一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測芯片、制備方法以及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測芯片，包括：納米金屬基底；兩種或兩種以上的信號分子，均勻分布于納米金屬基底上；以及兩種或兩種以上的用于檢測腫瘤標(biāo)志物的探針序列，分別固定于不同的信號分子上。本發(fā)明還提供了所述檢測芯片的制備方法以及包含其的檢測試劑盒。本發(fā)明的檢測芯片以及檢測試劑盒通過不同微區(qū)固定不同拉曼信號分子，結(jié)合納應(yīng)力傳感技術(shù)實(shí)現(xiàn)對多種腫瘤標(biāo)志物的一步、同時(shí)、靈敏、定量檢測，具有巨大的應(yīng)用潛力。
【專利說明】
-種基于表面増強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測巧片、制備方法從及 試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測忍 片、其制備方法W及包含所述檢測忍片的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤標(biāo)志物microRNAs(miRNAs)伴隨著腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移和治療過程，呈現(xiàn) 出不同的表達(dá)水平。miRNA的定量、高靈敏檢測可W用于診斷早期腫瘤，提高病人的生存率， 在腫瘤的診斷和治療方面具有非常重要的意義。目前對miRNAs的定量檢測方法包括 Nodhern blotting、QT-PCR、巧光法、微陣列法、S邸S法等。
[0003] 目前，S邸S(表面增強(qiáng)拉曼散射)法中的雙溫度雜交法檢測miRNA只能一次檢測一 種miRNA，且步驟較多。其過程如下：在SERS基底上連接上與目標(biāo)待測物部分互補(bǔ)的捕捉探 針，用于捕捉目標(biāo)待測物，再在待測物剩余片段上連接信號探針，W產(chǎn)生SERS信號。然而，在 SERS法檢測中，目標(biāo)待測物miRNA本身SERS信號極弱，直接檢測時(shí)，譜圖中干擾峰特別多，不 易獲得其結(jié)構(gòu)和濃度信息。因此現(xiàn)有的方法多數(shù)通過設(shè)計(jì)合理的生物忍片，將miRNA的濃度 和結(jié)構(gòu)信息，轉(zhuǎn)化為信號分子的強(qiáng)度或位移信息，但上述檢測方法多數(shù)只能用來檢測單個(gè) miRNA，兩種及W上標(biāo)志物同時(shí)檢測的研究未見報(bào)道。
[0004] 癌癥是一種復(fù)雜的疾病，同一種標(biāo)志物可能出現(xiàn)在不同腫瘤中，而一種腫瘤中也 會(huì)包含多種標(biāo)志物，僅對一種標(biāo)志物進(jìn)行檢測很難反映腫瘤的發(fā)展和治療狀態(tài)。因此，多種 標(biāo)志物的聯(lián)合檢測，能極大提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性，對癌癥早診具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服現(xiàn)有技術(shù)中無法多種腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一 種基于表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)的檢測忍片，可同時(shí)檢測多種標(biāo)記物，且準(zhǔn)確性、靈敏 度更優(yōu)。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供所述檢測忍片的制備方法W及包含所述檢測忍片的檢 測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供的基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測忍片，包括W下組成：
[000引納米金屬基底；
[0009] 兩種或兩種W上的信號分子，均勻分布于所述納米金屬基底上；W及
[0010] 兩種或兩種W上的用于檢測腫瘤標(biāo)志物的探針序列，分別固定于不同的所述信號 分子上。
[0011] 本發(fā)明的檢測忍片中，選用納米金屬基底具有更好的靈敏性，所述納米金屬基底 可選用檢測忍片領(lǐng)域常見的納米基底，也可按照現(xiàn)有方法即時(shí)制備，包括但不限于納米銀、 納米金或納米銅的基底;優(yōu)選為納米銀基底。
[0012] 本發(fā)明的檢測忍片中，所述信號分子的選擇需滿足：1)表面增強(qiáng)拉曼散射特征峰 可明顯互相區(qū)分；2)可印刷于納米金屬基底上并具備活性基團(tuán)與探針序列相連。所述信號 分子包括但不限于對琉基苯甲酸、5,5'-二硫代雙(班巧酷亞氨基-2-硝基苯甲酸）、對琉基 苯胺、對琉基苯棚酸、2-硝基-5-琉基苯甲酸或2-氨基-6-琉基嚷嶺。
[0013] 本發(fā)明的檢測忍片中，所述探針序列與所述信號分子之間包含有橋聯(lián)基團(tuán)，橋聯(lián) 基團(tuán)可W增加固定在基底上的探針序列的靈活性，從而不影響其與目標(biāo)miRNA的結(jié)合。所述 橋聯(lián)基團(tuán)可W為碳原子數(shù)20W下的直鏈飽和烷基;優(yōu)選碳原子數(shù)為3~6的直鏈飽和烷基。
[0014] 本發(fā)明的檢測忍片優(yōu)選包括W下組成：
[0015] 納米銀基底；
[0016] 兩種信號分子對琉基苯甲酸W及5,5'-二硫代雙(班巧酷亞氨基-2-硝基苯甲酸）， 均勻分布于所述納米銀基底上；W及
[0017] 兩種用于檢測腫瘤標(biāo)志物的探針序列，分別固定于所述兩種信號分子上。
[0018] 本發(fā)明提供的檢測忍片制備方法，包括W下步驟：
[0019] S1:制備納米金屬基底；
[0020] S2:使用微接觸印刷技術(shù)在所述納米金屬基底上分別印刷兩種或兩種W上的信號 分子使其均勻分布于所述納米金屬基底上；
[0021] S3:使兩種或兩種W上的用于檢測腫瘤標(biāo)志物的探針序列分別與不同的所述信號 分子結(jié)合。
[0022] 步驟S2中，微接觸印刷技術(shù)可使用現(xiàn)有的工藝技術(shù)或簡單變型，印刷不同信號分 子沒有順序限定，優(yōu)選地，可先印刷生長速度較慢的信號分子。
[0023] 進(jìn)一步地，所述步驟S3包括：
[0024] S31:修飾所述探針序列使其含有與所述信號分子結(jié)合的活性基團(tuán)；
[0025] S32:將步驟S31所得的探針序列通過所述活性基團(tuán)分別與不同的所述信號分子反 應(yīng)W使所述探針序列與所述信號分子結(jié)合。
[0026] 進(jìn)一步地，所述步驟S31還包括修飾所述探針序列使所述探針序列與所述活性基 團(tuán)之間含有橋聯(lián)基團(tuán)。
[0027] 步驟S32中，通?？上仁狗磻?yīng)活性較高的信號分子與探針結(jié)合，反應(yīng)完畢后將反應(yīng) 位點(diǎn)封閉，然后再進(jìn)行其他信號分子的反應(yīng)，必要時(shí)，也可采用保護(hù)基團(tuán)W保證未反應(yīng)的信 號分子不受影響，進(jìn)而保證不同信號分子與不同探針序列的特異性結(jié)合。
[0028] 步驟S32中，當(dāng)信號分子上的活性基團(tuán)反應(yīng)活性較小時(shí)，也可使用活化劑提高反應(yīng) 活性?；罨瘎┑姆N類可根據(jù)信號分子的活性基團(tuán)使用有機(jī)反應(yīng)領(lǐng)域的常見種類。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測腫瘤標(biāo)志物的試劑盒，其包含W上技術(shù)方案任一項(xiàng) 所述的基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測忍片。
[0030] 本發(fā)明的檢測忍片在納米金屬基底上，利用微接觸印刷技術(shù)，構(gòu)筑不同的功能微 區(qū)，印刷SERS特征峰區(qū)別明顯的不同信號分子，然后把對應(yīng)于不同標(biāo)志物的檢測探針序列 分別固定在對應(yīng)的信號分子上，再通過目標(biāo)待測物miRNA與探針序列之間的特異性相互作 用檢測目標(biāo)miRNA，目標(biāo)miRNA與探針特異性結(jié)合前后會(huì)對信號分子的某個(gè)(些)拉曼峰位移 產(chǎn)生影響，分析拉曼峰位移的大小即可得到miRNA的濃度信息。
[0031] 本發(fā)明的檢測忍片具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0032] (1)選用靈敏性更高的納米金屬基底W及不同種類的信號分子，通過信號分子的 特征峰的峰位置區(qū)別，可同時(shí)檢測多種腫瘤標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)了聯(lián)合檢測，提高了檢測效率。
[0033] (2)采用微接觸印刷技術(shù)，可使不同信號分子均勻印刷至納米金屬基底上形成不 同的功能微區(qū)，檢測探針與信號分子的化學(xué)鍵合，不會(huì)互相影響，因而可提高檢測的靈敏度 W及準(zhǔn)確性，而且，信號分子的均勻分布還能夠保證miRNA的濃度信息轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的、重現(xiàn) 性更好的SERS信號，從而使檢測過程具有良好的重現(xiàn)性。
[0034] (3)利用納應(yīng)力傳感，將miRNA的濃度信息轉(zhuǎn)化為信號分子的特征峰位移量，從而 可W通過其來檢測miRNA的絕對濃度，檢測準(zhǔn)確性更高。
[0035] (4)制備過程步驟少，避免了過多的干擾因素，從而進(jìn)一步保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確 性。
[0036] 本發(fā)明的檢測忍片W及檢測試劑盒通過不同微區(qū)固定不同拉曼信號分子，結(jié)合納 應(yīng)力傳感技術(shù)實(shí)現(xiàn)對多種標(biāo)志物的一步、同時(shí)、靈敏、定量檢測，具有巨大的應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例所述檢測忍片的制備過程示意圖（兩種信號分子）；
[003引圖2A為本發(fā)明實(shí)施例檢測過程中信號分子的SERS譜圖；圖2B為信號分子對琉基苯 甲酸(MBA)特征峰的放大圖；圖2C為信號分子5,5'-二硫代雙(班巧酷亞氨基-2-硝基苯甲 酸KDSNB)特征峰的放大圖；圖2D為C-S鍵的拉曼信號峰;其中：曲線a表示印刷信號分子MBA 后的SERS圖，曲線b表示在SERS基底空白處連接上第二種信號分子DSNB后的SERS圖，曲線C 表示連接上探針后的SERS圖，曲線d表示檢測miRNA后SERS圖；
[0039] 圖3A、3B分別為本發(fā)明實(shí)施例兩種miRNA的濃度與不同信號分子峰位移的關(guān)系 (error bar為5次試驗(yàn)所得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差）；
[0040] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例中2-氨基-6-琉基嚷嶺印刷在納米銀基底后的SERS譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041 ]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 實(shí)施例
[0044] 如圖1所示，W兩種標(biāo)志物的檢測為例，先用表面具有微陣列結(jié)構(gòu)的聚二甲基娃氧 燒(PDMS)印章在銀島基底上印刷信號分子MBA。再在其他區(qū)域生長上信號分子DSNB，形成多 種信號分子均勻、間隔分布的表面功能微區(qū)結(jié)構(gòu);控制反應(yīng)條件使探針1和探針2先后與信 號分子1和信號分子2特異性結(jié)合;最后，探針1和探針2分別與目標(biāo)待測物特異性雜交，對底 部的信號分子的結(jié)構(gòu)造成影響，從而產(chǎn)生峰位移。具體過程如下：
[0045] 1.銀島基底制備
[0046] 1 X 1cm2的娃片/玻璃片在乙醇和丙酬中分別超聲lOmin，吹干后置于piranha洗液 化2SO4/此化=3:1，v/v)中，加熱到95°C清洗40min。用超純水徹底清洗娃片/玻璃片后，吹 干，置于(3-琉丙基)立甲氧基硅烷的甲苯溶液中（2%)修飾化。分別用甲苯、丙酬和乙醇，將 娃片/玻璃片清洗干凈后待用。
[0047] 稱取440mg的硝酸銀，置于80mL的燒杯中，加入50mL水，攬拌均勻。邊快速攬拌邊向 硝酸銀溶液中緩慢加入13扣L NaOH( 10 % )生成灰綠色沉淀。向燒杯中逐滴加入2血10 %氨 水溶液，直至沉淀消失。將溶液置于冰水浴中冷卻。向冷卻后的溶液中加入3(Κ)化戊二醒溶 液(25%)，反應(yīng)10s后，置于90°C水浴中，并將修飾好的娃片/玻璃片貼壁放置在溶液中。反 應(yīng)4min，銀納米粒子在娃片/玻璃片上生長，形成銀島基底。立即取出銀島，置于預(yù)先冷卻的 乙二醇中，終止生長。超聲20s除去非特異性附著的銀納米粒子，待用。
[004引 2.印章制備
[0049] 7μπιΧ化m排列的Si微陣列模板，分別用乙醇和丙酬超聲清洗lOmin，吹干后置于 Piranha洗液中，加熱到95 °C清洗40min，用超純水清洗干凈，并吹干。將模板置于20化全氣 硅烷的蒸汽中，修飾15min，并固定在一次性比色皿開口處(微陣列面朝內(nèi)）。一次性比色皿 底部開口待用。將聚二甲基硅氧烷和固化劑按10:1的比例攬拌均勻，靜置待氣泡消失后，從 一次性比色皿底部緩慢注入。比色皿置于60°C烘箱，固化化即得到印章。
[0050] 3.表面微納結(jié)構(gòu)構(gòu)筑
[0051 ] 向印章表面上滴加20化MBA的乙醇溶液，靜置Imin并吹干。印章與銀島接觸Imin， 使印章上的MBA在銀島上生長。再將銀島置于5mM DSNB的乙臘溶液中，反應(yīng)4h使銀島未生長 MBA的空白區(qū)域生長上DSNB，得兩種信號分子微區(qū)均勻分布的修飾銀島。
[0化2] 4.探針修飾
[0053]將信號分子修飾的銀島置于ΙΟμΜ的胺基化修飾的探針1(序列為SEQ ID N0:1，分 子結(jié)構(gòu)見表1，BI0肥邸公司）溶液中（3 X SSC(巧樣酸鋼緩沖液），抑7.4，含0.04%十二烷基 硫酸鋼），室溫下反應(yīng)地，使探針1與DSNB結(jié)合而固定到基底上。將基底轉(zhuǎn)移到lOOiiM的下胺 (3 X SSC，抑7.4)溶液中，室溫下繼續(xù)反應(yīng)40min，封閉未反應(yīng)的DSNB位點(diǎn)。將銀島轉(zhuǎn)移到含 N服（lOmM)和邸C(50mM)的憐酸鹽緩沖液中（pH 6.8，lOmM)，反應(yīng)化，活化MBA末端的簇基。用 2 X SSC(pH 7.4，含0.1 %十二烷基硫酸鋼)清洗后，轉(zhuǎn)移到含ΙΟμΜ的胺基化修飾的探針2(序 列為SEQIDN0:2，分子結(jié)構(gòu)見表l，BI0肥ER公司）的溶液中（3XSSC，pH7.4，pH7.4，含 0.04%十二烷基硫酸鋼），使探針2與MBA結(jié)合固定到基底上。測定基底的SERS譜圖，得到檢 測前的信號分子位移。
[0 化 4] S.miRNA 檢測
[00對探針修飾的基底分別置于含10-6-10-"M，W及不含miRNA的5 X SSC溶液中（pH 7.4， 含0.01 %十二烷基硫酸鋼），置于42°C雜交16h，測定基底的SERS譜圖，得到檢測后信號分子 位移。
[0化6] 6.結(jié)果分析
[0057]基底上信號分子的譜圖變化見圖2A-2D。首先，利用微接觸印刷技術(shù)，印刷上信號 分子MBA，檢測SERS譜圖，發(fā)現(xiàn)在1068cm-哺1581cm-i處有MBA的特征峰；生長上第二種信號 分子DSNB后，在1334cnfi處檢測到DSNB的特征峰;信號分子連接上探針分子后，MBA和DSNB的 特征峰都發(fā)生了紅移;與兩種miRNA特異性結(jié)合后，MBA和DSNB的特征峰再次發(fā)生紅移，位移 量與miRNA的濃度相關(guān)。由此可同時(shí)對兩種miRNA進(jìn)行定量檢測。
[0化引圖3A、3B是miRNA濃度與信號分子峰位移的關(guān)系。miRNA 1(SEQ ID N0:3,序列見表 Ι,ΒΙΟ肥邸公司）的濃度由信號分子MBA特征峰的位移量反應(yīng)，檢測極限可達(dá)到l0-i6mol/L; miRNA 2(SEQ ID N0:4,序列見表Ι,ΒΙΟ肥邸公司）的濃度由信號分子DSNB特征峰的位移量 反應(yīng)，檢測極限可為l0-i6mol/L。
[0059]表1實(shí)施例中使用的miRNA及其相應(yīng)探針序列
[0060]
[0061] 7. Ξ種信號分子
[0062] 在前述基礎(chǔ)上，可增加為Ξ種信號分子，例如MBA、DSNBW及2-氨基-6-琉基嚷嶺 (結(jié)構(gòu)式如下所示）。
[0063]
[0064] 如圖4所示，2-氨基-6-琉基嚷嶺印刷在納米銀基底后的拉曼譜圖中，其特征峰在 1300cnf 1處，結(jié)合圖2A-2D可知:2-氨基-6-琉基嚷嶺的特征峰與MBA、DSNB的特征峰是可W明 顯區(qū)分開的，由此可制備同時(shí)檢測Ξ種腫瘤標(biāo)志物的檢測忍片。
[0065] 除非特別限定，本發(fā)明所用術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。
[0066] 本發(fā)明所描述的實(shí)施方式僅出于示例性目的，并非用W限制本發(fā)明的保護(hù)范圍， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出各種其他替換、改變和改進(jìn)，因而，本發(fā)明不限于 上述實(shí)施方式，而僅由權(quán)利要求限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測芯片，包括以下組成： 納米金屬基底； 兩種或兩種以上的信號分子，均勻分布于所述納米金屬基底上；以及 兩種或兩種以上的用于檢測腫瘤標(biāo)志物的探針序列，分別固定于不同的所述信號分子 上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，所述納米金屬基底選自納米銀、納米 金或納米銅的基底。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，所述信號分子選自對巰基苯甲酸、5， 5 二硫代雙(琥珀酰亞氨基-2-硝基苯甲酸）、對巰基苯胺、對巰基苯硼酸、2-硝基-5-巰基 苯甲酸或2-氨基-6-巰基嘌呤。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針序列與所述信號分 子之間包含有橋聯(lián)基團(tuán);所述橋聯(lián)基團(tuán)為碳原子數(shù)為3~6的直鏈飽和烷基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測芯片，其特征在于，所述檢測芯片，包括以下組 成： 納米銀基底； 兩種信號分子對巰基苯甲酸以及5,5'_二硫代雙(琥珀酰亞氨基-2-硝基苯甲酸），均勻 分布于所述納米銀基底上；以及 兩種用于檢測腫瘤標(biāo)志物的探針序列，分別固定于所述兩種信號分子上。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述檢測芯片的制備方法，包括以下步驟： S1:制備納米金屬基底； S2:使用微接觸印刷技術(shù)在所述納米金屬基底上分別印刷兩種或兩種以上的信號分子 使其均勻分布于所述納米金屬基底上； S3:使兩種或兩種以上的用于檢測腫瘤標(biāo)志物的探針序列分別與不同的所述信號分子 結(jié)合。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S3包括： S31:修飾所述探針序列使其含有與所述信號分子結(jié)合的活性基團(tuán)； S32:將步驟S31所得的探針序列通過所述活性基團(tuán)分別與不同的所述信號分子反應(yīng)以 使所述探針序列與所述信號分子結(jié)合。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S31還包括修飾所述探針序 列使所述探針序列與所述活性基團(tuán)之間含有橋聯(lián)基團(tuán)。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S32在活化劑存在下進(jìn)行反 應(yīng)。10. -種用于檢測腫瘤標(biāo)志物的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的基于表面增 強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的檢測芯片。
【文檔編號】G01N21/65GK105823768SQ201610262077
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】李敏, 朱文鳳, 趙宇亮
【申請人】中國科學(xué)院高能物理研究所