一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞dna損傷的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的試劑盒及方法，該方法包括鋪膠、裂解、解旋、電泳、中和洗滌、干燥、染色，再采用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍攝照片，分析評價(jià)細(xì)胞DNA的損傷程度。傳統(tǒng)的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)在樣品制備時(shí)需在載玻片上鋪制三層凝膠，具有操作復(fù)雜、容易脫膠、樣品圖像不清晰等缺點(diǎn)，而本發(fā)明只需在載玻片上鋪制一層膠，具有樣品制備工藝簡單、脫膠率低、易于操作和實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的 試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著中國經(jīng)濟(jì)的加速發(fā)展，環(huán)境污染也日趨嚴(yán)重。目前，全球范圍內(nèi)的環(huán)境污染對 人體健康也受到越來越多的關(guān)注。其中，環(huán)境污染物造成DNA的損傷會影響細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定 性，并可能對后代產(chǎn)生影響，引起孕婦流產(chǎn)、死胎、畸胎和某些遺傳性疾病等。由于細(xì)胞的 DNA損傷會造成疾病，威脅人類健康，因此對細(xì)胞DNA損傷進(jìn)行檢測，并了解這一損傷能否引 起細(xì)胞事件的變化就顯得十分重要。
[0003] 1976年，⑶0K等人發(fā)明了 一種研究細(xì)胞DNA損傷的方法，即單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù) (Cook P.R，Brazell I.A，Jost E.Journal of Cell Science，1976,22(2):303_324.)〇 1978年，Rydberg和Johanson在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上第一次報(bào)道直接在單個(gè)細(xì)胞的水平上對 損傷進(jìn)行定量檢測（Rydberg B，Johanson K J.DNA Repair Mechanisms, 1978(03):465-468 .)。在上述方法的基礎(chǔ)上，0s t ling和Johanson于1984年建立了微凝膠電泳技術(shù) (Ostling 0,Johanson K J.Biochemical and Biophysical Research Communications, 1984，123 (1): 291-298.)，該技術(shù)在解旋后增加了電泳步驟，使斷片從細(xì)胞核向陽極移動， 以形成類似于彗星的尾巴，但是中性條件下的裂解和電泳只能檢測細(xì)胞中的雙鏈DNA斷片， 不能測定單鏈斷裂。因此1988年Singh建立了堿性彗星實(shí)驗(yàn)(pH>13.0)，該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測單、 雙鏈的斷裂和堿性不穩(wěn)定點(diǎn)（某些損傷因子能夠?qū)е旅撪堰驶蛘呙撪奏の稽c(diǎn)的產(chǎn)生，形成 堿性不穩(wěn)定點(diǎn)，其在強(qiáng)堿條件下能夠轉(zhuǎn)換成DNA鏈的斷裂），從而使檢測的靈敏度得到極大 改善（Singh N P，McCoy M T，Tice R R，et al .Experimental Cell Research, 1988,175 (1): 184-191.)。自從堿性彗星實(shí)驗(yàn)問世以來，各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測細(xì) 胞DNA的損傷，與此同時(shí)，也在不斷的對該方法進(jìn)行改良，使之能夠檢測細(xì)胞內(nèi)不同的DNA損 傷，例如單雙鏈的斷裂、堿基的氧化損傷、DNA-DNA/DNA-蛋白質(zhì)-藥物交聯(lián)以及修復(fù)等，但 是，該方法也存在一系列弊端，例如操作復(fù)雜、容易脫膠、樣品圖像不清晰等，從而影響圖像 的結(jié)果分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測 細(xì)胞DNA損傷的試劑盒及方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中操作復(fù)雜、細(xì)胞容易脫膠、樣品圖像不 清晰等問題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測 細(xì)胞DNA損傷的試劑盒，包括如下試劑:低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠、細(xì)胞裂解液、堿性電泳緩沖液、 染色液。低熔點(diǎn)瓊脂糖是指膠凝溫度為26 °C_30°C (1 · 5 % gel)、熔化溫度<65 °C (1 · 5 % gel) 的瓊脂糖。
[0006] 進(jìn)一步地，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠是指低熔點(diǎn)瓊脂糖與無鈣、鎂的PBS的混合液，低熔 點(diǎn)瓊脂糖凝膠中低熔點(diǎn)瓊脂糖的質(zhì)量濃度為〇 . 75 % ;細(xì)胞裂解液包括2.5mmol/L NaCl、 100mmol/L Na2-EDTA、100mmol/L Tris，pH為10,臨用前加Triton X-100至體積分?jǐn)?shù)為1%， 同時(shí)加DMS0至體積分?jǐn)?shù)為10% ;堿性電泳緩沖液包括200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA;染色 液為核酸凝膠電泳染料Gelgreen或Genelight。
[0007] 本發(fā)明第二方面提供一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，包括如下步 驟：
[0008] 1)鋪膠:在載玻片上鋪設(shè)蓋玻片，且形成以載玻片為底面、蓋玻片為側(cè)壁的小槽， 即微電泳槽;將DNA樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻得細(xì)胞混合液，采用所述細(xì)胞混合液 在電泳槽中鋪膠，蓋玻片與載玻片之間存在間隙，微電泳槽上的細(xì)胞混合液在凝固前滲入 兩側(cè)的縫隙中，蓋玻片與載玻片之間存在間隙，微電泳槽上的細(xì)胞混合液在凝固前滲入兩 側(cè)的間隙中；蓋玻片厚度較小，便于裁取，粘在載玻片上的玻片可以為完整的蓋玻片，也可 以是裁切至一定尺寸的窄片。微電泳槽上凝膠的兩側(cè)被固定，有效解決了容易脫膠的問題。
[0009] 2)裂解:將鋪膠后的載玻片浸入細(xì)胞裂解液中裂解。
[0010] 3)解旋、電泳、中和洗滌:將裂解后的載玻片浸入堿性電泳緩沖液中解旋，解旋完 畢后電泳，電泳結(jié)束后，中和洗滌載玻片；其中的載玻片優(yōu)選為光滑載玻片，便于圖像的采 集和分析，提高彗星實(shí)驗(yàn)檢測的靈敏度。
[0011] 4)干燥:將中和洗滌之后的載玻片干燥。
[0012 ] 5)染色:瓊脂圈染色、干燥后，分析評價(jià)細(xì)胞DNA的損傷程度。
[0013] 進(jìn)一步地，步驟1)中，細(xì)胞DNA損傷樣品懸液是指懸浮有細(xì)胞DNA損傷樣品且無鈣、 鎂的PBS，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠是指低熔點(diǎn)瓊脂糖與無鈣、鎂的PBS的混合液，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝 膠中低熔點(diǎn)瓊脂糖的質(zhì)量濃度為〇 . 75%，細(xì)胞DNA損傷樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的體 積比為1:10。
[0014] 更進(jìn)一步地，細(xì)胞DNA損傷樣品懸液中細(xì)胞密度為1 X 105cells/ml。
[0015] 進(jìn)一步地，懸浮有細(xì)胞DNA損傷樣品的PBS的溫度為37°C，防止細(xì)胞熱休克。
[0016] 優(yōu)選地，步驟1)中，微電泳槽的制作方法如下:將蓋玻片劃成窄條，將窄條無縫粘 結(jié)在載玻片的中部，再將新蓋玻片粘在載玻片的兩端，蓋玻片與窄條之間留有間距，形成微 電泳槽。當(dāng)然，也可以不使用窄條，將載玻片裁短，在載玻片的兩端粘接蓋玻片，兩個(gè)蓋玻片 之間留有間距，形成微電泳槽，蓋玻片與載玻片之間留有縫隙，便于低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠滲入 其中，對微電泳槽中的樣品起到固定作用。
[0017] 優(yōu)選地，所述窄條為長方形窄條。
[0018] 優(yōu)選地，微電泳槽的寬度為10mm。
[0019] 優(yōu)選地，步驟1)中，粘接時(shí)采用的膠水為UF0強(qiáng)力膠水、AB膠或中性玻璃膠。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟5)中，瓊脂圈染色時(shí)，選取的染色液為核酸凝膠電泳染料Gelgreen 或Genelight。
[0021] 進(jìn)一步地，步驟1)中，將細(xì)胞混合液平鋪于微電泳槽中，細(xì)胞混合液在凝固前滲入 兩端的蓋玻片中，4°C避光凝固25-30min。
[0022] 進(jìn)一步地，步驟2)中，所述裂解為避光裂解，細(xì)胞裂解液包括2.5mmol/L NaCl、 100mmol/L Na2-EDTA、100mmol/L Tris，pH為10;臨用前加Triton X-100至體積分?jǐn)?shù)為1%， 同時(shí)加DMSO至體積分?jǐn)?shù)為10% ;細(xì)胞裂解條件為:溫度4°C，時(shí)間1-2h。
[0023] 進(jìn)一步地，步驟3)中，將裂解后的細(xì)胞用蒸餾水清洗，再將其置于堿性電泳緩沖液 中避光解旋，解旋時(shí)采用的堿性電泳緩沖液中包括200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA，細(xì)胞解 旋條件為:溫度4°C，時(shí)間20-40min。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟3)中，解旋后，將載玻片放在電泳槽中，加入新的預(yù)冷堿性電泳緩 沖液進(jìn)行電泳，電泳條件為:溫度4°C，電壓21V，時(shí)間20-30min;新的堿性電泳緩沖液包括 200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA，即電泳時(shí)所采用的緩沖液與解旋時(shí)所采用的緩沖液相同。 中和洗滌時(shí)采用Tri s-HCl緩沖液;步驟4)中，載玻片的干燥溫度為37-45 °C，干燥時(shí)間為10-15min〇
[0025] 如上所述，本發(fā)明的一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的試劑盒及方法，具有 以下有益效果:⑴實(shí)施過程簡單易控;⑵該方法有效降低脫膠率，樣品圖像更加清晰；⑶本 發(fā)明有效降低實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，染色液用安全的核酸電泳染料Gelgreen或Genelight代替溴化乙 錠染料，染色效果更好，也減少了對實(shí)驗(yàn)者的身體危害。
[0026]傳統(tǒng)的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)在樣品制備時(shí)需在載玻片上鋪制三層凝膠，具有操作 復(fù)雜、容易脫膠、樣品圖像不清晰等缺點(diǎn)，而本發(fā)明采用自制的載玻片，只需在載玻片上鋪 制一層膠，具有樣品制備工藝簡單、脫膠率低、易于操作、實(shí)驗(yàn)成本低、圖像清晰等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0027]圖1顯示為細(xì)胞包埋時(shí)所用的自制載玻片。
[0028]圖2顯示為對照組的彗星圖像照片。
[0029]圖3顯不為5mg/L氧化石墨稀暴露293T細(xì)胞24h后的彗星圖像照片。
[0030]圖4顯不為25mg/L氧化石墨稀暴露293T細(xì)胞24h后的彗星圖像照片。
[0031]圖5顯示為50mg/L氧化石墨烯暴露293T細(xì)胞24h后的彗星圖像照片。
[0032]圖6顯不為100mg/L氧化石墨稀暴露293T細(xì)胞24h后的彗星圖像照片。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0034] 選用人胚腎細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在37°C、5%⑶2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 待細(xì)胞長至對數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞接種于六孔板中，加入3mL培養(yǎng)液(培養(yǎng)液的配制:根據(jù)所需培 養(yǎng)液的體積分別加入Gibco-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素一鏈霉素溶液（100X)，使各組 成成分的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到49%、10%和1 % )。
[0035]暴露液的配制：稱取0.005g氧化石墨烯置于棕色瓶中，加入lml蒸餾水，搖勻后超 聲30min，使氧化石墨稀均勾分散于水中。再分別移取60μ1、30μ1的母液至4mlEP管中，加入 相應(yīng)的培養(yǎng)液，配制成3ml濃度為100mg/l、50mg/l的暴露液，再將50mg/l的暴露液稀釋成 25mg/l和5mg/l的暴露液。
[0036]待細(xì)胞長至70 %左右的匯合度后，將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，加入相應(yīng)濃度的暴露液，暴 露 24h。
[0037]細(xì)胞暴露后，將暴露液棄去，用1 X PBS清洗細(xì)胞兩到三次，再用預(yù)冷的1 X PBS將細(xì) 胞吹打下來，將細(xì)胞重懸至1 X l〇5cells/ml，整個(gè)過程要避光。
[0038]載玻片的制作：用玻璃刀將蓋玻片劃成兩個(gè)20mmX 10mm的長方形窄條，然后將窄 條用UF0膠水粘到干凈的光滑載玻片的中部，再用UF0膠水將完整的蓋玻片粘到載玻片兩 端，使蓋玻片與窄條之間留有一部分空間，即微電泳槽(本實(shí)施例中，電泳槽的寬度為1〇_， 電泳槽的長度與載玻片的寬度一致）。中部的長方形蓋玻片窄條與載玻片之間完全緊貼，即 無縫粘接，起到隔離作用，形成兩個(gè)微電泳槽，得到兩組樣品，兩端的蓋玻片與載玻片之間 均存在一定的縫隙，使得細(xì)胞混合液在凝固前可以滲入其中，制得的載玻片如圖1所示。當(dāng) 然，粘接蓋玻片時(shí)也可以采用AB膠、中性玻璃膠等其他膠水，但是，AB膠使用時(shí)要進(jìn)行調(diào)配， 操作不方便；中性玻璃膠粘接之后，蓋玻片難以取下，不便于在拍照結(jié)束之后對載玻片和蓋 玻片的內(nèi)側(cè)進(jìn)行徹底清洗，因此，本實(shí)施例優(yōu)選采用UF0強(qiáng)力膠水（型號:Art. N0.01003)， UFO強(qiáng)力膠水在空氣中快速凝固，在粘接蓋玻片時(shí)操作方便，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用酒精浸泡載 玻片3-5min左右，再用清水沖洗，即可將蓋玻片從載玻片上取下，操作簡單。蓋玻片的厚度 較薄，通常在0.13-0.20mm，便于裁取。電泳槽兩側(cè)的玻片起到固定瓊脂糖的作用，有效防止 脫膠，電泳槽的形狀不限于圖1所示的長方形，其他任何能夠達(dá)到上述目的的電泳槽形狀也 在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0039] 細(xì)胞裂解液的配制:細(xì)胞裂解液可先配好貯備液，使用前配好應(yīng)用液。細(xì)胞裂解液 貯備液的配制：貯備液包括2.5mM NaCl、100mM Na2_EDTA、100mM Tris，用NaOH調(diào)節(jié)pH到10， 高溫滅菌，室溫保存。細(xì)胞裂解液應(yīng)用液的配制：臨用前向貯備液中加入Triton X -100至 體積分?jǐn)?shù)為1%，同時(shí)加入DMS0(二甲基亞砜)至體積分?jǐn)?shù)為10%，置于4°C冰箱保存。
[0040] 堿性電泳緩沖液的配制：1L的體系為8gNa0H+2mlEDTA(500mM、pH = 8)，在NaOH溶解 后加dH20至1L，溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，冷卻至4 °C。
[0041 ]低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的準(zhǔn)備:配制質(zhì)量濃度為0.75%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，具體地， 稱取所需的低熔點(diǎn)瓊脂粉，放入EP管中，加入1 X PBS，邊加邊攪拌，使瓊脂糖完全分散在PBS 溶液中，將其用沸水浴加熱7min左右，邊加熱邊震蕩，待瓊脂糖完全溶解，再將其放入水浴 鍋中使其溫度降為37°C，防止細(xì)胞熱休克，制得質(zhì)量濃度為0.75%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。 [0042]鋪膠:將懸浮于1 XPBS(無Ca2+，Mg2+)的細(xì)胞與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠以1:10的體積比 混勻，制得細(xì)胞混合液，取1〇〇μ1細(xì)胞混合液平鋪于微電泳槽中，使得細(xì)胞混合液在凝固前 滲入兩端的蓋玻片中，4°C避光凝固30min，待其凝固后用紗布將載玻片包住，防止脫膠。 [0043] 裂解:將包埋好的細(xì)胞的載玻片完全浸入細(xì)胞裂解液中，4°C避光裂解90min。
[0044]解旋:將裂解后細(xì)胞用預(yù)冷的蒸餾水清洗兩到三次，再將其置于預(yù)冷的堿性電泳 緩沖液中4 °C解旋20-30min。
[0045]電泳:將載玻片平放在電泳槽中，加入新配制的濃度為200mmol/L NaOH、lmmol/L m)TA的堿性電泳緩沖液，4°C 21V電泳30min。
[0046] 中和：用Tris-HCl中和緩沖液清洗玻片三次，每次SmiruTris-HCl中和緩沖液為 0 · 4mol/L Tris-HCl，用HC1 調(diào)節(jié)pH至7 · 5，4°C保存。
[0047] 干燥:將玻片浸入dH20中兩次，每次5min，然后浸入4°C預(yù)冷的70 % (體積分?jǐn)?shù)）乙 醇溶液中5min。在37-45 °C下烘烤10-15min，將玻片烤干。該方法可使細(xì)胞單個(gè)分布，便于觀 察?？靖珊蟮臉悠吩谟^察前可室溫干燥保存。
[0048] 染色：取100此Genelight核酸電泳染色液涂在圓形的干燥瓊脂圈上，避光放置4 °(：冰箱染色20min，再用吸頭輕輕去除多余的染色液，室溫避光放置至玻片完全干燥。
[0049] 拍照:用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍攝照片，如圖2-圖6所示。
[0050] 數(shù)據(jù)分析:用CASP軟件進(jìn)行圖像分析，獲得彗星的各個(gè)相關(guān)參數(shù)，主要參數(shù)有尾部 DNA(DNAT，tail DNA)、01ive尾矩（0TM，01ive tail moment)、尾長（TL，Tail Length)、尾矩 (TM，Tai 1 moment)，通過對這些參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，得到在不同濃度下，293T細(xì)胞的DNA損傷 程度。如表1所示為不同濃度氧化石墨烯對293T細(xì)胞尾部DNA含量、DNA迀移長度、尾矩和 Olive尾矩的影響d土 s)，數(shù)據(jù)表明，293T細(xì)胞的DNA損傷與氧化石墨烯的暴露濃度之間呈 現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
[0051] 表 1
[0053] ***Ρ〈〇.〇〇1
[0054] 綜上所述，本發(fā)明采用自制的載玻片，只需在載玻片上鋪制一層膠，對鋪膠、裂解、 解旋、電泳等步驟加以優(yōu)化，使得單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)操作簡單、圖像清晰，采用安全的核 酸電泳染料Gelgreen或Genelight代替溴化乙錠染料，染色效果更好，也減少了對實(shí)驗(yàn)者的 身體危害。
[0055] 上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的試劑盒，其特征在于，包括如下試劑:低熔 點(diǎn)瓊脂糖凝膠、細(xì)胞裂解液、堿性電泳緩沖液、染色液。2. -種單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 鋪膠:在載玻片上鋪設(shè)蓋玻片，且形成以載玻片為底面、蓋玻片為側(cè)壁的小槽，即微 電泳槽;將DNA樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻得細(xì)胞混合液，采用所述細(xì)胞混合液在電 泳槽中鋪膠，蓋玻片與載玻片之間存在間隙，微電泳槽上的細(xì)胞混合液在凝固前滲入兩側(cè) 的間隙中； 2) 裂解:將鋪膠后的載玻片浸入細(xì)胞裂解液中裂解； 3) 解旋、電泳、中和洗滌:將裂解后的載玻片浸入堿性電泳緩沖液中解旋，解旋完畢后 電泳，電泳結(jié)束后，中和洗滌載玻片； 4) 干燥:將中和洗滌之后的載玻片干燥； 5) 染色:瓊脂圈染色、干燥后，分析評價(jià)細(xì)胞DNA的損傷程度。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 1)中，細(xì)胞DNA損傷樣品懸液是指懸浮有細(xì)胞DNA損傷樣品且無鈣、鎂的PBS，低熔點(diǎn)瓊脂糖 凝膠是指低熔點(diǎn)瓊脂糖與無鈣、鎂的PBS的混合液，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中低熔點(diǎn)瓊脂糖的質(zhì) 量濃度為〇.75%，細(xì)胞DNA損傷樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的體積比為1:10。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 1)中，微電泳槽的制作方法如下:將蓋玻片劃成窄條，將窄條無縫粘結(jié)在載玻片的中部，再 將新蓋玻片粘在載玻片的兩端，蓋玻片與窄條之間留有間距，形成微電泳槽。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 1)中，粘接時(shí)采用的膠水為UFO強(qiáng)力膠水、AB膠或中性玻璃膠。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 5)中，瓊脂圈染色時(shí)，選取的染色液為核酸凝膠電泳染料Gelgreen或Genelight。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 1) 中，將細(xì)胞混合液平鋪于微電泳槽中，細(xì)胞混合液在凝固前滲入兩端的蓋玻片中，4°C避 光凝固25-30min。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 2) 中，所述裂解為避光裂解，細(xì)胞裂解液包括2.5mmol/L NaCl、100mmol/L Na2-EDTA、 100mmol/L Tris，pH為10;臨用前加 Triton X-100至體積分?jǐn)?shù)為1%，同時(shí)加 DMSO至體積分 數(shù)為10 % ;細(xì)胞裂解條件為:溫度4 °C，時(shí)間1 _2h。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 3) 中，將裂解后的細(xì)胞用蒸餾水清洗，再將其置于堿性電泳緩沖液中避光解旋，解旋時(shí)采用 的堿性電泳緩沖液中包括200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA，細(xì)胞解旋條件為:溫度4°C，時(shí)間 20-40min〇10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的方法，其特征在于:步驟 3)中，解旋后，將載玻片放在電泳槽中，加入新的預(yù)冷堿性電泳緩沖液進(jìn)行電泳，電泳條件 為:溫度4°C，電壓21V，時(shí)間20-30min;中和洗滌時(shí)采用Tris-HCl緩沖液;步驟4)中，載玻片 的干燥溫度為37-45°C，干燥時(shí)間為10_15min。
【文檔編號】G01N27/447GK106018529SQ201610531656
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】裴得勝, 楊麗, 馬彥博
【申請人】中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院