一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從植物中提取高純度ε-葡萄素的方法，尤其涉及一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法。本發(fā)明以廢棄的葡萄枝蔓為原料，經(jīng)提取、純化后，進(jìn)行柱層析，洗脫后得到含有ε-葡萄素粗品的洗脫液，在40-50℃對(duì)其進(jìn)行濃縮、干燥，得到ε-葡萄素粗品，再將ε-葡萄素粗品溶于甲醇后將其裝入羥丙基葡聚糖凝膠柱中，層析，得到含ε-葡萄素的洗脫液，然后經(jīng)稀釋、結(jié)晶、離心，得到純度≥98%的ε-葡萄素單體。本發(fā)明以廢棄的葡萄枝蔓為原料，成功提取出了高純度的ε-葡萄素，起到廢物利用，節(jié)約資源，保護(hù)環(huán)境的作用；本發(fā)明的副產(chǎn)品為白藜蘆醇，也是一種珍貴的醫(yī)藥、化學(xué)原料，這就進(jìn)一步的提高了葡萄枝蔓的利用價(jià)值。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從植物中提取高純度ε -葡萄素的方法，尤其涉及一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)的國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，葡萄枝蔓中含有豐富的葡萄素。葡萄素是葡萄與葡萄酒中重要功能成分白藜蘆醇聚合而成的一種天然多酚。ε-葡萄素和白藜蘆醇一樣具有抗癌、抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗菌、消炎等作用，并且其活性和穩(wěn)定性都高于白藜蘆醇。因而在植物抗病、人體生理活性領(lǐng)域備受關(guān)注。葡萄在栽培過(guò)程中每年需修剪若干次，保守估計(jì)每畝年產(chǎn)100-200kg修剪廢枝。長(zhǎng)期以來(lái)，大多廢枝被農(nóng)戶直接燃燒，嚴(yán)重污染環(huán)境。因此，從修剪廢枝中開(kāi)發(fā)天然產(chǎn)物，不但可以節(jié)約資源，而且能夠獲得安全的天然產(chǎn)物。
[0003]近幾年來(lái)，國(guó)外對(duì)ε -葡萄素的功能活性研究較多，已有相關(guān)的葡萄藤提取物產(chǎn)品上市，上市產(chǎn)品中芪化物含量30-50%，其中ε -葡萄素含量為10-20%。
[0004]國(guó)內(nèi)對(duì)ε-葡萄素的研究較少，能查到的專利僅有桂林萊茵生物科技股份有限公司的“一種通過(guò)發(fā)酵提高含有葡萄素植物中葡萄素含量的方法(申請(qǐng)?zhí)枮?00810097510.X)”和“一種芪族化合物及含有其的葡萄植物提取物及提取方法(申請(qǐng)?zhí)枮?00710302004.5)”。在申請(qǐng)?zhí)枮?00810097510.χ的專利主要研究的是如何通過(guò)發(fā)酵提高葡萄素含量；在申請(qǐng)?zhí)枮?00710302004.5的專利中主要研究的是通過(guò)提取、純化、精制得到主要產(chǎn)品為葡萄素和/或三聚體芪化物；但由于葡萄素和三聚體芪化物有多種結(jié)構(gòu)式，所以其產(chǎn)品應(yīng)該是多種葡萄素的復(fù)合物和多種三聚體芪化物的復(fù)合物。至于如何獲得高純度(純度>98%) ε -葡萄素，至今國(guó)內(nèi)外還未有相關(guān)制備和/或提取方法的相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，所得產(chǎn)品中ε -葡萄素的純度> 98%。
[0006]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，包括下述步驟:
[0007]步驟一分離白藜蘆醇、ε-葡萄素
[0008]將白藜蘆醇和ε -葡萄素的固體混合物溶于氯代甲烷后，進(jìn)行柱層析，層析時(shí)，采用由氯代甲烷與甲醇組成的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，得到含有ε-葡萄素粗品的洗脫液；
[0009]步驟二精制
[0010]將步驟一所得含有ε-葡萄素粗品的洗脫液在小于60°C濃縮、干燥得到ε-葡萄素粗品，將ε-葡萄素粗品溶于甲醇后采裝入羥丙基葡聚糖凝膠柱，進(jìn)行柱層析，層析時(shí)，采用甲醇為洗脫液進(jìn)行等度洗脫，得到含ε-葡萄素的洗脫液，靜置，結(jié)晶，離心，得到ε_(tái)葡萄素單體。
[0011]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，步驟一中，進(jìn)行柱層析時(shí)，所用層析柱為氧化鋁層析柱或硅膠層析柱，優(yōu)選為硅膠層析柱；所述硅膠層析柱中硅膠顆粒的大小為200-300目。
[0012]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度葡萄素的方法，步驟一中所述氯代甲烷為二氯甲烷或三氯甲烷。
[0013]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，步驟一中，層析裝柱時(shí)，采用濕法上樣，洗脫時(shí)，先用2-4BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比19:1組成的混合溶液進(jìn)行第一次洗脫并收集第一次洗脫的洗脫液，再用2-4BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比16:1組成的混合溶液進(jìn)行第二次洗脫并收集第二次洗脫的洗脫液，然后用2-4BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比13:1組成的混合溶液進(jìn)行第三次洗脫并收集第三次洗脫的洗脫液，最后用2-4BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比10:1組成的混合溶液進(jìn)行第四洗脫并收集第四次洗脫液；洗脫時(shí)，控制洗脫液的流速均0.5-1.5BV/h ;所述第一次洗脫的洗脫液和第二次洗脫的洗脫液為含白藜蘆醇的洗脫液；所述第三次洗脫的洗脫液和第四次洗脫的洗脫液為含ε -葡萄素的洗脫液。[0014]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，步驟一中洗脫層吸柱時(shí)，每次洗脫所用洗脫液優(yōu)選為3BV，每次洗脫時(shí)，洗脫液的流速優(yōu)選為lBV/h。
[0015]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，精制時(shí)一般采用下述方案:
[0016]將步驟一所得含有ε -葡萄素粗品的洗脫液在40-50°C濃縮、干燥得到ε -葡萄素粗品，將ε-葡萄素粗品溶于甲醇后采用濕法上樣的方式將其裝入羥丙基葡聚糖凝膠柱中，進(jìn)行柱層析，層析時(shí)，采用甲醇為洗脫液進(jìn)行等度洗脫，得到含ε -葡萄素的洗脫液，用等體積蒸餾水稀釋所述含ε -葡萄素的洗脫液后，置于室溫的通風(fēng)櫥中，揮發(fā)稀釋后的含ε -葡萄素的洗脫液中的甲醇至開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)，降溫至2-6°C、優(yōu)選為4°C，靜置20-28小時(shí)、優(yōu)選為24小時(shí)，離心，得到純度> 98%的ε -葡萄素單體；所述羥丙基葡聚糖凝膠柱的型號(hào)為L(zhǎng)H-20 ;層析時(shí)，采用甲醇為洗脫液進(jìn)行等度洗脫，洗脫液的流速為l_2BV/h。
[0017]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，所述含有白藜蘆醇和ε-葡萄素的固體混合物是通過(guò)下述步驟制備的:
[0018]步驟a提取
[0019]按液固比為4_6mL/g的比例，將含ε -葡萄素的植物破碎至-20目后加入提取劑中，在60°C以下提取0.5-lh后濃縮除去提取劑中的有機(jī)溶劑，得到提取液；所述提取劑由水和有機(jī)溶劑按體積比為水:有機(jī)溶劑=3-5:15-17組成，所述有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、乙酸乙酯中的一種；
[0020]步驟b純化
[0021]以3000_5000r/min的離心速度對(duì)步驟a所得提取液進(jìn)行離心處理，離心處理所得上清液用大孔樹(shù)脂進(jìn)行層析純化，層析時(shí)先用水洗脫，然后用乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，在50_60°C，濃縮、干燥乙醇洗脫液得到含有白藜蘆醇和ε -葡萄素的固體混合物；或
[0022]在60°C以下除去步驟a所得提取液中的有機(jī)溶劑后加入等體積的萃取劑，進(jìn)行萃取后在40_60°C濃縮、干燥有機(jī)相，得到含有白藜蘆醇和ε -葡萄素的固體混合物；萃取劑的選擇制度為:當(dāng)提取劑的有機(jī)溶劑為乙醇或甲醇時(shí)，所用萃取劑為乙酸乙酯；當(dāng)提取劑的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯時(shí)，所用萃取劑為氯仿或二氯甲烷。
[0023]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，所述含ε-葡萄素的植物為葡萄枝蔓；所述葡萄枝蔓經(jīng)自然陰干1-3月。
[0024]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，所述提取為超聲提取或回流提??；優(yōu)選為超聲提取；提取溫度優(yōu)選為室溫_30°C。
[0025]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，步驟b中所述大孔樹(shù)脂選自DlOl型大孔樹(shù)脂、AB-8型大孔樹(shù)脂、D102型大孔樹(shù)脂中的一種。本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε -葡萄素的方法，步驟b中，層析純化時(shí)，控制上樣速度為2-3BV/h ;上樣完成后，先用1-3BV的水進(jìn)行洗脫，然后用2-6BV的乙醇進(jìn)行洗脫并收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液在50_60°C減壓濃縮至浸膏狀后進(jìn)行真空干燥，得到含有白藜蘆醇和ε-葡萄素的固體混合物；所述乙醇的體積百分濃度為70-90%。
[0026]本發(fā)明一種從葡萄枝蔓中提取高純度葡萄素的方法，步驟四中，型號(hào)為L(zhǎng)H-20的羥丙基葡聚糖凝膠柱(Sephadex LH-20)能根據(jù)白藜蘆醇及其聚合物的分子量與結(jié)構(gòu)特征區(qū)別，有效將它們分離，從而獲得高純度ε -葡萄素。
[0027]技術(shù)效果
[0028]本發(fā)明以廢棄的葡萄枝蔓作為原料，進(jìn)行ε -葡萄素的提取，其與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下區(qū)別和優(yōu)點(diǎn):
[0029]1、由于ε -葡萄素的同分異構(gòu)體的極性相近，很難通過(guò)普通的方法分離得到高純度的ε -葡萄素；發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量嘗試后，開(kāi)創(chuàng)性的利用羥丙基葡聚糖凝膠柱(SephadexLH-20)來(lái)分離ε -葡萄素的同分異構(gòu)體，并取得了意想不到的效果，得到了純度> 98%的
葡萄素；
[0030]2、現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)白藜蘆醇和ε -葡萄素的分離研究較少，本發(fā)明充分利用白藜蘆醇和ε -葡萄素的極性差異，采用柱層析的方法很好的實(shí)現(xiàn)了白藜蘆醇和葡萄素的分離；通過(guò)回收不同洗脫階段的洗脫液，有效的實(shí)現(xiàn)了白藜蘆醇和ε-葡萄素的分離，為得到白藜蘆醇和高純度ε-葡萄素提供了必要條件；
[0031]3、由于ε-葡萄素對(duì)溫度較為敏感，溫度高于60°C時(shí)極易發(fā)生降解，所以本發(fā)明嚴(yán)格控制各步驟的溫度(< 60°C);尤其在提取過(guò)程中，優(yōu)選室溫超聲提取，這樣既取得了較好的提取效果，又縮短了提取時(shí)間，從而極大的提高了生產(chǎn)效率；
[0032]綜上所述，本發(fā)明以廢棄的葡萄枝蔓作為原料、在整個(gè)制備工藝過(guò)程中嚴(yán)格控制步驟的溫度<60°C，采用合理的提取、純化技術(shù)得到了含有白藜蘆醇和葡萄素的固體混合物，通過(guò)合理的分離技術(shù)的選用以及參數(shù)的控制實(shí)現(xiàn)了白藜蘆醇與ε-葡萄素的高效分離，在ε-葡萄素與其同分異構(gòu)體的分離過(guò)程中，通過(guò)選用羥丙基葡聚糖凝膠柱(Sephadex LH-20)作為層析柱，意外的得到了純度> 98%的ε -葡萄素；縱觀整個(gè)工藝，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，所得產(chǎn)物純度高，具有很高的工業(yè)、醫(yī)用價(jià)值，所得副產(chǎn)物為白藜蘆醇，其也具有很高的工業(yè)、醫(yī)用價(jià)值?？傊景l(fā)明以廢棄的葡萄枝蔓作為原料，通過(guò)合理的工藝實(shí)現(xiàn)了葡萄枝蔓的高效、高價(jià)值的回收；得到了純度>98%的ε -葡萄素。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]附圖1為實(shí)施例1所制備的純度為98.5%的ε -葡萄素的高效液相色譜圖譜(HPLC圖譜)；[0034]附圖2為實(shí)施例1所制備的ε -葡萄素的結(jié)構(gòu)鑒定圖。
[0035]從圖1中可以看出，在43min左右出現(xiàn)一個(gè)單峰，與ε -葡萄素標(biāo)樣對(duì)比，分離得ε -葡萄素純度大于98%。
[0036]從圖2中可以看出，實(shí)施例1所制備的淺黃色無(wú)定型粉末為ε -葡萄素。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面結(jié)合圖對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明:實(shí)施例上述實(shí)施方式僅供說(shuō)明本發(fā)明之用，而并非是對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇。
[0038]實(shí)施例1
[0039](1)預(yù)處理:將修剪的葡萄廢枝自然陰干2個(gè)月，再粉碎后過(guò)20目篩。
[0040](2)提取:將預(yù)處理后的原料，投入提取罐中，加入75%超聲提取2次，每次提取lh，兩次提取時(shí)溶劑與原料的固液比分別為6mL/g和4mL/g。合并兩次提取液，將提取液轉(zhuǎn)入濃縮器中，減壓濃縮至無(wú)醇味，溫度控制在60°C。
[0041](3)純化:將步驟(2)所得提取液3000r/min離心處理，得上清液，經(jīng)大孔樹(shù)脂DlOl層析純化，上樣速度為2BV/h。上樣完成后，先用水洗脫2BV，然后直接用80%乙醇洗脫4BV。將80%乙醇洗脫液轉(zhuǎn)入濃縮器中，減壓濃縮至浸膏狀，然后轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥(溫度控制在60°C)，干燥后粗提物中ε -葡萄素含量為11.5%。
[0042](4)分離白藜蘆醇、ε -葡萄素:用盡量少的二氯甲烷溶解步驟(3)所得粗提物后濕法上樣，然后經(jīng)常壓硅膠(200-300目)層析柱分離白藜蘆醇、ε-葡萄素，洗脫分別得到含有白藜蘆醇粗品的洗脫液和含ε -葡萄素粗品的洗脫液；層析洗脫時(shí)，先用2BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比19:1組成的混合溶液進(jìn)行第一次洗脫并收集第一次洗脫的洗脫液，再用4BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比16:1組成的混合溶液進(jìn)行第二次洗脫并收集第二次洗脫的洗脫液，然后用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比13:1組成的混合溶液進(jìn)行第三次洗脫并收集第三次洗脫的洗脫液，最后用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比10:1組成的混合溶液進(jìn)行第四洗脫并收集第四次洗脫液；洗脫時(shí)，控制洗脫液的流速均
0.5BV/h ;第一次洗脫的洗脫液和第二次洗脫的洗脫液為含白藜蘆醇的洗脫液；第三次洗脫的洗脫液和第四次洗脫的洗脫液為含ε-葡萄素的洗脫液。
[0043]將所得含葡萄素粗品的洗脫液在40°C濃縮干燥得到葡萄素粗品，葡萄素含量為79.8%。
[0044](5)成品制備:將步驟(4)所得ε -葡萄素粗品用盡量少的甲醇溶解濕法上樣，經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠柱(Sephadex LH-20)層析，純甲醇洗脫，洗脫液的流速為lBV/h，得到含ε -葡萄素的洗脫液，再向含ε -葡萄素的洗脫液中加入等體積的蒸餾水，置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相至開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)晶，然后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24小時(shí)，5000r/min離心處理，離心所得沉淀物經(jīng)重結(jié)晶，冷凍干燥后，得到淺黃色無(wú)定型粉末，采用高效液相色譜檢測(cè)得出產(chǎn)物中
ε -葡萄素含量為98.5%，其檢測(cè)圖見(jiàn)圖1。
[0045]采用電子轟擊離子源-質(zhì)譜聯(lián)用法(E1-MS)檢測(cè)所得產(chǎn)物，測(cè)得m/z(%):454 [M] +(100), 360, 347, 107 ? UV λ max nm: 232 (sh)，328 (MeOH)；[0046]采用氫核磁共振檢測(cè)所得產(chǎn)物，測(cè)得=1H NMR(400MHz，DMS0_d6，ppm) δ:6.70 (2Η, d，J=7.2Ηζ, Η-2, 6)，7.18 (2Η, d, J=7.2Ηζ, Η_3, 5)，6.62 (1Η, d, J=16.8Ηζ, Η_7)，6.87 (1Η, d, J=16.8Ηζ, Η-8)，6.29 (1Η, H-12)，6.60 (1Η, H-14)，6.52 (2Η, d, J=7.2Ηζ, Η_2，，6，)，6.93 (2Η, d,J=7.2Ηζ, Η-3，，5，)，5.78 (1Η, d, J=7.6Ηζ, Η_7，)，4.62 (1Η, d, J=7.6Ηζ, Η_8，)，5.64 (2Η, Η-10，，14’),5.78 (1Η, Η-12，)，8.77 (2Η, S，Cl I，-OH, C13--OH) ,9.17 (1Η, s, Cr-OH), 9.36 (1Η, s, C13-OH)，9.53 (1Η, S，C1-OH)；
[0047]結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)和碳?xì)浜舜殴舱駭?shù)據(jù)，鑒定出該化合物為ε -葡萄素，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0048]實(shí)施例2
[0049](I)預(yù)處理:將修剪的葡萄廢枝自然陰干3月，再粉碎后過(guò)40目篩。
[0050](2)提取:將預(yù)處理后的原料，投入提取罐中，加入80%乙醇超聲提取2次，每次提取0.5h，兩次提取時(shí)溶劑與原料的固液比分別為6mL/g和4mL/g。合并兩次提取液，將提取液轉(zhuǎn)入濃縮器中。減壓濃縮至無(wú)醇味，溫度控制在55°C。
[0051](3)純化:將步驟(2)所得提取液加入等體積乙酸乙酯萃取，將萃取后的有機(jī)相轉(zhuǎn)入濃縮器中，減壓濃縮至浸膏狀，然后轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥(溫度控制在50°C )，干燥后粗提物中ε-葡萄素含量為9.6%。
[0052](4)分離白藜蘆醇、ε -葡萄素:用盡量少的二氯甲烷溶解步驟(3)所得粗提物后濕法上樣，然后經(jīng)常壓硅膠(200-300目)層析柱分離白藜蘆醇、ε-葡萄素，洗脫分別得到含有白藜蘆醇粗品的洗脫液和含ε -葡萄素粗品的洗脫液；層析洗脫時(shí)，先用4BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比19:1組成的混合溶液進(jìn)行第一次洗脫并收集第一次洗脫的洗脫液，再用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比16:1組成的混合溶液進(jìn)行第二次洗脫并收集第二次洗脫的洗脫液，然后用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比13:1組成的混合溶液進(jìn)行第三次洗脫并收集第三次洗脫的洗脫液，最后用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比10:1組成的混合溶液進(jìn)行第四洗脫并收集第四次洗脫液；洗脫時(shí)，控制洗脫液的流速均lBV/h ;第一次洗脫的洗脫液和第二次洗脫的洗脫液為含白藜蘆醇的洗脫液；第三次洗脫的洗脫液和第四次洗脫的洗脫液為含ε-葡萄素的洗脫液。
[0053]將所得含ε-葡萄素粗品的洗脫液在40°C減壓濃縮干燥得到葡萄素粗品，ε -葡萄素含量為76.5%。
[0054](5)成品制備:將步驟(4)所得ε -葡萄素粗品用盡量少的甲醇溶解后濕法上樣，經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠柱(S^hadex LH-20)層析，純甲醇洗脫，洗脫液的流速為1.5BV/h，得到含ε-葡萄素的洗脫液，再向含ε-葡萄素的洗脫液中加入等體積的蒸餾水，置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相至開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)晶，然后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24小時(shí)，5000r/min離心處理，離心所得沉淀物經(jīng)重結(jié)晶，冷凍干燥后，產(chǎn)物中ε -葡萄素含量為98.1%。
[0055]實(shí)施例3
[0056](I)預(yù)處理:將修剪的葡萄廢枝自然陰干I月，再粉碎后過(guò)20目篩。
[0057](2)提取:將預(yù)處理后的原料，投入提取罐中，加入85%乙醇超聲提取2次，每次提取0.7h，兩次提取時(shí)溶劑與原料的固液比分別為6mL/g和4mL/g。合并兩次提取液，將提取液轉(zhuǎn)入濃縮器中，減壓濃縮至無(wú)醇味，溫度控制在50°C。
[0058](3)純化:將步驟(2)所得提取液5000r/min離心處理，得上清液，經(jīng)大孔樹(shù)脂DlOl層析純化，上樣速度為3BV/h。上樣完成后，先用水洗脫2BV，然后直接用80%乙醇洗脫4BV。將80%乙醇洗脫液轉(zhuǎn)入濃縮器中，減壓濃縮至浸膏狀，然后轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥(溫度控制在55 °C )，干燥后粗提物中ε -葡萄素含量為10.3%。。
[0059](4)分離白藜蘆醇、ε -葡萄素:用盡量少的三氯甲烷溶解步驟(3)所得粗提物后濕法上樣，然后經(jīng)常壓硅膠(200-300目)層析柱分離白藜蘆醇、ε-葡萄素，洗脫分別得到含有白藜蘆醇粗品的洗脫液和含ε -葡萄素粗品的洗脫液；層析洗脫時(shí)，先用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比19:1組成的混合溶液進(jìn)行第一次洗脫并收集第一次洗脫的洗脫液，再用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比16:1組成的混合溶液進(jìn)行第二次洗脫并收集第二次洗脫的洗脫液，然后用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比13:1組成的混合溶液進(jìn)行第三次洗脫并收集第三次洗脫的洗脫液，最后用3BV的、由氯代甲烷與甲醇按體積比10:1組成的混合溶液進(jìn)行第四洗脫并收集第四次洗脫液；洗脫時(shí)，控制洗脫液的流速均為
1.5BV/h ;第一次洗脫的洗脫液和第二次洗脫的洗脫液為含白藜蘆醇的洗脫液；第三次洗脫的洗脫液和第四次洗脫的洗脫液為含ε-葡萄素的洗脫液。
[0060]將所得含ε-葡萄素粗品的洗脫液在50°C減壓濃縮干燥得到ε-葡萄素粗品，ε -葡萄素含量為78.1%。
[0061](5)成品制備:將步驟(4)所得ε -葡萄素粗品用盡量少的甲醇溶解后濕法上樣，經(jīng)羥丙基葡聚糖凝膠柱(Sephadex LH-20)層析，純甲醇洗脫，洗脫液的流速為2BV/h，得到含ε-葡萄素的洗脫液，再向含ε_(tái)葡萄素的洗脫液中加入等體積的蒸餾水，置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相至開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)晶 ，然后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24小時(shí)，5000r/min離心處理，離心所得沉淀物經(jīng)重結(jié)晶，冷凍干燥后，產(chǎn)物中ε -葡萄素含量為98.3%。
【權(quán)利要求】
1.一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于包括下述步驟: 步驟一分離白藜蘆醇、ε-葡萄素 將白藜蘆醇和ε-葡萄素的固體混合物溶于氯代甲烷后，進(jìn)行柱層析，層析時(shí)，采用由氯代甲烷與甲醇組成的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，得到含有ε-葡萄素粗品的洗脫液； 步驟二精制 將步驟一所得含有ε -葡萄素粗品的洗脫液在溫度低于60°C下，進(jìn)行濃縮、干燥得到ε -葡萄素粗品，將ε -葡萄素粗品溶于甲醇后采用羥丙基葡聚糖凝膠柱，進(jìn)行柱層析，層析時(shí)，采用甲醇為洗脫液進(jìn)行等度洗脫，得到含ε-葡萄素的洗脫液，靜置，結(jié)晶，離心，得到ε-葡萄素單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于:步驟一中，進(jìn)行柱層析時(shí)，所用層析柱為氧化鋁層析柱或硅膠層析柱；所述硅膠層析柱中硅膠顆粒的大小為200-300目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于:步驟一中所述氯代甲烷為二氯甲烷或三氯甲烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于:步驟一中，層析裝柱時(shí)，采用濕法上樣；洗脫時(shí)，洗脫液由氯代甲烷與甲醇組成，采用梯度洗脫方式，依次按洗脫液中氯代甲烷與甲醇的體積比為19:1、16:1、13:1、10:1進(jìn)行洗脫；洗脫液中氯代甲烷與甲醇的體積比為19:1、16:1時(shí)，收集得到含白藜蘆醇的洗脫液；洗脫液中氯代甲烷與甲醇的體積比為13:1、10:1時(shí)，收集得到的為含ε-葡萄素的洗脫液；每次洗脫時(shí)，洗脫液的用量為2-4BV ;洗脫時(shí)，控制洗脫液的流速均0.5-1.5BV/h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于，所述步驟二中: 含有ε-葡萄素粗品的洗脫液濃縮、干燥溫度為40_50°C，得到的葡萄素粗品溶于甲醇后，采用濕法上樣的方式裝入羥丙基葡聚糖凝膠柱中，進(jìn)行柱層析，得到的含ε -葡萄素的洗脫液，用等體積蒸餾水稀釋后，室溫下?lián)]發(fā)洗脫液中的甲醇至開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)，降溫至2-6°C，靜置、完成結(jié)晶后，離心分離，得到純度> 98%的ε -葡萄素單體；所述羥丙基葡聚糖凝膠柱的型號(hào)為L(zhǎng)H-20 ;洗脫液用量為？ - ? BV，洗脫液的流速為l-2BV/h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于，所述含有白藜蘆醇和ε-葡萄素的固體混合物是通過(guò)下述步驟制備的: 步驟a提取 按液固比為4_6mL/g的比例，將含ε -葡萄素的植物破碎至-20目后加入提取劑中，在20-60°C提取0.5-lh后，得到提取液；所述提取劑由水和有機(jī)溶劑按體積比為水:有機(jī)溶劑=3-5:15-17組成，所述有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、乙酸乙酯中的一種； 步驟b純化 以3000-5000r/min的離心速度對(duì)步驟a所得提取液進(jìn)行離心分離，得到的上清液用大孔樹(shù)脂進(jìn)行層析純化，層析時(shí)先用水洗脫，然后用乙醇溶液洗脫；收集乙醇洗脫液，于50-60°C，濃縮、干燥得到含有白藜蘆醇和ε -葡萄素的固體混合物；或 將步驟a所得提取液，在60°C以下除去其中的有機(jī)溶劑后，向其中加入等體積的萃取劑進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，取有機(jī)相于40_60°C濃縮、干燥，得到含有白藜蘆醇和ε -葡萄素的固體混合物；萃取劑的選擇制度為:當(dāng)提取劑中有機(jī)溶劑為乙醇或甲醇時(shí)，所用萃取劑為乙酸乙酯；當(dāng)提取劑中有機(jī)溶劑為乙酸乙酯時(shí)，所用萃取劑為氯仿或二氯甲烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于:所述含ε -葡萄素的植物為葡萄枝蔓；所述葡萄枝蔓經(jīng)自然陰干1-3月。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于:所述提取為超聲提取或回流提取。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于:步驟b中所述大孔樹(shù)脂選自DlOl型大孔樹(shù)脂、AB-8型大孔樹(shù)脂、D102型大孔樹(shù)脂中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種從葡萄枝蔓中提取高純度ε-葡萄素的方法，其特征在于:步驟b中，層析純化時(shí)，控制上樣速度為2-3BV/h ;上樣完成后，先用1-3BV的水進(jìn)行洗脫，然后用2-6BV的乙醇進(jìn)行洗脫并收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液在50-60°C減壓濃縮至浸膏狀后進(jìn)行真空干燥，得到含有白藜蘆醇和ε -葡萄素的固體混合物；所述乙醇的體積百分濃度為70-90%。
【文檔編號(hào)】C07D307/80GK103788036SQ201410031931
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】熊興耀, 楊星星, 曾建國(guó), 謝紅旗 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)