檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷elisa抗體的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA抗體的試劑盒，其特征在于：包括ELISA板條、阻斷抗體、酶標(biāo)抗體、底物顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照，ELISA包被抗原；其中所述的ELISA包被抗原采用保藏號為CGMCCNO.4858犬瘟熱病毒；通過酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種檢測犬瘟熱病毒抗體的阻斷ELISA試劑盒，其是一種準(zhǔn)確、快速、安全性好、能夠進(jìn)行大量篩查犬瘟熱病毒抗體檢測的方法。
【專利說明】檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA抗體的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒(CDV)抗體檢測試劑盒，具體而言，本發(fā)明特別是涉及一種動物檢疫中檢測抗體的ELISA試劑盒及其用途，是一種檢測水貂、狐、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]犬痕熱病毒(Canine distemper virus, CDV)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae),副粘病毒亞科(Paramyxovirinae),麻疫病毒屬(Morbillivirus),由該病毒感染引起的犬痕熱(Canine distemper,⑶)是一種急性、高度接觸性傳染病,可引起大批犬、狐、貉和貂等易感動物發(fā)病，死亡率30-80%，雪貂高達(dá)100%。構(gòu)成CDV病毒粒子囊膜主要成分的血凝蛋白(H蛋白)，為機(jī)體抗感染免疫針對的主要靶蛋白，由其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體在抗CDV感染的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。目前，世界各國家檢測⑶V抗體多采用血清中和試驗(serum neutralization, SN),和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)。血清中和試驗需要時間長,一般需要3_4天,不適合大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查；而間接酶聯(lián)免疫吸附試驗，對動物種屬有著嚴(yán)格的要求，不適合多種屬獸群的檢測。阻斷ELISA檢測方法不僅能夠繼承ELISA方法快速，大容量檢測的優(yōu)點(diǎn)，而且沒有檢測動物種屬的限制，特別適應(yīng)檢測水貂、狐貍、貉等毛皮動物犬瘟熱病毒血清。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA抗體的試劑盒，是以原核表達(dá)的重組蛋白為阻斷抗體，通過酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種檢測犬瘟熱病毒抗體的阻斷ELISA試劑盒，其是一種準(zhǔn)確、快速、安全性好、能夠進(jìn)行大量篩查犬瘟熱病毒抗體檢測的方法。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA抗體的試劑盒，其特征在于:包括ELISA板條、阻斷抗體、酶標(biāo)抗體、底物顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照，ELISA包被抗原；其中所述的ELISA包被抗原采用保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2011年5月16日，保藏編號為CGMCC N0.4858，分類命名:犬瘟熱病毒；
所述的ELISA板條:每個試劑盒裝有I塊，每塊ELISA板條為能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2011年5月16日，保藏編號為CGMCC N0.4858，分類命名:犬瘟熱病毒；
所述的特異阻斷抗體:由重組犬瘟熱病毒囊膜抗原免疫新西蘭大白兔所得血清純化而來，20ml ；
所述的酶標(biāo)抗體:辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，20ml ；所述的顯示液，即用型TMB顯色液，20ml ；
所述的洗滌液為20倍濃縮，使用時稀釋成I倍工作濃度即可；
所述的陰性和陽性對照，為犬瘟熱抗體陽性血清和陰性血清；
所述的阻斷ELISA試劑盒在檢測水貂犬瘟熱病毒抗體中的應(yīng)用。
[0005]一種檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA抗體的試劑盒的制備方法，其特征在于具體步驟如下:將保藏號為CGMCC N0.4858犬瘟熱病毒以碳酸鹽緩沖液(pH9.6，0.05mol/L)稀釋后，IOOPL/孔，4°C包被過夜，PBST洗板機(jī)洗滌3次；用2% BSA封閉，200μ?7孔，37°C封閉2h，PBST洗板機(jī)洗滌3次；將待檢水貂血清用PBST稀釋后，50μ?7孔，37°C孵育30min ;將兔抗犬瘟熱H血清按工作濃度稀釋后，50μ?7孔，37°C孵育lh，PBST洗板機(jī)洗滌3次；羊抗兔酶標(biāo)抗體經(jīng)PBST稀釋后，ΙΟΟμ?/孔，37°C孵育lh，PBST洗板機(jī)洗滌3次；最后加TMB顯色液，IOOPL/孔，室溫作用10 min ；2M濃硫酸終止顯色，50ul/孔，測定D450nm值，計算抑制率。
[0006]本發(fā)明的積極效果是:建立一種準(zhǔn)確、快速、安全性好、能夠進(jìn)行大量篩查犬瘟熱病毒抗體檢測的方法，并且該試劑盒所用包被抗原為犬瘟熱病毒，能夠大量、穩(wěn)定生產(chǎn)，為動物檢驗檢疫部門提供了一套實(shí)用性強(qiáng)、效果可靠的診斷試劑盒產(chǎn)品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1犬痕熱病毒系統(tǒng)發(fā)育樹及⑶V-PS所屬亞型。
[0008]圖2犬瘟熱病毒重組囊膜蛋白SDS-PAGE圖。
【具體實(shí)施方式】
.[0009]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述:如圖1、2所示，本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
1、犬瘟熱病毒CDV-PS株(CGMCC N0.4858)介紹
病毒的分離如下:取發(fā)病動物的內(nèi)臟器官加入滅菌生理鹽水研磨成勻漿，反復(fù)凍融3次，8000轉(zhuǎn)/分鐘(rPm)離心10分鐘，棄去上層脂肪，吸取中間的液體，加入青霉素和鏈霉素4°C處理I小時后，再次8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清接種長滿單層的Vero細(xì)胞，
0.2ml/孔，置37度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每天觀察兩次，棄除24小時內(nèi)的污染細(xì)胞。
[0010]病毒的鑒定方法如下:
培養(yǎng)孔中顯示出明顯的犬瘟熱細(xì)胞病變?yōu)橐伤迫翢岵《痉蛛x株，將其進(jìn)行特異性RT-PCR檢測，在瓊脂糖凝膠電泳中顯示特異條帶，則確定為犬瘟熱病毒，并命名為CDV-PS株。
[0011]Q)V_PS株的分子特征:
提取CDV-PS株RNA，反轉(zhuǎn)錄成為CDNA并進(jìn)行其H基因的序列測定，測定結(jié)果顯示CDV-PS株與其他犬瘟熱病毒H基因核酸相似率達(dá)到98%以上，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹證實(shí)其位于我國主要的犬瘟熱病毒流行基因群Asis-1 (如圖1)，具有較好的抗原性。
[0012]2、競爭抗體制備過程
從犬瘟熱野毒株⑶V-PS株提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到388 bp的基因片段，將目的基因與原核表達(dá)載體pET28a(+)連接構(gòu)建了 pET28a-⑶V-H5重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中成功的表達(dá)，經(jīng)N1-NTA洗脫純化后，r⑶V-H5蛋白被成功純化(見圖2)。
[0013]將重組蛋白免疫新西蘭大白兔,2個月內(nèi)免疫3次后采血30_50ml，使用蛋白A/G純化總抗體后，最終獲得競爭抗體2mg。
[0014]3、阻斷ELISA的操作過程
將保藏號為CGMCC N0.4858犬瘟熱病毒以碳酸鹽緩沖液(pH9.6，0.05 mol/L)稀釋后，ΙΟΟμ?ν孔，4°C包被過夜，PBST洗板機(jī)洗滌3次；用2% BSA封閉，200μ?7孔，37°C封閉2h，PBST洗板機(jī)洗滌3次；將待檢水貂血清用PBST稀釋后，50μ?7孔，37°C孵育30min ;將兔抗犬瘟熱H血清按工作濃度稀釋后，50μ?7孔，37°C孵育lh，PBST洗板機(jī)洗滌3次；羊抗兔酶標(biāo)抗體經(jīng)PBST稀釋后，ΙΟΟμ?/孔，37°C孵育lh，PBST洗板機(jī)洗滌3次；最后加TMB顯色液，IOOPL/孔，室溫作用10 min ；2M濃硫酸終止顯色，50ul/孔，測定D450nm值，計算抑制率。每次均設(shè)⑶V陽性血清對照(未阻斷)。
[0015]4、判斷結(jié)果確定
抑制率(%)=(阻斷抗體D450 nm -樣本D450 nm) /阻斷抗體D450 nm *100%
用已經(jīng)優(yōu)化好的間接阻斷ELISA反應(yīng)條件，對水貂10份CDV未疫苗免疫血清樣本進(jìn)行檢測。根據(jù)公式計算臨界值，臨界值=陰性樣品平均抑制率+2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0016]對未免疫血清樣本的檢測結(jié)果顯示，水貂的平均抑制率為29%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4%。根據(jù)臨界值公式計算出水貂阻斷ELISA抗體的臨界值為37%。
[0017]實(shí)施例1
犬瘟熱病毒抗體的阻斷ELISA試劑盒最佳使用條件的確定
1、抗原包被濃度和阻斷抗體稀釋度的確定
犬瘟熱病毒以38.4mg/L包被，阻斷抗體做1:100、1:200、1:400、1:800稀釋，進(jìn)行間接ELISA，結(jié)果表明，確定的抗原工作濃度為9.6mg/L，阻斷抗體的稀釋度為1:400(見表I)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA抗體的試劑盒，其特征在于:包括ELISA板條、阻斷抗體、酶標(biāo)抗體、底物顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照，ELISA包被抗原；其中所述的ELISA包被抗原采用保藏號為CGMCCN0.4858犬瘟熱病毒； 所述的ELISA板條:每個試劑盒裝有I塊ELISA微孔板，每塊ELISA板條為能自行拆卸已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為由保藏號為CGMCC N0.4858犬瘟熱病毒⑶V-PS株; 所述的特異阻斷抗體:由重組犬瘟熱病毒囊膜抗原免疫新西蘭大白兔所得血清純化而來，20ml ； 所述的酶標(biāo)抗體:辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，20ml ； 所述的顯示液，即用型TMB顯色液，20ml ； 所述的洗滌液為20倍濃縮，使用時稀釋即可； 陰性和陽性對照，為犬瘟熱抗體陽性血清和陰性血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測水貂、狐貍、貉犬瘟熱病毒阻斷ELISA抗體的試劑盒的制備方法，其特征在于具體步驟如下:將保藏號為CGMCC N0.4858犬瘟熱病毒以碳酸鹽緩沖液(pH9.6,0.05 mol/L)稀釋后，100μ?7孔，4°C包被過夜，PBST洗板機(jī)洗滌3次；用2% BSA封閉，200μ?7孔，37°C封閉2h，PBST洗板機(jī)洗滌3次；將待檢水貂血清用PBST稀釋后，50μ?7孔，37°C孵育30min ;將兔抗犬瘟熱H血清按工作濃度稀釋后，50μ?7孔，37°C孵育Ih，PBST洗板機(jī)洗滌3次；羊抗兔酶標(biāo)抗體經(jīng)PBST稀釋后，ΙΟΟμ?/孔，37°C孵育Ih，PBST洗板機(jī)洗滌3次；最后加TMB顯色液，ΙΟΟμ?ν孔，室溫作用10 min ;2M濃硫酸終止顯色，50ul/孔，測定D450nm值，計算抑.制率。
【文檔編號】G01N33/569GK103439498SQ201310381302
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】易立, 程世鵬 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所