一種丙烯醛-dna加合物的測定方法
【專利摘要】一種丙烯醛?DNA加合物的測定方法，即DNA中α?Acr?dG和γ?Acr?dG的測定方法，包括采用丙烯醛溶液暴露小牛胸腺DNA，DNA溶液進(jìn)行酶水解并依次加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)和DNA水解酶。水解液經(jīng)Strata?X小柱固相萃取，收集洗脫液，引入LC?MS/MS系統(tǒng)分析，可準(zhǔn)確檢測出α?Acr?dG和γ?Acr?dG的含量水平。本發(fā)明為全新的DNA中丙烯醛?DNA加合物的測定方法，采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過程中引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性、與準(zhǔn)確性和靈敏度。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時(shí)間，減少了有機(jī)溶劑的消耗量。
【專利說明】
一種丙烯醛-DNA加合物的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明屬于DNA樣本的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及DNA中6-羥基-1，N2-丙醇-2'- 鳥嘌呤(a-Acr-dG)和8-羥基-1，N2-丙醇-2'-鳥嘌呤（y-Acr-dG)加合物的測定技術(shù)領(lǐng)域， 具體說是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC- MS/MS)測定DNA中丙烯醛-DNA 加合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙烯醛是一種廣泛存在于環(huán)境基質(zhì)中的污染物。它們主要產(chǎn)生于有機(jī)物的不完全 燃燒，如工業(yè)生產(chǎn)、卷煙煙氣、機(jī)動(dòng)車尾氣和烹飪油煙等。活潑的醛基不需要經(jīng)過機(jī)體代謝 就能夠直接攻擊生物體內(nèi)親核基團(tuán)，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成 DNA加合物。丙烯醛形成的主要DNA加合物包括6-羥基-1，N 2-丙醇-2'-鳥嘌呤(a-Acr-dG)和 8-羥基-1，N2-丙醇-2'-鳥嘌呤（丫-Acr-dG)。這兩種DNA加合物均可引起G- T突變。
[0003] 目前，關(guān)于DNA加合物的分析檢測方法報(bào)道的較多，主要有32P-后標(biāo)記技術(shù)、酶聯(lián)免 疫技術(shù)(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC-UV)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)。其中 LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應(yīng)用于DNA加合物的檢測分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 技術(shù)建立的丙烯醛-DNA加合物(a-Acr-dG和y -Acr-dG)的測定方法。該方法具有快速、準(zhǔn) 確、靈敏度高等特點(diǎn)，可用于DNA中丙稀醛-DNA加合物的定性定量分析。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種丙稀醛-DNA加合物的測定方法，即DNA中a-Acr-dG和y -Acr-dG的測定方法，具體 步驟如下： a、丙烯醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的丙烯醛溶液(丙烯醛 溶液用〇. 1 M的roS溶液配制，濃度0.001-1禮），對照組加入同等體積的PBS溶液。將上述溶 液放入37 °C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清 液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA樣品，得到的DNA團(tuán)塊晾干并加入200此超純水復(fù)溶，用 NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA-個(gè)吸收單位相 當(dāng)于50 yg/mL。
[0006] b、DNA的酶水解及固相萃取(SPE):將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖液(pH=7)中，加入20 yL混合內(nèi)標(biāo)，加入60U脫氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h， 隨后加入0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h。水解液經(jīng)1 mL甲醇活 化和1 mL純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最 后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液。此過程的目的是為了使雙鏈DNA 酶解成單核苷酸狀態(tài)，通過固相萃取和氮吹濃縮純化分離并富集所需的DNA加合物。所述混 合內(nèi)標(biāo)為 100 ng/mL的[15N5]a-AcrdG 和[15N5]y~AcrdG。
[0007] c、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的a-Acr-dG和y -Acr-dG標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液。
[0008] d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰 面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
[0009] 色譜條件：選取Extend_C18(1.8 wn，4.6X100 mm)色譜柱，流動(dòng)相體系選取A: 0.01%甲酸甲醇和B:10 mM乙酸銨水溶液，洗脫條件為梯度洗脫:0-2 min:25% A，2-7 min: 35% A，7-10 min:25% A;流速為0.38 mL/min。分析時(shí)間為10 min，進(jìn)樣量為5 yL。
[0010] 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V， 離子源溫度：600°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為36 psi，干燥氣為46 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時(shí)間：100 ms。監(jiān)測離子對為a-Acr-dG:324.3- 208 ? 2定量離子對，324 ? 3-190 ? 1定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5]a-Acr-dG為329.2-213.2;丫-Acr-dG: 324.3-208.1 定量離子對，324.3-190.2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5 ] y -Acr-dG為 329.2^213.1〇
[0011 ] 各分析物及內(nèi)標(biāo)的MRM參數(shù)見表1。分析過程由Applied Biosystems Analyst version 1.5.1軟件來控制。
[0012]表1多反應(yīng)監(jiān)測模式下分析物及其內(nèi)標(biāo)的MRM參數(shù)
*為定量離子 本發(fā)明方法的線性范圍和檢出限： 將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS/MS，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。 a-Acr-dG和 y -Acr-dG標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)為0.02,0.05,0.1，0.2,0.5，1.0，1.5,2.0,5.0和 10 ng/mL，內(nèi)標(biāo)[15N5]a-AcrdG和[15N5] y-AcrdG的濃度為2 ng/mL。目標(biāo)物的線性良好，相關(guān)系 數(shù)均大于0.9996。利用加標(biāo)稀釋得到方法的定量限和檢出限，目標(biāo)峰十倍信噪比對應(yīng)的濃 度為定量限，三倍信噪比對應(yīng)的濃度為檢出限。分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限和檢出限見表 2〇
[0013] 表2目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及L0D和L0Q
本發(fā)明方法加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 采取小牛胸腺DNA樣本中加標(biāo)的方法獲得方法的加標(biāo)回收率，總共選取了三個(gè)添加水 平，每個(gè)添加水平重復(fù)測定3次，得到的方法的回收率和重復(fù)性，結(jié)果見表3。目標(biāo)物的回收 率在97.3%-105.0%之間，RSD小于5%，證明方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性結(jié)果較好。
[0014] 表3分析物的加標(biāo)回收率和重復(fù)性
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，DNA中丙烯醛-DNA加合物的色譜 條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對LC-MS/MS的相關(guān)檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法 具有如下優(yōu)良效果： ①與傳統(tǒng)的液相色譜方法比較，由于選取了串聯(lián)質(zhì)譜，使得方法的選擇性和靈敏度提 高，更有利于DNA中低含量丙烯醛-DNA加合物的測定。
[0015] ②本方法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0016] ③本發(fā)明方法采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過程中 引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準(zhǔn)確性和靈敏度。通過色譜柱以及 洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時(shí)間，減少了有機(jī) 溶劑的消耗量。
【附圖說明】
[0017] 圖1 a-Acr-dG和y-Acr-dG及其內(nèi)標(biāo)在100虛丙烯醛溶液，37°C染毒24h的色譜 圖。
[0018] 圖2不同丙烯醛暴露劑量下，小牛胸腺DNA中a-Acr-dG和y-Acr-dG含量。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)例做進(jìn)一步描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0020] 一種DNA中丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其測試過程是用丙烯醛溶液對小牛胸 腺DNA進(jìn)行暴露，對DNA溶液進(jìn)行酶水解并加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)和DNA水解酶。水解液經(jīng) Strata-X小柱固相萃取，收集洗脫液，引入LC-MS/MS系統(tǒng)分析。
[0021] 實(shí)例 1: 1.儀器與試劑： AB SCIEX三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國加州應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），Agilent 1200高效 液相色譜(美國安捷倫公司），NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國賽默飛科技公司），恒 溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛科技公司），Milli-Q水純化系統(tǒng)(德國默克集團(tuán)），Analyst 1.5.1數(shù) 據(jù)采集與處理軟件。
[0022]脫氧核糖核酸酶I、堿性磷酸酶（美國紐英倫生物技術(shù)公司），磷酸二酯酶I、乙酸 銨、甲酸、和小牛胸腺DNA(美國西格瑪公司），甲醇(韓國德山試劑公司），Strata-X聚合物小 柱(33 wii，30 mg/lmL，廣東菲羅門科學(xué)儀器有限公司）。標(biāo)準(zhǔn)品a-Acr-dG、y-Acr_dG和內(nèi) 標(biāo)物[15N 5]a-Acr-dG、[15N5] y-Acr-dG。試劑均為色譜純。
[0023] 2 ?樣品處理： 丙烯醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入1 mL不同濃度的丙烯醛溶液 (0.001，0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 mM)，對照組加入同等體積的PBS溶液。將上述溶液放入 37 °C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清液，用 70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團(tuán)塊晾干并加入200 yL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA-個(gè)吸收單位相當(dāng)于50 y g/mL〇
[0024] DNA的酶水解及固相萃取（SPE):將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖液(pH=7)中，加入20 yL混合內(nèi)標(biāo)，加入60U脫氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h， 隨后加入0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h。水解液經(jīng)1 mL甲醇活 化和1 mL純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最 后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液。所述混合內(nèi)標(biāo)為100 ng/mL的 [15N5]a-AcrdG和[15N 5] y-AcrdG。
[0025] 3.測定方法： 吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和前處理之后的小牛胸腺DNA樣品各5 yL，注入LC-MS/MS系 統(tǒng)進(jìn)行分離分析，測得樣本中丙烯醛-DNA加合物的含量。
[0026]實(shí)例2:如實(shí)施例1所述，利用本研究建立的方法對不同濃度丙烯醛(0.001，0.01， 0.05，0.1，0.5和1.0 mM)暴露的小牛胸腺DNA中丙烯醛-DNA加合物進(jìn)行了檢測(每個(gè)樣本平 行檢測三次）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和峰面積得出各個(gè)樣品中DNA加合物的濃度，根據(jù)公式
計(jì)算獲得各個(gè)樣品中DNA加合物相對于核苷酸的含量，結(jié)果乘以108換算成DNA加合物 個(gè)數(shù)/1〇8個(gè)核苷酸。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示a-Acr-dG和y -Acr-dG的量與丙烯醛暴露劑量成效應(yīng)關(guān) 系(SPSS，P<0.005,圖 2)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丙烯醛-DNA加合物的測定方法，即DNA中6-羥基-I，N2-丙醇-2鳥嘌呤(α-Acr-dG)和8-羥基-1，N 2-丙醇-2'-鳥嘌呤（γ-Acr-dG)的測定方法，其特征在于:包括以下具體 步驟： a、 丙烯醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的丙烯醛溶液，對照組 加入同等體積的PBS溶液;將上述溶液放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇 沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA樣品，得到的DNA團(tuán)塊晾 干并加入200 yL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)在260nm處檢測DNA的含 量，對于雙鏈DNA-個(gè)吸收單位(OD)相當(dāng)于50 yg/mL; b、 DNA的酶水解及固相萃?。⊿PE):將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖液中，加入20 yL混合內(nèi)標(biāo)，加入60U脫氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h，隨后加 入0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h，水解液經(jīng)I mL甲醇活化和1 mL純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用I mL超純水和I mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液； c、 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的α-Acr-dG和γ -Acr-dG標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； d、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注 入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的 比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟a中的丙烯 醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟b中所述的 混合內(nèi)標(biāo)為 100 ng/mL的[15N5]a-AcrdG 和[15N5]y~AcrdG。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟d中選取了 Extend_C18色譜柱，規(guī)格1.8 ym，4.6X100 mm，流動(dòng)相體系選取0.01%甲酸甲醇A和10 mM乙 酸銨水溶液B，梯度洗脫，分析時(shí)間為10 min，進(jìn)樣量為5 yL。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于:梯度洗脫條件具 體為：0-2 min :25% A，2-7 min :35% A，7-10 min :25% A;流速為0.38 mL/min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟d中串聯(lián)質(zhì) 譜檢測器的條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式;噴霧電壓:5500 V，離 子源溫度：600°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為36 psi，干燥氣為46 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時(shí)間：100 ms;監(jiān)測離子對為a-Acr-dG:324.3- 208 · 2定量離子對，324 · 3-190 · 1定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5]a-Acr-dG為329.2-213.2;丫-Acr-dG: 324.3-208.1 定量離子對，324.3-190.2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5 ] γ -Acr-dG為 329.2^213.1〇
【文檔編號】G01N30/06GK105911168SQ201610227445
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】侯宏衛(wèi), 胡清源, 陳歡, 劉魯娟, 王紅娟, 朱貝貝, 陳建
【申請人】國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心