸，（E)-3-硝基丙-2-烯酸酯或 鹽，（E)_2，3-二氖化丁_2_稀二酸，（Z)_2_甲氧基丁_2_稀二酸，（Z)-2_過氧羥基丁_2_稀二 酸，2-甲氧基丁-2-稀二酸，（Z)-2_氟丁-2-稀二酸酯，4-氧代戊-2-稀酸，（E)_2，3-二氯丁-2-稀二酸，二氯馬來酸，（Z)-2_碘代丁-2-稀二酸，（E)-2,3_二氖化丁-2-稀二酸，（Z)-2_輕 基-3-甲基丁-2-烯二酸，2，3-二氘化丁-2-烯二酸，（E)-3-硝基丁-2-烯酸，丁-2-烯二酸酯 或鹽，（E)-4_氯-4-氧代丁-2-稀酸酯或鹽，（E)-2,3_二氟丁-2-稀二酸酯或鹽，（E)-4_羥基-4_氧代丁-2-烯酸酯或鹽，氫富馬酸酯或鹽，（Z)-2-硫烷基丁-2-烯二酸，2,3_二氟富馬酸， (E)-4-羥基-2-甲基-4-氧代丁-2-烯酸酯或鹽，一氟富馬酸酯或鹽，氟代富馬酸，（Z)-2-氯 丁-2-烯二酸，2-過氧羥基丁-2-烯二酸，過氧馬來酸，2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸，2-氯-3-甲 基丁 _2_稀二酸，2-丁稀二酸，[(E)-3_駿基-1-羥基亞丙_2_烯基]氧鐵，（E)-2_甲基丁_2_稀 二酸酯或鹽，2-甲基富馬酸酯或鹽，檸康酸，2，3_二氯馬來酸，3，4_二氯-5-羥基呋喃-2 (5H)-酮，3-氯羰基丙烯酸乙酯，（E)-4-氧代戊-2-烯酸乙酯，[(Z)-3-羧基丙-2-烯酰]氧鑰， (Z)-丁-2-烯二酸，馬來酸二甲酯，富馬酸二甲酯;活性碳，氧化鋁;二氧化硅;胺官能化的二 氧化硅;滑石;沸石;或多官能有機(jī)物，其中既具有伯胺或仲胺基團(tuán)又具有羧酸、酚、酰胺、羥 基、脲、酯或巰基基團(tuán)，至少其中之一能與醛反應(yīng);環(huán)糊精;或上述化合物的各種組合。19. 如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述非離子表面活性劑是聚西托醇1000,鯨蠟 硬脂醇，鯨蠟醇，椰油酰胺二乙醇胺，椰油酰胺單乙醇胺，癸基葡糖苷，IGEPAL CA-630，異鯨 蠟醇聚醚-20，月桂基葡糖苷，NP-40，Nonidet P-40，壬苯醇醚-9，壬苯醇醚，月桂酸單甘油 酯，八乙二醇單十二烷基醚，油醇，泊洛沙姆，泊洛沙姆407,聚甘油聚蓖麻油酸酯，聚山梨酸 酯，脫水山梨醇單硬脂酸酯，脫水山梨醇三硬脂酸酯;硬脂醇;Triton X-10;吐溫80;辛基-、 癸基、十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麥芽糖苷或脫氧膽酸。20. 如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述穩(wěn)定劑是防腐劑，抗真菌劑，抗細(xì)菌劑，染 料，顏料，陰離子洗滌劑，金屬鹽，抗氧化劑或其組合。21. 鑒定抗原修復(fù)劑的方法，其步驟包括： 在含水溶液中用含醛交聯(lián)劑固定蛋白質(zhì)； 凍干所述溶液，獲得固定蛋白質(zhì)； 將固定蛋白質(zhì)加入含有待測(cè)試劑的溶液； 加熱含所述待測(cè)試劑和固定蛋白質(zhì)的所述溶液；以及 用質(zhì)譜法檢測(cè)所述蛋白質(zhì)，其中，存在所述蛋白質(zhì)的峰表示待測(cè)試劑是抗原修復(fù)劑。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述含醛交聯(lián)劑包含約4%的甲醛水溶液。23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述溶液加熱至約60°C至約125°C約45分鐘至約 90分鐘。
【文檔編號(hào)】G01N1/44GK106030309SQ201480074818
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2014年10月31日
【發(fā)明人】J·埃里克森, C·福勒特, S·巴克, W·莫里
【申請(qǐng)人】休斯敦大學(xué)系統(tǒng)