用于檢測(cè)o型fmdv抗體的固相阻斷elisa試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)FMDV抗體的試劑盒，特別涉及一種可用于檢測(cè)0型FMDV抗體 的固相阻斷ELISA試劑盒，屬于生物制品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的急性、高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄動(dòng)物，偶見于人和其 它動(dòng)物。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties，0IE)將其列為法定 申報(bào)的傳染病，我國將其列一類動(dòng)物疫病。FMDV在全世界有7個(gè)血清型，包括0、A、C、亞洲I (Asia 1)、南非I(SAT 1)、南非II(SAT 2)和南非III(SAT 3)，血清型之間無交叉免疫現(xiàn)象。 目前我國FMDV流行毒株主要為0型和A型，其中0型FMDV基因型眾多，流行廣泛，嚴(yán)重危害畜 牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。
[0003] 我國對(duì)FMD采取強(qiáng)制性免疫策略，疫苗免疫效果成為影響FMD防控的關(guān)鍵所在。疫 苗免疫效果的監(jiān)測(cè)主要有兩種方法，正向間接血凝試驗(yàn)（IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) <JHA簡單易行，但其結(jié)果判斷較為主觀，且受血凝抗原影響較大，在國際上已不再 使用。ELISA方法操作自動(dòng)化強(qiáng)，降低了主觀因素干擾，適用于大量臨床樣本的抗體監(jiān)測(cè)。常 用ELI SA方法包括VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELI SA和液相阻斷ELI SA。VP 1蛋白抗體間接ELI SA是 以FMDV的VP1蛋白作為包被抗原捕獲血清特異性抗體，然后通過酶標(biāo)二抗識(shí)別血清抗體，最 后經(jīng)底物顯色進(jìn)行信號(hào)放大。間接ELISA操作簡便，但該方法具有種屬特異性，在臨床上需 針對(duì)不同宿主制備試劑盒，應(yīng)用繁瑣。此外，間接ELISA受非特異性因素影響較大，而且只能 檢測(cè)一種血清抗體，如IgG。
[0004] 液相阻斷ELISA使用全病毒滅活抗原與血清抗體進(jìn)行體外中和試驗(yàn)，然后通過雙 抗體夾心法捕獲過?？乖?，最后經(jīng)酶標(biāo)二抗進(jìn)行底物顯色與信號(hào)放大。液相阻斷ELISA是 0ΙΕ推薦的檢測(cè)FMDV抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法，在世界范圍內(nèi)應(yīng)用廣泛。但是該方法也有缺點(diǎn)：（1)使 用全病毒滅活抗原，涉及病毒培養(yǎng)、滅活與濃縮純化，對(duì)生產(chǎn)條件、生產(chǎn)人員素質(zhì)和生產(chǎn)過 程要求比較嚴(yán)格，同時(shí)存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)；（2)全病毒抗原的制備較為復(fù)雜，涉及細(xì)胞培養(yǎng) 以及病毒繁殖，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量也受限制；（3)全病毒抗原生產(chǎn)需要使用P3實(shí)驗(yàn)室、超速離 心機(jī)等高端儀器設(shè)施，不利于推廣應(yīng)用。
[0005] 隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，基于FMDV中和表位的亞單位疫苗、多肽疫苗等新型 疫苗將憑借更高的純度與免疫精準(zhǔn)度逐步替代傳統(tǒng)滅活疫苗。與此同時(shí)，針對(duì)FMDV抗體建 立安全、敏感、特異的檢測(cè)方法對(duì)疫苗的免疫效果監(jiān)測(cè)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)0型FMDV抗體的間接固相阻斷ELISA試劑盒， 利用基因工程技術(shù)表達(dá)的病毒蛋白作為包被抗原，可針對(duì)0型FMDV特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，且 不區(qū)分樣品宿主來源。
[0007] 本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理是樣品中抗FMDV抗體與包被抗原結(jié)合導(dǎo)致兔抗血清與 抗原的結(jié)合量減少，形成"包被抗原-兔抗血清-酶標(biāo)抗體"復(fù)合物，最后加入底物進(jìn)行顯色 反應(yīng)，顯色深淺與樣品中抗體含量成反比。
[0008] 本發(fā)明的試劑盒中含有酶標(biāo)板、洗滌液、樣品稀釋液、兔抗血清、酶標(biāo)二抗、底物A 液、底物B液、終止液、陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清，其中所述酶標(biāo)板包被有0型FMDV基因工 程抗原。
[0009] 具體地，其中所述酶標(biāo)板包被0型FMDV基因工程抗原的過程為：用包被緩沖液將抗 原稀釋，以100uL/孔的量加入酶標(biāo)板，4°C包被12h，用洗滌液洗滌3次;加入封閉液，200uL/ 孔，4°C封閉12h;甩去封閉液，洗板3次，置于37°C干燥，用鋁箱真空密封。
[0010] 優(yōu)選情況下，所述包被緩沖液為PH9.6的碳酸鹽緩沖液。
[0011]優(yōu)選情況下，所述封閉液為含10%胰蛋白胨的PBS緩沖液。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述酶標(biāo)二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體。 [0013]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，其中所述兔抗血清是由0型FMDV基因工程抗原免 疫兔子制備。血清抗體經(jīng)辛酸-硫酸銨法和G蛋白柱法進(jìn)行初步純化，然后用0型FMDV基因工 程抗原和標(biāo)簽抗原進(jìn)行親和層析純化，去除了非特異性抗體，抗體純度高。與單克隆抗體相 比，所述血清抗體制備簡單、成本低，具有多個(gè)抗原表位結(jié)合位點(diǎn)，與包被抗原結(jié)合能力更 強(qiáng)。
[0014] 本發(fā)明的積極效果是：
[0015] 1、本發(fā)明試劑盒所使用的包被抗原為基因工程表達(dá)，不涉及病毒培養(yǎng)。相比傳統(tǒng) 液相阻斷ELISA試劑盒，其生產(chǎn)與使用過程中生物安全性好。
[0016] 2、本發(fā)明試劑盒使用固相阻斷法，與傳統(tǒng)間接ELISA試劑盒比，降低了抗原非特異 性抗體的干擾，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。
[0017] 3、本發(fā)明試劑盒避免了使用樣品宿主來源的酶標(biāo)二抗，與傳統(tǒng)間接ELI SA試劑盒 比，不受樣品的宿主來源限制，可用于多種動(dòng)物血清樣品檢測(cè)，使用方便。
[0018] 4、本發(fā)明試劑盒使用基因工程技術(shù)制備的蛋白和血清多抗進(jìn)行試劑盒生產(chǎn)，操作 簡單安全，成本低，有益于推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的用于檢測(cè)0型FMDV抗體的固相阻斷ELISA試劑盒，試劑盒內(nèi)設(shè)有洗滌 液、樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗、底物A液、底物B液、終止液、封板膜，還包括0型FMDV陰陽性對(duì)照 血清，包被了 〇型FMDV抗原蛋白的酶標(biāo)板，以及能夠與包被抗原特異性結(jié)合的兔抗血清。其 中兔抗血清與包被抗原具有很高的結(jié)合活性，是由0型FMDV抗原蛋白免疫兔子制備。
[0020] 下面具體介紹本發(fā)明試劑盒內(nèi)各試劑的來源(或制備過程）、試劑盒的測(cè)試原理及 測(cè)試過程。
[0021] 下述實(shí)施例中的主要原材料的來源為:HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和0型FMDV基因工程抗 原購自洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心。0型FMDV液相阻斷ELISA試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州 獸醫(yī)研究所。其它試劑和材料均是來源于商業(yè)途徑。所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無特別說明，均為 常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。
[0022] -、試劑盒內(nèi)各試劑的來源和制備過程
[0023] 1.1酶標(biāo)板的制備
[0024] (1)酶標(biāo)板的包被過程
[0025] 所述酶標(biāo)板是以基因工程技術(shù)表達(dá)的0型FMDV基因工程抗原蛋白作為包被抗原， 用PH9.6的碳酸鹽緩沖液將抗原進(jìn)行稀釋，以100uL/孔的量加入酶標(biāo)板，4°C包被12h，用洗 滌液洗滌3次。加入封閉液，200uL/孔，4 °C封閉12h。甩去封閉液，洗板3次，置于37 °C干燥，用 鋁箱真空密封。
[0026] (2)包被抗原最佳工作濃度的確定
[0027] 采用方陣滴定法確定抗原蛋白的最佳包被濃度。用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗 原蛋白，濃度分別為lug/mL、0 · 5ug/mL、0 · 25ug/mL、0 · 125ug/mL、0 · 0625ug/mL、0 · 03125ug/ mL，橫向加入酶標(biāo)板，4 °C包被12h。加10 %的胰蛋白胨，200uL/孔，37 °C封閉2h。陰陽性兔抗 血清同時(shí)做倍比稀釋1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，縱向加 入酶標(biāo)板，組成方陣進(jìn)行間接ELI SA。每孔加終止液50uL，測(cè)定0D450nm值。選擇陽性0D值接 近1.0，陽性0D值/陰性0D值(P/N值)最大時(shí)的抗原包被濃度和抗體稀釋度為最佳工作濃度。 確定的抗原最佳工作濃度為〇. 〇625ug/mL。
[0028] (3)封閉液和封閉時(shí)間的確定
[0029]用已確定的抗原最適工作濃度包被酶標(biāo)板，分別用含3%明膠的PBS、含10%脫脂 奶粉的ros、含10 %胰蛋白胨的ros作為封閉液。37 °C分別封閉30min、lh、2h和3h。加底物顯 色，讀取0D450nm值。選擇陽性0D值接近1.0，P/N值最大時(shí)的封閉液和封閉時(shí)間作為最適條 件。選擇含1 〇 %胰蛋白胨的PBS作為最佳封閉液，封閉時(shí)間為2h。
[0030] 1.2酶標(biāo)二抗的制備
[0031 ] Tris 2.42g，酶穩(wěn)定劑0· 8g，氯化鈉8 · 5g，紅染料2g，新生牛血清100ml，Proclin 300 0.5ml，曲拉通X-100 1.5ml，加蒸餾水850ml，小心加入鹽酸1.65ml，充分混勾，調(diào)節(jié)pH 值7.0，定容至1000ml，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體0.2ml，攪拌均勻，用0.22μπι的除菌濾 器過濾。無菌分裝。
[0032] 1.3兔抗血清的制備
[0033]選用健康的成年大耳白兔，在免疫前取血收集非免疫血清作為對(duì)照。將0型FMDV基 因工程抗原與完全弗氏佐劑混勻乳化，進(jìn)行兔背部皮下多點(diǎn)注射，每只兔子500yg。每隔2周 加強(qiáng)免疫1次，加強(qiáng)免疫時(shí)使用弗氏不完全佐劑，每只兔子250yg。三免后14天，采血進(jìn)行效 價(jià)檢測(cè)。效價(jià)達(dá)到1:1〇 4時(shí)，頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，分離血清。血清使用辛酸-硫酸銨法和G蛋 白柱法進(jìn)行初步純化，然后用0型FMDV基因工程抗原和標(biāo)簽抗原進(jìn)行親和層析，以去除非特 異性抗體。純化后血清置-20°C保存。
[0034] 1.4陰性對(duì)照血清的制備
[0035] 選用5周齡健康仔豬，經(jīng)0型FMDV液相阻斷E