用于肺癌的生物標(biāo)記物、相關(guān)的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及活性形式的人源半胱天冬酶蛋白，優(yōu)選地為人源半胱天冬酶?4或半胱天冬酶?1，或者由人源半胱天冬酶蛋白的同源基因(優(yōu)選地為人源半胱天冬酶?4(例如鼠源半胱天冬酶?11蛋白)的同源基因)編碼的活性形式的蛋白質(zhì)在診斷和/或預(yù)后和/或監(jiān)控腫瘤(特別是肺癌)的進(jìn)程的方法中作為生物標(biāo)記物的用途。
【專利說明】
用于肺癌的生物標(biāo)記物、相關(guān)的方法和試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及活性形式的人源半胱天冬酶蛋白，優(yōu)選地為人源半胱天冬酶-4或半胱 天冬酶-1，或者由人源半胱天冬酶蛋白的同源基因（優(yōu)選地為人源半胱天冬酶_4(例如鼠源 半胱天冬酶-11蛋白）的同源基因）編碼的活性形式的蛋白質(zhì)在診斷和/或預(yù)后和/或監(jiān)控腫 瘤(特別是肺癌）的進(jìn)程的方法中作為生物標(biāo)記物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌為工業(yè)化國家中的主要死因之一，其以不良預(yù)后和低存活率為特征(Jett等 人.，1983;Pinto等人.，2011)。肺癌的危險(xiǎn)因素之一為暴露于(吸入)致癌物(Valavanidis 等人.，2008)，雖然還沒有明確定義腫瘤生長的細(xì)胞和分子機(jī)制。
[0003] 腫瘤性疾病的發(fā)生/發(fā)展與免疫系統(tǒng)之間的嚴(yán)格相關(guān)性(Coussens等人·，2013; Pinto等人.，2011; Zitvogel等人.，2012)是近年來科學(xué)的興趣。慢性炎癥是許多呼吸系統(tǒng) 疾病(包括肺癌）的共同特征。眾所周知，腫瘤發(fā)展/進(jìn)程與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長超出抗-月中 瘤免疫控制的免疫抑制環(huán)境有關(guān)(Coussens等人.，2013)。盡管有經(jīng)典的化療，目前似乎在 治療腫瘤中發(fā)揮著越來越重要的作用的概念是介入，尤其是對腫瘤微環(huán)境的免疫系統(tǒng)進(jìn)行 "藥理操縱"。
[0004] 迄今為止，目前最廣泛使用的免疫治療由白細(xì)胞激活以便獲得抗腫瘤免疫應(yīng)答 (Coussens等人.，2013)組成。然而，為腫瘤生長基礎(chǔ)的慢性炎癥中所涉及的特異性分子的 識(shí)別和細(xì)胞機(jī)制似乎在鑒定能夠調(diào)控腫瘤生長的藥物靶標(biāo)方面具有最大的學(xué)術(shù)影響。
[0005] 肺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(ΜΦ)和組織樹突細(xì)胞(DC)是防御外部攻擊的第一道防線， 且它們負(fù)責(zé)隨后的適應(yīng)性免疫應(yīng)答(Pinto et等人.，2011)。對這些細(xì)胞的持續(xù)損害促進(jìn)和 維持了以釋放稱為警報(bào)器的分子(包含IL-lcuIL-Ιβ、高迀移率族蛋白bl(HMGBl))為特征的 慢性炎癥應(yīng)答(Paul-Clark等人.，2012)。該警報(bào)器的合成/釋放由稱為炎性體的多-蛋白系 統(tǒng)根據(jù)半胱天冬酶-1依賴性經(jīng)典通路(Latz等人.，2013)和半胱天冬酶-11依賴性非經(jīng)典通 路(Kayagaki等人.，2013)精確調(diào)控。半胱天冬酶-1激活將IL-Ιβ前體和IL-18前體轉(zhuǎn)變?yōu)樗?們的活性形式(Lamkanfi和011^，2012)。相反地，半胱天冬酶-11促進(jìn)11^-1€1和腿681的釋放 (Ng和Monack，2013)。半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡 (pyropoptosis)，不同于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡，因?yàn)槠湔T導(dǎo)了在腫瘤環(huán)境中能促進(jìn)有利于 腫瘤生長的免疫抑制狀態(tài)的促炎癥應(yīng)答(Lamkanfi和Dixit，2012)。
[0006] 炎性體絡(luò)合物受稱為Nod樣受體(NLR)和更一般地稱為病原體識(shí)別受體(PRR)的胞 漿蛋白的活性調(diào)控，該病原體識(shí)別受體(PRR)能夠識(shí)別在半胱天冬酶-1依賴性通路的上游 發(fā)揮作用的外源性配體(病原體相關(guān)的分子模式:PAMP)和內(nèi)源性配體(危險(xiǎn)相關(guān)的分子模 式:DAMP)(Caffrey和？^2 86抑1(1，2012)。迄今為止，識(shí)別出22種11?。雖然胞漿內(nèi)的11^3受 體確實(shí)是迄今為止研究最深入的，但其在癌癥中的作用似乎仍存在爭議(Zitvogel等.， 2012)。事實(shí)上，NLRP3在結(jié)腸癌中發(fā)揮著保護(hù)作用，因?yàn)槠浠蛉笔Т龠M(jìn)了與結(jié)腸上皮細(xì)胞 中的更高水平的慢性炎癥相關(guān)的腫瘤生長(Allen等.，2010)。而且，NLRP3似乎對某些經(jīng)典 的化療藥物(如阿霉素和5-氟尿嘧啶）的活性是必不可少的(Ghiringhelli等.，2009)。形成 鮮明對比的是，在肺轉(zhuǎn)移和纖維內(nèi)瘤的鼠源模型中，NLRP3激活促進(jìn)了腫瘤生長(Chow等.， 2012a)，從而促進(jìn)募集具有免疫抑制活性的細(xì)胞，如髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)，該髓源性抑制 細(xì)胞(MDSC)不僅抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞:CTL)活性，而且還抑制天然 殺傷細(xì)胞(NK)。另外，盡管對腫瘤生長是非必要的（Chow等.，2012b)，NLRP3似乎參與由石棉 和二氧化硅(間皮瘤的催動(dòng)因素)誘導(dǎo)的肺部炎癥(Dostert等.，2008)。
[0007] 半胱天冬酶-11，人源半胱天冬酶-4的鼠源類似物，是激活非經(jīng)典炎性體通路的關(guān) 鍵性酶(Ng和Monack，2013)。由于促炎性條件和尤其是通過致病性感染的細(xì)胞壞死，這種酶 能夠誘導(dǎo)成熟形式的IL-la的水解，并誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)中HMGB1的釋放(Ng和Monack，2013)。 迄今為止，在文獻(xiàn)中有所描述的是，在細(xì)菌感染期間，通過誘導(dǎo)包含TIR-結(jié)構(gòu)域的適配蛋白 的干擾素-KTRIF)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以I型干擾素依賴性方式激活半胱天冬酶-11，該轉(zhuǎn)導(dǎo)通路構(gòu)成 激活某些Toll樣受體(TLR)(如TLR4和TLR3)的基礎(chǔ)(Bortoluci和Medzhitov，2010)。鼠源半 胱天冬酶-11和類似的人源半胱天冬酶-4在癌癥(特別是肺癌）中的作用仍然是完全未知 的。因此，根據(jù)日益新興的文獻(xiàn)，炎性體生物學(xué)的幾個(gè)方面仍未經(jīng)探索，尤其是在肺腫瘤學(xué) 領(lǐng)域，在肺腫瘤學(xué)領(lǐng)域中慢性炎癥似乎是腫瘤生長的催動(dòng)因素(Coussens等人.，2013)。
[0008] 專利申請W02008/009028涉及用于確定患有肺腺癌的受試者的預(yù)后的方法，該方 法包括對幾種細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行定量，這幾種細(xì)胞因子中的一些與鼠源半胱天冬酶-11 或人源半胱天冬酶-4不相關(guān)。
[0009] 此外，在M.Yamauchi等人.，（2010)中，描述了通過分析基因表達(dá)譜來鑒定人類原 發(fā)性肺腫瘤上皮細(xì)胞中的139個(gè)吉非替尼敏感基因（也包含半胱天冬酶4基因）。
[0010] 在專利申請W02010/064702中，描述了用于通過分析227個(gè)基因（包含半胱天冬酶- 1基因和半胱天冬酶-4基因）的基因表達(dá)的變化來診斷肺癌的方法。然而，之前從未描述或 暗示過活性形式的人源半胱天冬酶蛋白作為參與肺癌的生物標(biāo)記物的用途。而且，既不知 曉也沒有暗示鼠源半胱天冬酶-11或人源半胱天冬酶-4的促炎性細(xì)胞因子效應(yīng)器(如IL-1 α)和肺癌之間的關(guān)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 作者已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，半胱天冬酶，尤其是鼠源半胱天冬酶-11 [NCBI登記號(hào) CAA73531.1](SEQ ID No.4)和人源類似物半胱天冬酶-4[NCBI登記號(hào)NP_001216.1](SEQ ID No. 1)，以及鼠源半胱天冬酶-1 [NCBI登記號(hào)小鼠：NP_033937.2(NM_009807.2) ] (SEQ ID No.3)和人源半胱天冬酶-l[CAA46153.1](SEQIDNo.2)，參與了肺癌中的腫瘤生長。
[0012] 而且，盡管這些酶的激活因子的分子配體仍然是未知的，但本發(fā)明的作者已鑒定 出新的參與肺腫瘤生長的"激活信號(hào)通路"，其有利于鑒定新的治療性和診斷性靶標(biāo)。在通 過暴露于致癌物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程中，產(chǎn)生了 8-羥基-2'-脫氧鳥苷(8-OH-dG)，其反過來 被胞漿內(nèi)受體AIM2 [NCBI登記號(hào)：小鼠：ΝΡ_001013801 · 2] (SEQ ID No · 5)、人源[NP_ 004824.1](SEQ ID No.6)(炎性體絡(luò)合物的組分）識(shí)別。
[0013] AM2在小鼠中結(jié)合至半胱天冬酶-11且在人類中結(jié)合至半胱天冬酶-4，該活性形 式誘導(dǎo)了警報(bào)器的釋放，如IL-la[NCBI 10登記號(hào)：小鼠：NP_034684[GI :47059075] ](SEQ ID Νο·7);和人源[NP_000566[GI:27894330]](SEQ ID Νο·8:)，和IL-10[NCBI登記號(hào)小鼠： NP_032387.1[GI:6680415]](SEQ ID Νο·9)和人源：NP_000567.1[GI:10835145]](SEQ ID No·10)和HMGBl[NCBI登記號(hào)：小鼠 AAI10668[GI 84040262]](SEQIDNo·ll);人源：CAG 33144.1[GI 48145843](SEQIDNo.l2)，從而促進(jìn)肺腫瘤生成。而且，在人源肺癌組織中， A頂2結(jié)合至半胱天冬酶-4是非常顯著的。進(jìn)一步證實(shí)我們所陳述的是觀察到，相比于具有 完整的且活性的半胱天冬酶-11的小鼠（C57B1/6小鼠），在不具有功能性半胱天冬酶-11的 小鼠（129Sv小鼠）或半胱天冬酶-1/11敲除的小鼠中，或者隨后通過針對半胱天冬酶-11或 IL-la(半胱天冬酶-11的效應(yīng)器）的特異性單抗使半胱天冬酶-11中和，觀察到肺腫瘤生長 的發(fā)展顯著降低。
[0014] 這些作者還確定了半胱天冬酶-l(p20kDa)的激活與肺癌之間的關(guān)系。
[0015] 因此，作者不僅確定了參與肺癌發(fā)生的新"通路"，而且確定了用于開發(fā)針對高死 亡率疾病(如肺癌）的未來治療策略的新藥物靶標(biāo)。此外，與促炎性細(xì)胞因子(如IL-la和IL-1β)的存在有關(guān)、已知在腫瘤組織中處于非常高的水平的人類中的胱天蛋白酶-4的激活代 表了用于肺癌的新的診斷工具以及可能的預(yù)后工具。
[0016] 因此，在用于診斷和/或預(yù)后和/或用于監(jiān)控腫瘤的進(jìn)程的方法中使用的生物標(biāo)記 物是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，該生物標(biāo)記物屬于至少由以下物質(zhì)組成的組：
[0017] a)活性形式的人源半胱天冬酶蛋白；
[0018] b)其變體、同源物、衍生物或功能性片段；
[0019] c)由所述人源半胱天冬酶蛋白基因的同源基因編碼的活性形式的蛋白質(zhì)。
[0020] 所述人源半胱天冬酶蛋白優(yōu)選地為人源半胱天冬酶-4蛋白（SEQ ID No. 1)或人源 半胱天冬酶-1蛋白（SEQ ID No.2)。人源半胱天冬酶-4基因的同源基因?yàn)槔缡笤窗腚滋?冬酶-11基因。
[0021 ]所述腫瘤優(yōu)選地為肺腫瘤，更優(yōu)選地為肺惡性上皮腫瘤。
[0022] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式為用于診斷和/或預(yù)后和/或用于監(jiān)控腫瘤的進(jìn)程的體 外方法，該方法包括以下步驟：
[0023] a)對從受試者分離出來的樣品中的如以上限定的生物標(biāo)記物進(jìn)行確定和/或定 量，和
[0024] b)與適當(dāng)?shù)膶φ者M(jìn)行比較。
[0025] 對生物標(biāo)記物進(jìn)行的定量可以對應(yīng)于生物標(biāo)記物的量的測量，或?qū)?yīng)于生物標(biāo)記 物的量的改變的測量，更特別地對應(yīng)于生物標(biāo)記物的量的增加或減少。增加可能與腫瘤的 惡化有關(guān)。減少可能與腫瘤的改善有關(guān)，或者與受試者的恢復(fù)有關(guān)。
[0026] 如果將在步驟a)中測量的量的改變與所述標(biāo)記物的適當(dāng)對照進(jìn)行比較，所測試的 樣品中的所述生物標(biāo)記物的量的改變對應(yīng)于增加，則步驟a)的受試者可能經(jīng)歷了腫瘤的惡 化。
[0027] 如果將在步驟a)中測量的量的改變與所述標(biāo)記物的適當(dāng)對照進(jìn)行比較，所測試的 樣品中的所述生物標(biāo)記物的量的改變對應(yīng)于減少，則步驟a)的受試者可能經(jīng)歷了腫瘤的改 善，或者恢復(fù)。
[0028] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法還包括對至少一種其它腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測 和/或定量，并與適當(dāng)?shù)膶φ諛悠愤M(jìn)行比較。優(yōu)選地，所述其它標(biāo)記物為如上所限定的生物 標(biāo)記物的促炎性細(xì)胞因子效應(yīng)器，更優(yōu)選地所述促炎性細(xì)胞因子為IL-la、IL-li3、IL_18或 HMGBlo
[0029] IL-lα優(yōu)選地以SEQIDNo·8或7為特征。
[0030] IL-lβ優(yōu)選地以SEQIDNo·10或9為特征。
[0031] IL-18優(yōu)選地以SEQIDNo·14或13為特征。
[0032] HMGBl優(yōu)選地以SEQIDNo·12或ll為特征。
[0033] 所述細(xì)胞因子和所述細(xì)胞因子基因的同源基因編碼的蛋白質(zhì)的變體、同源物、衍 生物或功能性片段包含在上述細(xì)胞因子的定義中。
[0034] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，腫瘤優(yōu)選地為肺癌，更優(yōu)選地為肺惡性上皮腫瘤。
[0035] 從受試者分離出來的樣品優(yōu)選地為生物流體、細(xì)胞樣品和/或組織樣品。
[0036] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式為用于診斷和/或預(yù)后和/或用于監(jiān)控腫瘤的進(jìn)程的試 劑盒，該試劑盒包括
[0037] -用于檢測和/或測量至少一種如上所限定的生物標(biāo)記物的量和/或用于測量至少 一種如上所限定的生物標(biāo)記物的量的改變的裝置，和任選地
[0038]-控制裝置。
[0039]控制裝置可以用于比較生物標(biāo)記物的量的增加與適當(dāng)?shù)膶φ盏闹?。例如參照已?標(biāo)準(zhǔn)從正常受試者或者從正常人群均可以獲得對照值。
[0040] 用于檢測和/或測量至少一種如上所限定的生物標(biāo)記物的量和/或用于測量至少 一種如上所限定的生物標(biāo)記物的量的改變的裝置優(yōu)選地為至少一種抗體、其類似物或其功 能性衍生物。所述抗體、其類似物或其功能性衍生物對所述生物標(biāo)記物可以是特異性的。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒還可以包括常見的輔助成分，如緩沖液、載體、染料等，和/或 使用說明。
[0042] 在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，腫瘤優(yōu)選地為肺癌，更優(yōu)選地為肺惡性上皮腫瘤。
[0043]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式為如上所限定的生物標(biāo)記物的特異性抑制劑，用于預(yù)防 和/或治療腫瘤，其中所述抑制劑優(yōu)選地為抗體、疫苗、siRNA或低分子量藥物。
[0044] 所述腫瘤優(yōu)選地為肺癌，更優(yōu)選地為肺惡性上皮腫瘤。
[0045] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式為用于診斷和/或預(yù)后和/或用于監(jiān)控腫瘤的發(fā)展的體 外或離體方法，其特征在于確定生物標(biāo)記物的存在，該生物標(biāo)記物選自生物樣品中的：
[0046] a)活性形式的人源半胱天冬酶蛋白；
[0047] b)生物樣品中其變體、功能性衍生物或功能性片段。
[0048] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在本發(fā)明的方法中，人源半胱天冬酶蛋白為人源半胱 天冬酶-4(SEQIDNo.l)蛋白或人源半胱天冬酶-l(SEQIDNo.2)蛋白。
[0049] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0050] a)對從受試者分離出來的樣品中的所述生物標(biāo)記物進(jìn)行確定和/或定量，和
[0051] b)將其與給定的對照進(jìn)行比較。
[0052] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式為對至少一種其它腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行確定和/或定定量， 并與適當(dāng)?shù)膶φ諛悠愤M(jìn)行比較。
[0053]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，其它標(biāo)記物為如上所述的生物標(biāo)記物的促炎 性細(xì)胞因子的細(xì)胞因子效應(yīng)器，優(yōu)選地所述促炎性細(xì)胞因子為IL-la、IL-li3、IL_18或 HMGBl〇
[0054] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式為一以確定了預(yù)后和/或監(jiān)控腫瘤的發(fā)展和/或進(jìn)程過 程中生物樣品中的所述生物標(biāo)記物的存在的增加和/或減少為特征的方法。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明，從受試者分離出來的樣品為生物流體、細(xì)胞樣品和/或組織樣品。
[0056] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式為用于診斷和/或預(yù)后和/或用于監(jiān)控腫瘤的發(fā)展和/或 進(jìn)程的試劑盒，該試劑盒包括：
[0057]-用于確定和/或用于測量至少一種生物標(biāo)記物的量和/或用于測量至少一種生物 標(biāo)記物的量的改變的裝置，和任選地 [0058]-控制裝置。
[0059] 本發(fā)明的另一個(gè)目的為生物標(biāo)記物的特異性抑制劑在預(yù)防和/或治療腫瘤中的用 途，其中所述抑制劑優(yōu)選地為抗體、合成肽、氨基酸和/或核苷酸序列、疫苗、siRNA或低分子 量藥物。
[0060] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述抑制劑為選自：抗-半胱天冬酶-1抗體、抗-半胱天 冬酶-4抗體、抗-IL-la抗體、抗-IL-Ιβ抗體、抗-IL-18抗體或抗-HMGB1抗體或其片段的抗 體。
[0061 ] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述抑制劑為選自：Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CHO(y-VAD-CH0)和Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CMK(Ac-Y-VAD-cmk)的人源半胱天冬酶-1的合成肽抑制劑。 [0062]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述抑制劑為具有以下肽序列：GILEGICGTV HDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRG(SEQIDNo·15)能夠干擾半胱天冬酶-4 的活性部分的氨基酸序列。
[0063]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述抑制劑為使用以下肽抗原對實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物進(jìn)行免疫 之后獲得的疫苗和/或抗體：
[0077]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述抑制劑為選自能夠干擾半胱天冬酶-4SEQ ID N.29(NCBI參考序列:NM_001225.3)的mRNA序列的核苷酸序列的siRNA。
[0078] 在本發(fā)明中，"適當(dāng)?shù)膶φ?或"合適的對照"可以為從健康受試者分離出來的或者 從患有另一種腫瘤的患者中分離出來的樣品中的經(jīng)過定量、測量或評(píng)估的量。
[0079] 在用于監(jiān)控腫瘤的進(jìn)程的方法的情況下，適當(dāng)?shù)膶φ盏牧炕蚝线m的對照樣品的量 可以為在開始治療之前的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)、在治療等過程中的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)從相同受試者中分離 出來的樣品中的經(jīng)過定量、測量或評(píng)估的量。
[0080] 在根據(jù)本發(fā)明的體外或離體方法中，階段a)優(yōu)選地通過免疫組織化學(xué)、細(xì)胞學(xué)、 ELI SA、流式細(xì)胞術(shù)或熒光光譜測定法來實(shí)施。
[0081] 在本發(fā)明中，術(shù)語"檢測"是指對表明樣品中存在蛋白或者樣品中所述目標(biāo)蛋白的 絕對量或相對量的信號(hào)的任何方法的任何使用。該方法可以與例如通過免疫組織化學(xué)染 色、ELISA、細(xì)胞懸浮、細(xì)胞學(xué)、焚光、放射活性、比色法、重量分析、X-射線衍射或吸附、磁力、 酶活性提供信號(hào)的蛋白或核酸染色方法以及類似方法相結(jié)合。
[0082] 在本發(fā)明中，術(shù)語"定量"可以理解為對各個(gè)蛋白質(zhì)的量或濃度或水平進(jìn)行的測 量，優(yōu)選地以半定量或定量的方式。可以直接或間接測量生物標(biāo)記物。如在說明書中所使用 的，術(shù)語"量"是指但不限于蛋白質(zhì)的絕對量或相對量，以及與蛋白質(zhì)相關(guān)的或者可以由這 些蛋白質(zhì)產(chǎn)生的任意其它值或參數(shù)。所述值或參數(shù)包括通過蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)獲得 的信號(hào)強(qiáng)度值、通過直接測量獲得的信號(hào)強(qiáng)度值，例如免疫分析、質(zhì)譜或核磁共振中的強(qiáng)度 值。而且，這些值或參數(shù)包含通過間接測量獲得的那些。
[0083]術(shù)語"變體"是指基本上與如上所限定的生物標(biāo)記物蛋白同源的蛋白。通常，變體 包括氨基酸的增加、缺失或替換。術(shù)語"變體"還包括蛋白質(zhì)的各種異構(gòu)體和來源于翻譯后 修飾(如，例如糖基化、磷酸化或甲基化)的蛋白質(zhì)類。
[0084]術(shù)語"衍生物或功能性片段"是指以如上所述的生物標(biāo)記物的相同功能(例如具有 結(jié)合AM2和/或誘導(dǎo)警報(bào)器(如IL-la和HMGB1)的釋放的能力）為特征的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片 段。
[0085]當(dāng)提及抗體時(shí)，術(shù)語"片段"包含scFv(雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體)片段、Fab 片段和F(ab'）2片段。
[0086] 本發(fā)明還涉及用于預(yù)防癌癥的方法，該方法包括鑒定或檢測如上所限定的生物標(biāo) 記物。當(dāng)鑒定出存在這種生物標(biāo)記物時(shí)，可以對患者進(jìn)行治療。
[0087] 如本發(fā)明中所描述的生物標(biāo)記物可以用于預(yù)防癌癥。
[0088]參考以下附圖以非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述。
【附圖說明】
[0089] 圖1.小鼠中肺癌誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)方案。
[0090] 圖2.通過蘇木精和伊紅（H&E)染色（圖2A)、Ki-67 (圖2B)和K-Ras (圖2C)分析肺冰 凍切片。這些肺切片是從用致癌物質(zhì)NMU處理的患有肺癌的小鼠獲得的。（圖2D)對用NMU處 理的小鼠的肺中的腫瘤生長（表示為腫瘤面積/總面積）進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM〇
[0091] 圖3.相比于僅顯示出非活性形式(p46kDa)的空白（未處理)小鼠，活性形式的半胱 天冬酶_ll(p20kDa)在不同的時(shí)間點(diǎn)存在于患有癌癥的小鼠的肺中。
[0092] 圖4 . A. C 5 7 B1 / 6小鼠相對于12 9 S v小鼠中的腫瘤生長（A) ; B .相比于對照小鼠 (CTR)，用中和IL-1 α的活性的抗體(Ab)處理的C57B1 /6小鼠中的肺癌生長。
[0093]圖5. C57B1/6肺荷瘤小鼠中半胱天冬酶-1 (p20kDa)的激活（圖5B)，但空白小鼠（圖 5A)和129Sv小鼠（圖5C)中的半胱天冬酶-1 (p20kDa)沒有激活。
[0094]圖6.相比于C57B1/6動(dòng)物，基因缺失半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11(半胱天冬酶-1/11敲除）的小鼠中腫瘤病變減少（圖6六）（#邙〈0,0005，*#噸〈0,0001)，數(shù)據(jù)堪比在1293￥ 動(dòng)物中獲得的數(shù)據(jù)（圖6B)。用半胱天冬酶-1已知的特異性抑制劑(Ac-Y-VAD-cmk，Sigma Aldrich，cat·N.SML-0429，Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯甲基酮；或or y-VAD-CHO，Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CHO，Santa Cruz技術(shù)，美國，cat · N. sc-3069)藥物性抑制減少了暴露于NMU的 C57B1/6小鼠中的腫瘤病變（圖6C) (*p〈0.05，**p〈0.01)，即使這種傷害比不上半胱天冬酶-1 /11敲除和129Sv小鼠中所觀察到的傷害(圖6D)
[0095]圖7.相比于對照動(dòng)物或用對照同種型（兔子IgG)處理的動(dòng)物，給藥能夠抑制半胱 天冬酶-11的活性的抗體顯著降低了（*P〈〇.05)腫瘤塊。
[0096]圖8.免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。圖8A)半胱天冬酶-11結(jié)合A頂2炎性體絡(luò)合物；圖8B)A頂2 結(jié)合至8-OH-dG。
[0097]圖9.A.從患有肺癌的患者中獲得的肺組織勻漿中存在半胱天冬酶4的前體(p48-kDa)和活性形式(p20kDa)(A)。相同患者的肺"健康"部分用Η鑒別，而腫瘤部分用LC鑒別。 [0098]圖9Β.患有肺癌的患者的肺組織勻漿中存在半胱天冬酶-1的前體(p46_kDa)和活 性形式(p20kDa)。
[0099]圖10 . A.相比于健康個(gè)體(H)，患有癌癥的患者(LC)中存在IL-1 α的活性部分；圖 10Β.通過ELISA對E-?α進(jìn)行定量，表示為pg/mg所分析的肺組織，C.健康的和具有肺癌的人 肺的組織勻漿中的IL-Ιβ的含量。
[0100]圖11.對健康的(H)和具有腫瘤病變(LC)的肺組織勻漿進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。半 胱天冬酶-4結(jié)合AIM2炎性體絡(luò)合物。
[0101] 圖12.表示對文獻(xiàn)中所報(bào)道的（A)與這些作者現(xiàn)在所發(fā)現(xiàn)的（B)進(jìn)行比較的流程 圖。A.已知的是由于感染了病原體，經(jīng)典炎性體依賴性半胱天冬酶-1通路被激活。促炎性細(xì) 胞因子，如 IL-Ιβ 和 IL-18[NCBI 登記號(hào)：小鼠：NP_032386.1](SEQ ID No. 13);人源： [AAH07461.1 (SEQ ID No. 14)]的釋放提供了放大促炎性應(yīng)答的級(jí)聯(lián)事件，從而使得宿主能 夠促進(jìn)病原體清除。相反地，在腫瘤環(huán)境中，（B)由于AIM2-依賴性炎性體絡(luò)合物的預(yù)致敏， 小鼠中的半胱天冬酶-11和人類中的半胱天冬酶-4參與了炎性應(yīng)答的誘導(dǎo)。響應(yīng)于對羥基 核苷(8-OH-dG，氧化應(yīng)激的標(biāo)記物）的A頂2識(shí)別這種機(jī)制被激活。
【具體實(shí)施方式】
[0102] 實(shí)施例
[0103] 材料和方法
[0104] 肺惡性上皮腫瘤的鼠模型.對C57B1/6小鼠（Harlan實(shí)驗(yàn)室，意大利)和129SV小鼠， 以及半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11敲除的小鼠 （Charles River實(shí)驗(yàn)室，意大利）（雌性，6-8周齡)氣管內(nèi)（i .t.)滴注致癌物質(zhì)（N-亞硝基-N-甲基-脲(匪U)，具有烷基化和致突變活 性）。按照以下給藥方案和劑量，每7天給藥一次NMU，共給藥三次:第0天，50yg/小鼠；第8天， 1 〇yg/小鼠和第15天，1 Oyg/小鼠（圖1)。在一些實(shí)驗(yàn)中，將抗-1L-1 α抗體(Ab) (2yg/大鼠 i ·ρ· ;eBioscience公司，美國），或者半胱天冬酶-1抑制劑(Ac-Y-VAD-cmk: 10ug/小鼠 i ·ρ·， Sigma Aldrich公司，美國），或者抗-半胱天冬酶-11抗體（10ug/小鼠 ，i ·ρ· ; Santa Cruz公 司，美國）對用NMU處理的C57B1/6小鼠給藥。根據(jù)圖1中所示的方案，在不同的時(shí)間點(diǎn)（從第 一次NMU給藥的3-7-30天)處死動(dòng)物。將腫瘤病變表示為腫瘤病變面積/肺總面積的比。
[0105] 肺惡性上皮腫瘤的人源樣品.按照胸外科手術(shù)和肺切除手術(shù)在患有上皮樣起源的 III期腫瘤、非小細(xì)胞肺癌類型的腺癌的患者中獲得人類樣品。從宏觀上離腫瘤區(qū)域很遠(yuǎn)的 肺部獲得健康部分，用Η表示。人源組織由Department of Thoracic Surgery of the Azienda Ospedaliera Universitaria San Giovanni di Dio e Ruggi d'Aragona，薩勒 諾，意大利提供(獲得知情同意）。
[0106] 免疫印跡分析.用由膠原酶（lU/ml)和DNAse I(20μg/ml)組成的消化液對老鼠肺 部和人源樣品進(jìn)行消化。蛋白測定后，將樣品上樣（50yg/樣品）到12%聚丙烯酰胺凝膠上， 然后轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜。采用抗-半胱天冬酶-4(Santa Cruz公司，美國）、抗-半胱天冬酶-1 (Santa Cruz公司，美國）、抗-半胱天冬酶_ll(Santa Cruz公司，美國）、抗_IL_la(R&D System公司，英國）抗體。通過GAPDH識(shí)別進(jìn)行上樣對照。
[0107] 在另一組實(shí)驗(yàn)中，通過使用能夠結(jié)合一抗（半胱天冬酶-11、或半胱天冬酶-4、或 A頂2)和特異性抗原的磁珠對人源和鼠源的組織勻漿進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。在第二階段，通過 采用合適的抗體對被一抗識(shí)別的具有A頂2或8-OH-dG的靶標(biāo)的共探測進(jìn)行評(píng)估以檢測A頂2 或8-OH-dG的存在或不存在。
[0108] ELISA.按照試劑盒制造商（eBioscience公司，美國）提供的說明，對人源和鼠源肺 組織勾楽在IL_la和IL-Ιβ的存在進(jìn)彳丁測試(獲得知情同意）。
[0109] 免疫組織化學(xué)分析.將用NMU處理的小鼠的左葉固定在0CT介質(zhì)(TedPe 1 la公司，米 蘭，意大利）中，然后切成7_12μπι冰凍切片，并用蘇木精和伊紅(H&E)染色以突出與經(jīng)過免疫 熒光染色以鑒別肺癌病變中K-ras的存在(Cell Signalling公司，英國）的冰凍切片相關(guān)的 形態(tài)特征，和/或突出與根據(jù)二氨基聯(lián)苯胺的方法(DAB)經(jīng)過免疫組織化學(xué)分析以檢測由 Ki_67(腫瘤標(biāo)記物，Invitrogen公司，意大利）和HRP二抗組成的免疫絡(luò)合物的冰凍切片相 關(guān)的組織的形態(tài)特征。將Ki-67(抗大鼠 IgG)的對照同種型用作陰性對照。
[0110] 統(tǒng)計(jì)分析.將結(jié)果表示為平均值土SEM。視情況采用單因素方差分析和/或?qū)W生t檢 驗(yàn)對各組之間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。認(rèn)為P-值小于0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。
[0111] 結(jié)果
[0112] 1.半胱天冬酶-11參與小鼠的肺癌生長。
[0113] 在C57B1/6小鼠中，用NMU進(jìn)行處理產(chǎn)生了腫瘤病變，如通過對腫瘤增殖標(biāo)記物(如 Ki-67 (圖2B)和K-Ras (圖2C))呈陽性的肺冰凍切片（圖2A)所表明的。在用匪U處理的小鼠 中，腫瘤塊生長(計(jì)算為腫瘤面積和總面積之間的比）具有指數(shù)型（圖2D)。
[0114] 一個(gè)非常有趣的發(fā)現(xiàn)(本發(fā)明的目的）為觀察到，相比于沒有顯示出酶(P20kDa)的 活性形式而只有非活性形式(p48kDa)的空白（未處理)小鼠，從NMU給藥后第3天一直到4周， 半胱天冬酶-11是活性的（圖3)。
[0115]為了突出半胱天冬酶-11在肺腫瘤生長中的作用，采用缺失半胱天冬酶-11的 129Sv小鼠 （Kayagaki等人·，2011)。用MIU處理過的129Sv小鼠形成了極小的腫瘤塊（7天： 0.043±0.013;30天：0.055±0.012)，相比于接受相同處理的C57B1/6小鼠（7天：0.101 土 0.013;30天：±0.123 0.016)(圖4六;*邙〈0.01;#邙〈0.005)。此外，參與釋放警報(bào)器（如11^-la(Ng和Monack，2013))的半胱天冬酶-11，用NMU和用抗-IL-la抗體同時(shí)處理的C57B1/6動(dòng) 物顯示出顯著降低的腫瘤病變（7天：0.056±0.013，口〈0.05;0.047±0.016,30天$〈0.005) (圖4)，完全堪比在缺失半胱天冬酶-11的129Sv小鼠中所觀察到的腫瘤發(fā)展(7天:0.043土 0.013;30天:0.055±0.012)。該發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地證實(shí)了半胱天冬酶-11在小鼠中的肺腫瘤生 長中的作用。
[0116] 由于已經(jīng)報(bào)道了半胱天冬酶-11可以通過半胱天冬酶-1的激活而誘導(dǎo)非經(jīng)典炎性 體通路的激活(Case等.，2013)，在我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭形覀冞€觀察到，相比于空白小鼠，半胱 天冬酶-1在不同的時(shí)間點(diǎn)（3-7-30天)被激活，如圖5B對5A所示。還有趣地觀察到，在用NMU 處理的129Sv小鼠中半胱天冬酶-1沒有被激活，這表明半胱天冬酶-1的活性和肺腫瘤生長 中存在的功能性半胱天冬酶-11之間密切相關(guān)。
[0117] 為了支持這一點(diǎn)，基因缺失半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-11(半胱天冬酶-1/11敲 除）的小鼠顯示出比C57B1/6動(dòng)物小的腫瘤病變(#*p〈0 · 0005，##p〈0 · 0001)(圖6A)。而 且，這些數(shù)據(jù)堪比在暴露于NMU的129Sv動(dòng)物中獲得的那些（圖5C)，由此表明半胱天冬酶-11 對肺癌發(fā)生發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。此外，為了支持以上陳述，用已知的特異性半胱天冬酶-1抑 制劑(Ac-Y-VAD-cmk:y-VAD)處理暴露于NMU的C57B1/6動(dòng)物。如圖6C所示，在用y-VAD處理的 動(dòng)物中降低了腫瘤病變(*P〈〇.05,**p〈0.01)，盡管這種損傷不可與在半胱天冬酶-1/11敲 除和129Sv小鼠中所觀察到的損傷相比（圖6D)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了半胱天冬酶-11的主要活 性，即在肺癌發(fā)生過程中調(diào)控半胱天冬酶-1的活性。而且，相比于對照或經(jīng)過處理的具有對 照同種型(兔IgG)的動(dòng)物，用能夠抑制半胱天冬酶-11活性的抗體處理小鼠顯著減小了（*p〈 0.05)腫瘤塊（圖7)。
[0118] 在文獻(xiàn)中眾所周知的是，半胱天冬酶-11能夠通過NLRP3(炎性體組分之一)誘導(dǎo)半 胱天冬酶_l(Case等人.，2013)。由于在我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，C57Bl/6(圖3)中的半胱天冬酶-11的激活與活性半胱天冬酶-1有關(guān)(圖5)，而在缺失半胱天冬酶-11的129Sv小鼠中，半胱天 冬酶-1是非活性的（圖5C)，對來自空白和用NMU處理的小鼠 C57B1/6的肺組織勻漿的樣品進(jìn) 行免疫沉淀反應(yīng)。進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)以確定半胱天冬酶-11結(jié)合至炎性體組分(如NLRP3和AM2)。 免疫印跡分析顯示半胱天冬酶-11能夠結(jié)合AM2,而不結(jié)合NLRP3(在該免疫沉淀反應(yīng)分析 中沒有揭示:未示出數(shù)據(jù)）（圖8A)。而且，觀察到結(jié)合至半胱天冬酶-1 (Schroder和Tschopp， 2010)和半胱天冬酶-11 (如本文中所表明）的A頂2的激活由羥基鳥嘌呤衍生物(8-OH-dG)誘 導(dǎo)（圖8)。具體地，通過對從空白或NMU-處理的C57B1 /6小鼠中獲得的肺組織勻漿的AM2免 疫沉淀物的免疫印跡進(jìn)行的8-OH-dG檢測顯示出，相比于空白小鼠，8-OH-dGs被結(jié)合至具有 肺腫瘤的小鼠中的A頂2(圖8B)。該發(fā)現(xiàn)從未在文獻(xiàn)中報(bào)道過，且該發(fā)現(xiàn)提供了小鼠肺癌發(fā) 生過程中參與非經(jīng)典炎性體通路的半胱天冬酶-11的新的作用機(jī)制。
[0119] 2.半胱天冬酶-4在肺惡性上皮腫瘤的人源腫瘤組織中是活性的。
[0120] 為了使本研究到翻譯水平，對半胱天冬酶-11的人源類似物（即半胱天冬酶-4)的 作用進(jìn)行了分析。相比于健康的組織，半胱天冬酶-4在來自7名患者的經(jīng)分析的所有腫瘤組 織中是活性的（圖9A)。而且，在相同的組織中，發(fā)現(xiàn)在腫瘤部分比在健康部分中半胱天冬 酶-1被更多地激活（圖9B)。因此，人類中存在的這些酶的活性相似于在小鼠中所觀察到的 活性。此外，在腫瘤組織中IL-la(圖10A和B，林p〈0.005)和IL-Ιβ(圖1(?，邙〈0.05)的存在比 在正常組織中高。類似于在小鼠中所觀察到的，半胱天冬酶4與AM2有關(guān)，如通過對人源健 康肺組織勻漿和具有腫瘤病變的肺組織勻漿進(jìn)行的免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)及其隨后的免疫印 跡分析所表明（圖11)。
[0121] 這些數(shù)據(jù)首次示出了活性形式的半胱天冬酶蛋白（特別是半胱天冬酶-4(人類中） 和半胱天冬酶-1)和由各個(gè)人源半胱天冬酶基因的同源基因編碼，特別是由人源半胱天冬 酶-4,優(yōu)選地半胱天冬酶_11(小鼠中）基因的同源基因編碼的活性形式的蛋白質(zhì)參與了肺 腫瘤發(fā)生。
[0122] 相比于在文獻(xiàn)中所報(bào)道的小鼠中（圖12的組A)，本作者示出了，除了半胱天冬酶-11/4在腫瘤生長中的作用，半胱天冬酶-4反過來被結(jié)合至8-OH-DG(鳥嘌呤核苷羥基化的衍 生物)的A頂2激活，這是由于作為炎性體激活基礎(chǔ)的氧化應(yīng)激，其反過來可促進(jìn)由致癌物誘 導(dǎo)的腫瘤生長(圖12的組B)。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于診斷和/或預(yù)后和/或用于監(jiān)控腫瘤的發(fā)展的體外或離體方法，其特征在于 確定生物標(biāo)記物的存在，所述生物標(biāo)記物選自生物樣品中的： a) 活性形式的人源半胱天冬酶蛋白； b) 其變體、功能性衍生物或功能性片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述人源半胱天冬酶蛋白為人源半胱天冬酶_4蛋 白（SEQ ID No.l)或人源半胱天冬酶-1蛋白（SEQ ID No.2)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括以下步驟： a) 對從受試者分離出來的樣品中的如權(quán)利要求1或2中所限定的生物標(biāo)記物進(jìn)行確定 和/或定量，和 b) 將其與給定的對照進(jìn)行比較。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，還包括對至少一種其它腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行 確定和/或定量并與適當(dāng)?shù)膶φ諛悠愤M(jìn)行比較。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述其它標(biāo)記物為根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物 標(biāo)記物的促炎性細(xì)胞因子效應(yīng)器，優(yōu)選地所述促炎性細(xì)胞因子為IL-la、IL-li3、IL_18或 HMGBl〇6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法確定了預(yù)后和/或 監(jiān)控腫瘤的發(fā)展和/或進(jìn)程過程中生物樣品中的所述生物標(biāo)記物的存在的增加和/或減少。7. 根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述從受試者分離出來的樣品為生物 流體、細(xì)胞樣品和/或組織樣品。8. -種用于診斷和/或預(yù)后和/或用于監(jiān)控腫瘤的發(fā)展和/或進(jìn)程的試劑盒，包括： -用于確定和/或測量至少一種如權(quán)利要求1或2中所限定的生物標(biāo)記物的量和/或用于 測量至少一種如權(quán)利要求1或2中所限定的生物標(biāo)記物的量的改變的裝置，和任選地 -控制裝置。9. 一種如權(quán)利要求1或2中所限定的生物標(biāo)記物的特異性抑制劑，用于預(yù)防和/或治療 所述腫瘤，其中所述抑制劑優(yōu)選地為抗體、合成肽、氨基酸和/或核苷酸序列、疫苗、siRNA或 低分子量藥物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的特異性抑制劑，其中所述抑制劑為選自：抗-半胱天冬酶-1抗 體、抗-半胱天冬酶-4抗體、抗-IL-la抗體、抗-IL-Ιβ抗體、抗-IL-18抗體或抗-HMGB1抗體或 其片段的抗體。11. 根據(jù)權(quán)利要求1或2使用的生物標(biāo)記物、根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的體外或離體方 法、根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒、根據(jù)權(quán)利要求9使用的抑制劑，其中所述腫瘤為肺癌。12. 根據(jù)權(quán)利要求11使用的生物標(biāo)記物、根據(jù)權(quán)利要求11的方法、根據(jù)權(quán)利要求11使用 的抑制劑，其中所述肺癌為肺惡性上皮腫瘤。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK106030308SQ201580009282
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年2月19日
【發(fā)明人】奧爾多·平托, 瑞塔·帕特里齊亞·阿基諾, 羅莎琳達(dá)·索倫蒂諾, 米凱拉·泰爾利齊
【申請人】免疫制藥股份責(zé)任有限公司