葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，具體涉及一種鑒別葡萄籽提取物中是否摻假松樹皮提取物或花生衣提取物的方法，包括如下步驟：1、建立葡萄籽提取物、松樹皮提取物和花生衣提取物的指紋圖譜；2、確定松樹皮提取物特征峰PB1和花生衣提取物特征峰PS1、PS2；3、將待測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，根據(jù)圖譜是否含有特征峰PB1或PS1、PS2，來鑒別葡萄籽提取物樣品中是否摻假松樹皮提取物或花生衣提取物，摻入3%以上摻假物即可準(zhǔn)確鑒別出來。該鑒別方法具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，方法高效，鑒別特征明顯，為鑒別葡萄籽提取物的植物來源提供了一定的理論依據(jù)，有利于促進(jìn)植物提取物行業(yè)的健康發(fā)展。
【專利說明】
葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于天然提取物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法。
【背景技術(shù)】
[0002]萄籽提取物(Grape Seed Extract, GSE)是從葡萄籽中提取分離得到的一類多酸類物質(zhì)。由于其具有極強(qiáng)的抗氧化性，能夠有效清除人體內(nèi)多余的自由基，起到延緩衰老和增強(qiáng)免疫力的作用，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品及化妝品等行業(yè)。
[0003]葡萄籽提取物中具有抗氧化作用的有效成分為原花青素。其在人體內(nèi)的抗氧化活性和清除自由基能力是維生素E(VE)的50倍，維生素C(VC)的20倍，且具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗腫瘤、抗輻射等作用。原花青素是由包括兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和沒食子酸等單體，以及這些單體通過C4-C6、C4-C8鍵結(jié)合而成的低聚體和高聚體等組成的混合物。通常將2?4聚體稱為低聚原花青素(οligomeric pmanthocyanidins，OPC)，將四聚體以上的稱為高聚原花青素(polymeric proanthocyanidins，PPC)，其中原花青素低聚體的抗氧化性最強(qiáng)。
[0004]多種植物提取物均含有原花青素，但不同提取物中原花青素含量差異較大，組成和結(jié)構(gòu)也各不相同，其抗氧化功效也各異。研究發(fā)現(xiàn)從葡萄籽中提取的原花青素純度更高、質(zhì)量更好、功效更強(qiáng)。目前對(duì)葡萄籽提取物的研究主要集中在原花青素的檢測(cè)，但對(duì)葡萄籽提取物中是否摻假其他提取物無法進(jìn)行檢測(cè)。由于不同來源植物提取物其功效不同，摻假行為對(duì)產(chǎn)品危害極大。因此開發(fā)一種簡(jiǎn)便、快速的葡萄籽提取物摻假檢測(cè)方法具有重大的意義。
[0005]松樹皮提取物和花生衣提取物與葡萄籽提取物的主要成分均為原花青素，且價(jià)格便宜，在利益驅(qū)使下，不法商人將松樹皮提取物、花生衣提取物摻入葡萄籽提取物中，冒充葡萄籽提取物進(jìn)行銷售，其行為嚴(yán)重?cái)_亂了葡萄籽提取物市場(chǎng)秩序。雖然松樹皮提取物和花生衣提取物的成分與葡萄籽提取物相似，但其功效與葡萄籽提取物有一定的差別，將其摻入葡萄籽提取物銷售會(huì)影響其功效，嚴(yán)重侵犯消費(fèi)者權(quán)益。由于松樹皮提取物和花生衣提取物與葡萄籽提取物主要成分相同，通過含量測(cè)定很難對(duì)其進(jìn)行摻假鑒別，因此，行業(yè)內(nèi)對(duì)葡萄籽提取物的真?zhèn)舞b別尚屬空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決本領(lǐng)域存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，用于鑒別葡萄籽提取物中是否摻假其他提取物。該方法能根據(jù)不同來源的植物提取物的譜圖不同，鑒別葡萄籽提取物的真?zhèn)巍?br>[0007]本發(fā)明分別對(duì)易摻假物松樹皮提取物、花生衣提取物和真品葡萄籽提取物進(jìn)行檢測(cè)，從而找出摻假物的特征峰，并通過對(duì)大量的不同來源的樣品進(jìn)行檢測(cè)加以驗(yàn)證。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
一種葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別鑒別方法，用于鑒別葡萄籽提取物中是否含有其他來源提取物，包括以下步驟:
第一步，分別建立葡萄籽提取物指紋圖、易摻假物松樹皮提取物指紋圖譜、易摻假物花生衣提取物指紋圖譜，方法如下:
(a)供試品溶液的制備:分別精密稱取葡萄籽提取物、松樹皮提取物、花生衣提取物適量，加入乙醇水溶液，超聲溶解，冷卻并定容，配制成5mg-20mg/mL的供試品溶液；
(b)色譜條件:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱為固定相，以乙腈和甲酸的水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫;流速1.2mL/min;檢測(cè)波長為270-310nm;色譜柱溫度為25-40°C ；
(c)測(cè)定:分別精密吸取葡萄籽提取物供試品溶液、松樹皮提取物供試品溶液、花生衣提取物供試品溶液，注入液相色譜儀，用液相色譜法測(cè)定，分別制定0_30min葡萄籽提取物指紋圖譜、松樹皮提取物指紋圖譜、花生衣提取物指紋圖譜；
第二步，將松樹皮提取物指紋圖譜與葡萄籽提取物指紋圖譜對(duì)比，在10-15min確定了松樹皮提取物特征峰PBl;將花生衣提取物指紋圖譜與葡萄籽提取物指紋圖譜對(duì)比，在10-15min確定了花生衣特征峰PSl、PS2;
第三步，采用液相色譜法檢測(cè)待測(cè)葡萄籽提取物，根據(jù)特征峰PBl或PS1、PS2的有無鑒別葡萄籽提取物中是否摻有松樹皮提取物或花生衣提取物。
[0009]本發(fā)明所述第一步(a)中乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為20-80%。
[0010]本發(fā)明所述第一步(b)中梯度洗脫條件為:0-15min: 10-18%乙腈；15-23min: 18-60% 乙臆；23—24min: 60_10% 乙臆；24—30min: 10% 乙臆。
[0011]本發(fā)明所述第一步(b)中硅膠柱規(guī)格為長度150mm，內(nèi)徑4.6mm，十八烷基硅烷鍵合娃膠粒徑5μηι。
[0012]本發(fā)明所述第一步(b)中甲酸的水溶液濃度為甲酸與水體積比為0.1:1OO0
[0013]本發(fā)明所述第二步中松樹皮提取物特征峰PBl保留時(shí)間為11.7±lmin。
[0014]本發(fā)明所述第二步中花生衣提取物特征峰PSl、PS2保留時(shí)間分別為11.5±lmin、
11.7± Imin0
[0015]本發(fā)明所述第三步中特征峰的有無為:在11.7土Imin出峰，說明待測(cè)葡萄籽提取物中摻有松樹皮提取物。
[0016]本發(fā)明所述第三步中特征峰的有無為:在11.5± lmin、11.7土 Imin同時(shí)出峰，說明待測(cè)葡萄籽提取物摻有花生衣提取物或同時(shí)摻有花生衣提取物和松樹皮提取物。
[0017]本發(fā)明可用于葡萄籽提取物中是否摻假其他提取物，涉及的摻假提取物包括松樹皮提取物、花生衣提取物。
[0018]采用本發(fā)明的方法對(duì)不同來源的葡萄籽提取物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果譜圖形狀一致，對(duì)不同來源的易摻假提取物進(jìn)行檢測(cè)，特征峰均較明顯，說明本發(fā)明方法特異性高。
[0019]本發(fā)明中高效液相色譜法測(cè)定方法參見美國藥典USP38 ((Grape SeedsOligomeric Proanthocyanidins》，具體儀器條件等參見具體檢測(cè)過程及實(shí)施例。
[0020]本發(fā)明適合不同來源的葡萄籽提取物及摻偽物的鑒別，操作簡(jiǎn)便，分析快速準(zhǔn)確，鑒別真?zhèn)畏椒ㄈ菀?、判斷指?biāo)清晰明確。
[0021]采用上述技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果為:通過上述方法可用于檢測(cè)葡萄籽提取物中是否摻假其他提取物，并且特異性好，靈敏度高，摻假3%以上的葡萄籽提取物就可以通過本方法加以檢測(cè)鑒別。
【附圖說明】
[0022]圖1為實(shí)施例1的HPLC指紋圖譜，其中色譜圖A為葡萄籽提取物，B為松樹皮提取物，C為花生衣提取物；
圖2為實(shí)施例2摻入3%松樹皮提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖3為實(shí)施例2摻入10%松樹皮提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖4為實(shí)施例2摻入15%松樹皮提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖5為實(shí)施例2摻入20%松樹皮提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖6為實(shí)施例2未摻假的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖7為實(shí)施例3摻入3%花生衣提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖8為實(shí)施例3摻入10%花生衣提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖9為實(shí)施例3摻入15%花生衣提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖10為實(shí)施例3摻入20%花生衣提取物的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖；
圖11為實(shí)施例3未摻假的葡萄籽提取物的HPLC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0024]實(shí)施例1
葡萄籽提取物與松樹皮提取物、花生衣提取物的HPLC指紋圖譜對(duì)比。
[0025]1、儀器與試藥
1.1儀器
Agilent 1260 型高效液相色譜儀，Zorbax SB-C18 色譜柱(5μηι，150X4.6mm)。
[0026]1.2 試藥
提取用乙醇為分析純;液相分析試劑乙腈為色譜純。葡萄籽提取物、松樹皮提取物、花生衣提取物由晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供。
[0027]2、方法與結(jié)果
液相色譜分離條件參見美國藥典USP 38《Grape Seeds OligomericProanthocyanidins》，色譜條件如下:
(1)固定相為Agilent十八燒基娃燒鍵合娃膠柱(150X 4.6mm,5ym)；
(2)流動(dòng)相為(A)乙腈，(B)水/甲酸(100/0.1，￥八)；流動(dòng)相梯度為0-151^11:10-18%八;I5-23min:18_60%A；23_24min:60-10%A；24_30min:10%A；
(3)流速為1.2mL/min；
(4)檢測(cè)波長:278nm;
(5)進(jìn)樣量:5yL。
[0028]3、指紋圖譜測(cè)定
3.1葡萄籽提取物指紋圖譜建立
(a)供試品溶液的制備:精密稱取葡萄籽提取物適量，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液，超聲溶解，冷卻并定容，配制成I Omg/ mL的供試品溶液；
(b)色譜條件:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；以乙腈和甲酸的水溶液進(jìn)行梯度洗脫;流速1.2mL/min;檢測(cè)波長為278nm;色譜柱溫度為40 V。
[0029](c)測(cè)定:精密吸取葡萄籽提取物供試品溶液，注入液相色譜儀，用液相色譜法測(cè)定，制定葡萄籽提取物指紋圖譜。
[0030]3.2松樹皮提取物指紋圖譜建立
同3.1 (a)-(c)，制定松樹皮提取物指紋圖譜。
[0031]3.3花生衣提取物指紋圖譜建立
同3.l(a)_(c)，制定花生衣提取物指紋圖譜。
[0032]4、特征峰的確定
4.1松樹皮提取物特征峰PBl的確定
通過對(duì)比葡萄籽提取物指紋圖譜和松樹皮提取物指紋圖譜，確定11.7min±lmin出現(xiàn)的色譜峰為松樹皮提取物特有，而葡萄籽提取物在此保留時(shí)間無色譜峰出現(xiàn)。
[0033]4.2花生衣提取物特征峰PSl、PS2的確定
通過對(duì)比葡萄籽提取物指紋圖譜和花生衣提取物指紋圖譜，確定11.5min±lmin、
11.7min± Imin出現(xiàn)的色譜峰為花生衣提取物特有，而葡萄籽提取物在此保留時(shí)間無色譜峰出現(xiàn)。
[0034]實(shí)施例2
摻假松樹皮提取物的葡萄籽提取物鑒別。
[0035]第一步，建立葡萄籽提取物指紋圖譜、松樹皮提取物指紋圖譜，方法同實(shí)施例1中3.1、3.20
[0036]第二步，在匍萄軒提取物中模擬慘假松樹皮提取物，并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。稱取自制4份葡萄籽提取物，分別為1.028、1.1(^、1.058、1.098;依次加入松樹皮提取物0.03 g、0.1g、
0.15 g、0.2 g，即摻假量分別為3%、10%、15%、20%。對(duì)摻假葡萄籽提取物進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，方法同實(shí)施例1中3.1。
[0037]結(jié)果見圖2-6 ο由HPLC色譜圖可得，摻入松樹皮提取物的色譜圖在11.7min 土 lmin左右有明顯色譜峰，而未添加松樹皮提取物的葡萄籽提取物在此無明顯色譜峰，特征峰隨松樹皮添加比例的增加而增大。
[0038]實(shí)施例3
摻假花生衣提取物的葡萄籽提取物鑒別。
[0039]第一步，建立葡萄籽提取物指紋圖譜、花生衣提取物指紋圖譜，方法同實(shí)施例1中3.1、3.30
[0040]第二步，在匍萄軒提取物中模擬慘假花生衣提取物，并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。稱取自制4份葡萄籽提取物，分別為1.018、1.0.58、1.088、1.098;依次加入花生衣提取物0.03 g、
0.lg、0.15 g、0.2 8，即摻假量分別為3%、10%、15%、20%。對(duì)摻假葡萄籽提取物進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，方法同實(shí)施例1中3.1。
[0041 ] 結(jié)果見圖7-11。由HPLC色譜圖可得，摻入花生衣提取物的色譜圖在11.5min土lmin、11.7min± lmin左右有明顯色譜峰，而未添加花生衣提取物的葡萄籽提取物在此無明顯色譜峰，特征峰隨花生衣提取物添加比例的增加而增大。
[0042]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別鑒別方法，用于鑒別葡萄籽提取物中是否含有其他來源提取物，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，分別建立葡萄籽提取物指紋圖、易摻假物松樹皮提取物指紋圖譜、易摻假物花生衣提取物指紋圖譜，方法如下: (a)供試品溶液的制備:分別精密稱取葡萄籽提取物、松樹皮提取物、花生衣提取物適量，加入乙醇水溶液，超聲溶解，冷卻并定容，配制成5mg-20mg/mL的供試品溶液； (b)色譜條件:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱為固定相，以乙腈和甲酸的水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫;流速1.2mL/min;檢測(cè)波長為270-310nm;色譜柱溫度為25-40°C ； (c)測(cè)定:分別精密吸取葡萄籽提取物供試品溶液、松樹皮提取物供試品溶液、花生衣提取物供試品溶液，注入液相色譜儀，用液相色譜法測(cè)定，分別制定0_30min葡萄籽提取物指紋圖譜、松樹皮提取物指紋圖譜、花生衣提取物指紋圖譜； 第二步，將松樹皮提取物指紋圖譜與葡萄籽提取物指紋圖譜對(duì)比，在10-15min確定了松樹皮提取物特征峰PBl;將花生衣提取物指紋圖譜與葡萄籽提取物指紋圖譜對(duì)比，在10-15min確定了花生衣特征峰PSl、PS2; 第三步，采用液相色譜法檢測(cè)待測(cè)葡萄籽提取物，根據(jù)特征峰PBl或PS1、PS2的有無鑒別葡萄籽提取物中是否摻有松樹皮提取物或花生衣提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第一步(a)中乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為20-80%。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第一步(b)中梯度洗脫條件為:0-15min:10-18%乙腈；15-23min:18-60%乙腈；23-24min:60-10%乙腈；24_30min: 10%乙臆。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第一步(b)中娃膠柱規(guī)格為長度150 mm，內(nèi)徑4.6mm，十八燒基娃燒鍵合娃膠層粒徑5μηι。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第一步(b)中甲酸的水溶液濃度為甲酸與水體積比為0.1:1OOo6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第二步中松樹皮提取物特征峰PBl保留時(shí)間為11.7 ± lmin。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第二步中花生衣提取物特征峰PSl、PS2保留時(shí)間分別為11.5± lmin、11.7± lmin。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第三步中特征峰的有無為:在11.7 ± Imin出峰，說明待測(cè)葡萄籽提取物中摻有松樹皮提取物。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葡萄籽提取物真?zhèn)舞b別方法，其特征在于，所述第三步中特征峰的有無為:在11.5 土 lmin、11.7 ± lmin同時(shí)出峰，說明待測(cè)葡萄籽提取物摻有花生衣提取物或同時(shí)摻有花生衣提取物和松樹皮提取物。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105842359SQ201610182593
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月28日
【發(fā)明人】高偉, 周麗, 楊清山, 王磊, 連運(yùn)河
【申請(qǐng)人】晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司