一種精子dna碎片檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其屬于DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種精子DNA碎片檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]遺傳物質(zhì)的完整性對于成功妊娠和子代的健康是至關(guān)重要的，DNA碎片程度能夠反映精子遺傳物質(zhì)的完整性，深入的評估男性生育力，預(yù)測治療結(jié)局和指導(dǎo)治療。目前常用的檢測精子DNA碎片的方法主要有:精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗，單細胞凝膠電泳試驗，末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法，焚光原位雜交技術(shù)，8-輕基脫氧鳥苷測定等。然而這些方法大都需要流式細胞儀或熒光顯微鏡分析觀察，或檢測試劑昂貴或步驟繁瑣，限制了這些方法的臨床應(yīng)用。
[0003]精子染色質(zhì)擴散試驗檢測方法是利用正常精子經(jīng)過酸處理去除核蛋白后，精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，DNA環(huán)附于殘留的核結(jié)構(gòu)，形成光暈。精子染色質(zhì)損傷處產(chǎn)生單鏈DNA片斷，從而抑制了 DNA光暈的擴散，根據(jù)光暈的大小可區(qū)分精子DNA損傷程度。
[0004]中國申請201410203476.5公開了一種精子DNA碎片檢測試劑盒，所述試劑盒包括包被載玻片，易熔凝膠，A液，B液，瑞氏染液，瑞氏緩沖液，SCD保存液。該申請還公開了應(yīng)用試劑盒對精子DNA碎片的檢測方法。該申請所述SCD保存液，可以有效的保存精液標(biāo)本，使DNA碎片率在_20°C凍存兩個星期內(nèi)不發(fā)生變化，利于標(biāo)本保存；但其配方及其檢測過程方法精子尾部顯色效果不好，計數(shù)的準確率有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足公開了一種精子DNA碎片檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明要解決的問題是提供一種精子尾部顯色效果更好，準確率更高，檢測時間更短的用于精子DNA碎片檢測試劑盒組成及其應(yīng)用檢測方法。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]本發(fā)明首先提供了一種精子DNA碎片檢測試劑盒，包括:
[0008]I 液:含 0.04 ?0.08mol/L 鹽酸；
[0009]II 液:含 7.305 ?146.lg/L 氯化鈉、1.86 ?37.2g/L 乙二胺四乙酸、0.0607 ?1.214g/L三羥甲基氨基甲烷、0.5?20g/L十二烷基肌氨酸鈉、I?20mL/L聚乙二醇辛基苯基醚、4.32?86.4mL/L3 —巰基一1，2 —丙二醇，溶液PH = 7?7.5 ;
[0010]0.5?2%瓊脂糖包被的載玻片；
[0011]0.5?2%低熔點瓊脂糖；
[0012]蓋玻片；瑞氏染液；瑞氏緩沖液；
[0013]其中“ ％ ”表示重量百分比濃度。
[0014]上述試劑盒各組成制備方法如下:
[0015]—、I液的制備方法:
[0016]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，量取濃鹽酸0.335?6.7mL，加入容量瓶中，攪拌混勻。
[0017]2)以純水定容至lOOOmL，攪拌混勻。
[0018]二、II液的制備方法:
[0019]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，稱取氯化鈉7.305?146.lg、乙二胺四乙酸1.86?37.2g、三羥甲基氨基甲烷0.0607?1.214g、十二烷基肌氨酸鈉0.5?20g，加入容量瓶中，攪拌使其溶解。
[0020]2)量取聚乙二醇辛基苯基醚I?20mL、3 —巰基一 1，2 一丙二醇4.32?86.4mL，加入容量瓶中，攪拌使其溶解。
[0021]3)在PH檢測下，緩慢加入氫氧化鈉，調(diào)節(jié)PH至7?7.5。
[0022]4)以純水定容至lOOOmL，攪拌混勻。
[0023]三、瓊脂糖包被的載玻片制作方法:
[0024]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，稱取0.5?1g瓊脂糖，50?60°C加熱攪拌，使其溶解。
[0025]2)取純水定容至lOOOmL，50?60°C加熱攪拌，使其充分溶解。
[0026]3)趁熱將2)中溶液至載玻片表面平鋪，烤干。
[0027]四、低熔點瓊脂糖的制作方法:
[0028]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，稱取0.5?1g瓊脂糖，50?60°C加熱攪拌，使其溶解。
[0029]2)取純水定容至lOOOmL，50?60°C加熱攪拌，使其充分溶解。
[0030]3)趁熱將2)中溶液分裝至1.5mL樣品管中，每管0.12mL。
[0031]五、瑞氏染液及瑞氏緩沖液有市售。
[0032]本發(fā)明還提供了采用所述試劑盒進行精子DNA碎片的檢測方法，包括以下步驟:
[0033]I)將低熔點瓊脂糖加熱充分溶解后，以60 μ L/管分裝到1.5mL EP管內(nèi)，4°C保存；
[0034]2)以生理鹽水或PBS溶液將新鮮精液樣本稀釋為10?20 X 16個/mL ；
[0035]3)取60 μ L低熔點瓊脂糖溶化，在37°C孵育3分鐘；
[0036]4)步驟2)稀釋后樣本溶液30 μ L與步驟3)低熔點瓊脂糖60 μ L混勻，在37°C孵育2分鐘；
[0037]5)取20 μ L步驟4)混合液滴于包被載玻片，并迅速蓋上蓋玻片，于4°C條件下靜置5?7分鐘，使其凝固；
[0038]6)取出步驟5)的玻片后小心移去蓋玻片，立即將載玻片垂直浸入I液反應(yīng)池內(nèi)7分鐘；拭去載玻片背面多余液體后，將載玻片垂直浸入II液反應(yīng)池25分鐘；拭去玻片背面多余液體后，置超純水浸泡2?3分鐘；
[0039]7)從步驟6)所述超純水中取出后將載玻片分別依次置于50%乙醇溶液中2分鐘，70 %乙醇溶液中2分鐘，95 %乙醇溶液中2分鐘，取出后自然晾干；
[0040]8)染片，每張載玻片以瑞氏染液4?6滴覆蓋，稍等片刻再緩慢加入瑞氏緩沖液8?12滴，以洗耳球輕輕吹打混合染液，室溫放置15分鐘后用流水輕輕沖洗染片；
[0041]9)晾干后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，鏡下觀察100?500個精子，計算存在DNA碎片的精子數(shù)量；
[0042]上述“ % ”表示重量百分比濃度；
[0043]精子DNA碎片率由下式得到:
[0044]精子DNA碎片率)=存在DNA碎片精子數(shù)/被觀察精子總數(shù)X 100%。
[0045]本發(fā)明有益性:本發(fā)明精子DNA碎片檢測方法簡單、快捷，結(jié)果可靠，有利于實驗室的標(biāo)準化，分析費用低，不需要特殊儀器和試劑，運用范圍廣，滿足中小型實驗室檢測需求，也可適用于單個精子的DNA碎片檢測；本試劑盒利用精子染色質(zhì)擴散試驗原理檢測精子DNA碎片程度，結(jié)果可靠性，精子染色質(zhì)量等方面都得到極大的提升；試劑盒檢測結(jié)果圖像清晰，形成的光暈清晰且與頭部分界明顯，便于判定精子DNA損傷程度，檢測時間短，方便操作，可與后期自動化儀器兼容，完成自動化后可用于大型實驗室檢測，大大提高檢測效率。
【附圖說明】
[0046]圖1是正常精液樣本經(jīng)本發(fā)明試劑盒所述方式檢測精子DNA碎片的結(jié)果，精子DNA不存在碎片的精子頭部周圍可見明顯光暈，且與頭部分界明顯，精子DNA存在碎片的精子頭部周圍沒有明顯光暈或有很小光暈。
[0047]圖2是精液經(jīng)過氧化氫處理后，通過本發(fā)明試劑盒所述方法檢測精子DNA碎片，精子頭部周圍光暈不明顯或有很小光暈。
[0048]由上圖可看出在加入過氧化氫(已知的促進精子DNA損傷試劑)后，用本試劑盒發(fā)現(xiàn)精子的光暈消失，表明精子的DNA出現(xiàn)損傷，本發(fā)明試劑盒對精子染色效果好，光暈與背景的比值高。
[0049]圖3是正常精液樣本經(jīng)本發(fā)明試劑盒所述方式檢測精子DNA碎片的結(jié)果，精子DNA不存在碎片的精子頭部周圍可見明顯光暈，且與頭部分界明顯，精子DNA存在碎片的精子頭部周圍沒有明顯光暈或有很小光暈。
[0050]圖4是利用同類試劑盒產(chǎn)品方法檢測精子DNA碎片，精子光暈不明顯，分界不明確。
[0051]比較圖3和圖4，可知:本發(fā)明與同類產(chǎn)品的比對實驗發(fā)現(xiàn)，本試劑盒的精子染色效果明顯強于同類產(chǎn)品；光暈與背景的比值較高，提高了計數(shù)的準確性。
【具體實施方式】
[0052]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，實施例只用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整也屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0053]一、精子DNA碎片檢測試劑盒的制備
[0054]I 液:含 0.04 ?0.08mol/L 鹽酸；
[0055]II 液:含 7.305 ?146.lg/L 氯化鈉、1.86 ?37.2g/L 乙二胺四乙酸、0.0607 ?
1.214g/L三羥甲基氨基甲烷、0.5?20g/L十二烷基肌氨酸鈉、I?20mL/L聚乙二醇辛基苯基醚、4.32?86.4mL/L3 —巰基一1，2 —丙二醇，溶液PH = 7?7.5 ;
[0056]0.5?2%瓊脂糖包被的載玻片；
[0057]0.5?2%低熔點瓊脂糖；
[0058]蓋玻片；瑞氏染液；瑞氏緩沖液；
[0059]其中“ ％ ”表示重量百分比濃度。
[0060]上述試劑盒各組成制備方法如下:
[0061]I液的制備方法:
[0062]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，量取濃鹽酸0.335?6.7mL，加入容量瓶中，攪拌混勻。
[0063]2)以純水定容至lOOOmL，攪拌混勻。
[0064]II液的制備方法:
[0065]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，稱取氯化鈉7.305?146.lg、乙二胺四乙酸1.86?37.2g、三羥甲基氨基甲烷0.0607?1.214g、十二烷基肌氨酸鈉0.5?20g，加入容量瓶中，攪拌使其溶解。
[0066]2)量取聚乙二醇辛基苯基醚I?20mL、3 —巰基一 1，2 一丙二醇4.32?86.4mL，加入容量瓶中，攪拌使其溶解。
[0067]3)在PH檢測下，緩慢加入氫氧化鈉，調(diào)節(jié)PH至7?7.5。
[0068]4)以純水定容至lOOOmL，攪拌混勻。
[0069]瓊脂糖包被的載玻片制作方法:
[0070]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，稱取0.5?1g瓊脂糖，50?60°C加熱攪拌，使其溶解。
[0071]2)取純水定容至lOOOmL，50?60°C加熱攪拌，使其充分溶解。
[0072]3)趁熱將2)中溶液至載玻片表面平鋪，烤干。
[0073]低熔點瓊脂糖的制作方法:
[0074]I)取30?10mL純水置100mL容量瓶中，稱取0.5?1g瓊脂糖，50?60°C加熱攪拌，使其溶解。
[0075]2)取純水定容至lOOOmL，50?60°C加熱攪拌，使其充分溶解。
[0076]3)趁熱將2)中溶液分裝至1.5mL樣品管中，每管0.12mL。
[0077]瑞氏染液及瑞氏緩沖液有市售。
[0078]二、采用本發(fā)明精子DNA碎片檢測試劑盒的檢測方法
[0079]I)將低熔點瓊脂糖加熱充分溶解后，以60 μ L/管分裝到1.5mL EP管內(nèi)，4°C保存；
[0080]2)以生理鹽水或PBS溶液將新鮮精液樣本稀釋為10?20 X 16個/mL ；
[0081]3)取60 μ L低熔點瓊脂糖溶化，在37°C孵育3分鐘；
[0082]4)步驟2)稀釋后樣本溶液30 μ L與步驟3)低熔點瓊脂糖60 μ L混勻，在37°C孵育2分鐘；
[0083]5)取20 μ L步驟4)混合液滴于包被載玻片，并迅速蓋上蓋玻片，于4°C條件下靜置5?7分鐘，使其凝固；