用于掃描檢測的方法和設(shè)備的制造方法
【專利說明】用于掃描檢測的方法和設(shè)備
[0001]相關(guān)申請的交叉參考
[0002]本申請要求2013年9月30日提交的且標(biāo)題為用于空時3D檢測的電導(dǎo)測定和光學(xué)方法的美國臨時專利申請第61/884，365號的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時專利申請的全部內(nèi)容出于所有目的而以引用的方式并入本文中。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦資助研究或發(fā)展的聲明
[0004]本發(fā)明是在國家航空航天局授予的授權(quán)編號NNX11A066G下借助政府支持而制造。政府對本發(fā)明具有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明大體上涉及一種用于檢測分析物的洗脫或?qū)崟r地分析沿著色譜柱移動的樣本的設(shè)備和方法。所述設(shè)備包括可移動地安裝在底座上以用于沿著色譜柱來回掃描以便提供關(guān)于所需分析物的洗脫的實時信息的檢測器。還提供一種使用本發(fā)明的設(shè)備來檢測所需分析物的方法。
【背景技術(shù)】
[0006]液相柱狀分離屬于用于當(dāng)今分析化學(xué)家的骨干技術(shù)。毛細(xì)管電泳(CE)和尤其高效液相色譜法(HPLC)是兩個主要實例。在任一實例中，通過流動通過管狀導(dǎo)管的栗送的洗脫劑(例如，HPLC)或通過施加跨越管的長度施加的電場(例如，CE)來在所述導(dǎo)管的一端處注入樣本并使其朝向所述導(dǎo)管的出口移動。檢測器定位成朝向?qū)Ч艿囊欢?CE、毛細(xì)管HPLC)或緊接在導(dǎo)管之后。樣本中的不同成分的分離是因為它們以不同速率移動通過柱且在不同時間到達(dá)檢測器而實現(xiàn)。
[0007]特別是在HPLC中，為了實現(xiàn)具有時間效率的分離和靈敏的檢測，使用稱作梯度洗脫的技術(shù)，尤其是在樣本含有弱保留(快速移動的)物種(的群組)和強(qiáng)保留物種(的群組)時。在這種情況下，在分離的初始階段期間使用弱洗脫劑(低推動力)，使得在不同的弱保留物種之間實現(xiàn)分離。接著增加洗脫劑強(qiáng)度以洗脫強(qiáng)保持物種并實現(xiàn)其之間的分離。如果全程使用弱洗脫劑，那么強(qiáng)保持分析物將花費(fèi)很長的時間來洗脫(如果其完全洗脫的話)且所得高峰將非常寬，從而使靈敏的檢測變得困難。如果全程使用強(qiáng)洗脫劑，那么弱保留物種將作為群組一起洗脫而不進(jìn)行區(qū)分。
[0008]存在許多模擬上述分離的程序，包含本發(fā)明者最近開發(fā)的程序。見以下參考文獻(xiàn)
(23)。此類模擬和實際生活實驗指示:即使在等梯度(S卩，不涉及梯度)的情況下，分析物的分離也經(jīng)常在分析物到達(dá)終端檢測器之前很久完成，不僅浪費(fèi)了時間，而且譜帶在其余時間內(nèi)加寬且檢測靈敏度減小。在梯度洗脫中，以下情況并不罕見:如果強(qiáng)洗脫劑濃度增加得太快，那么在駐留于柱上時分離的一對弱保留物種最終被推動至一個未區(qū)分的高峰。很少通過推理方式處理挑選特定臨時梯度程序，而是試圖對此進(jìn)行微調(diào)以作為不同組成物的若干連續(xù)嘗試的結(jié)果。
[0009]諷刺的是，當(dāng)MikhaiITswett首先發(fā)明色譜法時，他在用CaCO3填充的玻璃柱上分離出植物色素且他能夠真實地觀察他的分離。盡管無可否認(rèn)他在他的時代沒有任何方法來量化柱上的譜帶。原則上，如果你不僅能以定性的方式，而且以定量的方式以優(yōu)良的靈敏度看見分離，那么無需等待直到端柱檢測器看見洗脫的譜帶。事實上，如果我們可以近實時地看見分離，那么其可同時更改洗脫條件以實現(xiàn)最佳分離和最靈敏的可能量化。
[0010]在分離過程期間的所有時間存在于柱中的不同位置的內(nèi)容的定量檢測/成像的概念并不是新的。就本發(fā)明者所知，術(shù)語“全柱檢測”(WCD)首先由Birks和他在理論模擬方面的學(xué)生創(chuàng)造。見以下參考文獻(xiàn)(I)。在具有終端分離后檢測布置的傳統(tǒng)色譜法中，獨(dú)立于任何特定檢測器的分析物的唯一識別標(biāo)記是終端保持時間，經(jīng)常依據(jù)其“保持因子”予以描述。應(yīng)注意，光譜特性和有時用于識別的此類其它特性并不是色譜法固有的，信息是檢測器特定的。
[0011]明顯地，為了執(zhí)行全柱檢測，檢測器必須能夠“看穿”柱的圍墻。早在1968年，Brumbaugh和Ackers描述“掃描凝膠色譜法”，其中使柱移動經(jīng)過固定光源-檢測器配置且能夠監(jiān)測在凝膠柱的整個長度上的分子篩分離的吸收度分布。見以下參考文獻(xiàn)(2)。以前，移動HPLC柱(如今的栗和注入器一體地附接至HPLC柱)并不非常實用。在其第一實驗論文中，Birk和他的學(xué)生使用金屬包覆的玻璃柱、一側(cè)上的在365nm下發(fā)射的長熒光燈和金屬包覆物中的14對彼此相對的孔:光在一側(cè)上進(jìn)入且用另一側(cè)上的14個個別光電二極管予以檢測。見以下參考文獻(xiàn)(3)。
[0012]盡管許多理論預(yù)測和保持因子在梯度條件下如何改變的闡明可用沿著柱的14個點的最大分辨率加以驗證和示范，但性能和結(jié)果的準(zhǔn)確度低于預(yù)期。
[0013]Pawliszyn在檢測毛細(xì)管中的折射率改變時使用他的大量的先前經(jīng)驗以在毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)分析系統(tǒng)中的15mm的有效長度上設(shè)計折射率梯度檢測系統(tǒng)。見以下參考文獻(xiàn)(4)。使用固定聚焦He-Ne激光源。光束由毛細(xì)管之后的透鏡擴(kuò)展，使得毛細(xì)管上的距離在檢測器平面中放大10倍，其中掃描距離是150_而解析度是0.1mm(適應(yīng)注射栗驅(qū)動)，從而在15mm的整個分離距離上提供1500點分辨率。因為不可能按快速電泳分離所需的足夠速度來移動單個檢測器光電二極管，所以其借助128元件光電二極管陣列對分離毛細(xì)管的較小的(3mm)長度成像。較寬的光電二極管陣列本將允許對分離毛細(xì)管的較長部分成像，且可免除移動的光電二極管。這恰好在1994年借助氬離子激光源和1024元件C⑶檢測器-對25mm的毛細(xì)管(分辨率明顯是1024個點)成像的25mm寬的檢測器進(jìn)行。見以下參考文獻(xiàn)(5);也見美國專利第5，395，502號。
[0014]與上文相同的概念由Beale和Sudmeier在1995年改編以用于具有激光誘導(dǎo)熒光性(LIF)檢測的CE或CIEF。見以下參考文獻(xiàn)(6)。他們在電動平移臺上放置整個分離毛細(xì)管(最大速度50mm/s)，高達(dá)19cm的長度可在顯微鏡物鏡的視場下C3LIF系統(tǒng)在共焦模式中操作。其用去除了聚酰亞胺涂層的常規(guī)毛細(xì)管(具有發(fā)煙硫酸或丁烷火炬)獲得比具有UV透明涂層的硅石毛細(xì)管更好的結(jié)果。他們注意到，在內(nèi)孔<75μπι的情況下，其變得非常難以在毛細(xì)管內(nèi)維持激光聚焦，這極大地減小信噪比(S/N)。
[0015]也應(yīng)注意，很少物質(zhì)具有自體熒光性。依賴于LIF的任何分析系統(tǒng)必須經(jīng)歷先前衍生作用。沒有合適的衍生化學(xué)可存在;至少，這表示額外棘手步驟。熒光性在重復(fù)掃描下的光致褪色也是一個問題，尤其是對于強(qiáng)光源。
[0016]在1996年，Preisler和Yeung用Ar激光和平凸鏡照明232mm的毛細(xì)管。見以下參考文獻(xiàn)(7)。通過配備有適當(dāng)?shù)陌l(fā)射濾光器的垂直安裝的578元件CCD陣列監(jiān)測整個照明的區(qū)域。
[0017]其僅監(jiān)測熒光帶/正面的移動以確定流動速度，但原則上，這將允許在已概述警告的情況下監(jiān)測可被制造以借助特定激光源發(fā)熒光的分析物的分離。在此之前，在1994年，布置由Wu和Pawliszyn示范，其中輸入光由光纖陣列耦合至毛細(xì)管，但靈敏度較差，這是因為光耦合并不高效。見以下參考文獻(xiàn)(4)。
[0018]在1998年，基于PawiIszyn的作品，加拿大的Convergent B1sciences使成像CIEF檢測系統(tǒng)商業(yè)化，所述系統(tǒng)使用光纖陣列來使280nm的UV光從氙氣燈進(jìn)入具有寬為50μπι且長為5cm的孔隙的毛細(xì)管盒中。
[0019]透射光由CCD陣列讀取。此儀器(iCE280)仍如此且作為較精心設(shè)計的iCE3系統(tǒng)的部分銷售。
[0020]在2001年，在其評審CE和CIEF中的成像檢測時，Wu等人概述了那個時代的領(lǐng)域的狀態(tài)。見以下參考文獻(xiàn)(8)。論文中示出照明和檢測的受喜愛的一般布置，無論是通過透射率還是熒光性;iCE280布置不在此類別中。
[0021]相信iCE280是迄今為止供應(yīng)全柱或成像檢測的唯一商業(yè)儀器，且其理想地僅適合于總分離距離較小(例如，對于iCE280是5cm)時。這可適用于CIEF中，但存在很少可接受此的其它技術(shù)。
[0022]完全不同的方法是可能的，其中液芯波導(dǎo)(LCW)用于吸收度和熒光性檢測。LCW是管子或?qū)Ч埽渲斜谟山栽谒P(guān)注波長區(qū)中光學(xué)上透明的材料組成。
[0023]光可以相對小的損耗進(jìn)行通過長的LCW毛細(xì)管。如果此類毛細(xì)管被軸向地照明并監(jiān)測穿過毛細(xì)管的整個長度的光，那么只要注入樣本，光透射就會因為樣本中存在的光吸收組分而下降。信號將保持不變，直到最早的洗脫組分離開檢測路徑-透射光將升高那個量。如果將此數(shù)據(jù)描繪為吸收度對時間，那么輸出將類似于向下的臺階情況，其中從每一階到另一階的過渡描繪分析物的洗脫。較常規(guī)的色譜圖或電泳圖可通過按時間區(qū)分信號來獲得。
[0024]盡管此概念是用常規(guī)毛細(xì)管(其損失更多光，見以下參考文獻(xiàn)9)予以示范，但過程借助LCW毛細(xì)管(見以下參考文獻(xiàn)10)變得更實用。然而，此系統(tǒng)具有眾多困難。盡管大的吸收高峰可完全分離，但其在信號中一起出現(xiàn)。如果小的首先洗脫，那么其量化準(zhǔn)確度受將一個大數(shù)從另一大數(shù)減去的需要的限制。區(qū)分放大噪聲。許多時間檢測是用光路徑中的許多吸收組分完成的，這減少光通過量并增加檢測器噪聲。
[0025]借助液芯波導(dǎo)管進(jìn)行的熒光性檢測具有更多可能性。如果激發(fā)光徑向地入射在毛細(xì)管上，那么未吸收的入射輻射主要通過壁傳出。相比之下，發(fā)射的熒光的很大部分沿著管子向下進(jìn)行，其中其可由耦合至光電檢測器的光纖或直接由光電檢測器拾取。見以下參考文獻(xiàn)(11)和(12)。
[0026]替代于試圖沿著其長度均勻地照明管子，可沿著分離毛細(xì)管掃描(通過空間或由光纖耦合)激光束