抗人Cl-INH 抗體10 y g，于37°C混勻賠育5小時；用等體積的0.0 lM PBS 2% BSA pH7. 4緩沖液于37°C 賠育4小時；最后，用2% BSAO. OlMTtis-HCl P冊.0緩沖液清洗立次。并用該溶液配制成 磁珠微粒濃度01. Omg/ml，即得所述的包被抗人Cl-INH抗體磁珠微粒試劑；
[0049] (二）生物素標(biāo)記Cl-INH校準(zhǔn)品的制備
[0050] 如實施例1。
[0051] ( H )鏈霉親和素偶聯(lián)辣根過氧化酶試劑的制備
[0052] 如實施例1。
[0053] 實施例3分析性能評價
[0054] ( -）最低檢測極限
[00巧]用含5%新生牛血清的PBS溶液作為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測 量結(jié)果的RLU值（相對發(fā)光值），計算其平均值（M)和標(biāo)準(zhǔn)差（SD)，得出M+2SD。根據(jù)O濃 度和相鄰濃度校準(zhǔn)品之間的濃度一RLU值結(jié)果進(jìn)行兩點回歸擬合得出線性方程，求出對應(yīng) 的濃度值，即為最低檢測限。
[0056] 表1 ;0濃度的檢測RLU值（化學(xué)發(fā)光板為載體的檢測試劑盒）
[0058] 零濃度化學(xué)發(fā)光值均值X = 1823. 55
[0059] SD = 79. 11
[0060] X巧SD = 1981. 77 (y = 3164. 4X+1823. 55)
[0061] B 點發(fā)光值=2456. 43
[0062] 將零濃度點和鄰近濃度點連點擬合曲線，參見圖1。
[006引將O濃度點的X巧SD帶入兩點擬合曲線，最低檢測限=0.0 抓/ml。
[0064] 表2 ;0濃度的檢測RLU值（磁珠微粒為載體的檢測試劑盒）
[0065]
[0066] 零濃度化學(xué)發(fā)光值均值X = 1619. 3
[0067] SD = 63. 77
[0068] X巧SD = 1746. 84 (y = 4251. 33X+1619. 3)
[0069] B 點發(fā)光值=2469. 57
[0070] 將零濃度點和鄰近濃度點連點擬合曲線，參見圖2。
[0071] 將0濃度點的X+2SD帶入兩點擬合曲線，最低檢測限=0. 0抓/ml。
[007引（二）線性
[0073] 將接近線性范圍上限的高值樣本按一定比例稀釋為至少5種濃度，其中最低濃度 樣本須接近線性范圍的下限。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，將每一濃度樣本檢測1次，使用最 小二乘法（將每一濃度值和稀釋比例）或雙對數(shù)法（將每一濃度化學(xué)發(fā)光值和稀釋比例取 對數(shù)）進(jìn)行直線擬合，計算線性相關(guān)系數(shù)r。
[0074] 表3 ;線性相關(guān)系數(shù)r
[0077] 參見圖3和圖4,可知W化學(xué)發(fā)光板為載體和W磁珠微粒為載體的試劑盒，線性范 圍均能達(dá)到臨床檢測的要求。
[0078] (四）精密度評價
[007引 （1)批內(nèi)精密度
[0080] 將實施例1和2制備的試劑盒一批，分別測定低、中、高H種不同濃度的血清，平行 檢測10次，得出的分析內(nèi)變異系數(shù)為4. 15%~8. 83%。結(jié)果參見表4和5。
[0081] 表4:化學(xué)發(fā)光板為包被載體
[0082]

[0083] 表5:磁珠微粒為包被載體
[0084]
[00財 似批間精密度
[0086] 將實施例1和2制備的試劑盒取H批，每批試劑盒均測定低、中、高H種不同濃 度的血清，平行檢測10次，每份血清得到30個濃度值，統(tǒng)計分析變硬系數(shù)為5. 72 %~ 8. 45%。結(jié)果參見表6和7。
[0087] 表6:化學(xué)發(fā)光板為包被載體
[0088]
[0089]
[0090] 表7:磁珠微粒為包被載體
[0091]
[0092] (五）穩(wěn)定性評價
[0093] 對實施例1和2的試劑盒分別在4°C和37°C放置，置于4°C試劑盒分別于1月、3 月、6月、9月、12月和15月取樣檢測，置于37C的試劑盒，分別于3天、6天和9天取樣檢 巧1|，結(jié)果表明試劑盒的最低檢測限、線性、批內(nèi)精密度、批間精密度等均在正常范圍之內(nèi)，試 劑盒有效期可達(dá)12個月。
[0094] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對之作一些修改或改進(jìn)，送對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的送些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種遺傳性血管水腫的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：包被抗人 C1-INH抗體的載體、生物素標(biāo)記的C1-INH校準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑、 化學(xué)發(fā)光底物液A和B以及洗滌液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述載體為化學(xué)發(fā)光板或磁珠微粒。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述抗人C1-INH抗體選自鼠抗 人C1-INH單克隆抗體、兔抗人C1-INH多克隆抗體、羊抗人C1-INH的多克隆抗體、雞抗人 C1-INH多克隆抗體中的一種或多種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述抗人C1-INH抗體選自鼠抗人 C1-INH單克隆抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述鼠抗人C1-INH單克隆抗體的純度 不小于95%，濃度不小于lmg/mL。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述抗人C1-INH抗體濃度為5 μ g/mL。7. 權(quán)利要求1-6任一項所述的試劑盒的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： (1)包被抗人C1-INH抗體的載體的制備： 包被抗人C1INH抗體的96孔化學(xué)發(fā)光板：將包被用抗人C1-INH抗體加至碳酸鹽緩沖 液中混勻，加入微孔板內(nèi)，每孔1〇〇μ L，包被濃度1~5μ g/mL，4°C過夜，用含Tween 20的 磷酸鹽緩沖液洗滌微孔板2遍后，再加入含有BSA的磷酸鹽緩沖液，室溫靜置2小時后，棄 去孔內(nèi)液體，徹底干燥發(fā)光板，于鋁箔袋真空包裝，放2-8°C保存； 或包被抗人C1-INH抗體的磁珠微粒：將直徑0. 15 μ m的磁珠微粒用戊二醛活化，室溫 混勻2~5小時候，用0.0 lmol/L PBS緩沖液沖洗4次，并將該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為0. lmg/ mL~2. 5mg/mL ;然后，每毫升懸液中加入抗人C1-INH抗體10 μ g，于20~40°C混勻孵育 3~10小時；用等體積的0· 01M PBS 2%~5% BSA ρΗ7· 0~7. 4緩沖液于20~40°C孵育 2~8小時；最后，用2% BSA 0. 01~0. 1M Tris-HCl pH7. 5~pH9. 0緩沖液清洗三次，并 用該溶液配制成磁珠微粒濃度〇. 1~1. 〇mg/mL，即得； ⑵生物素標(biāo)記的C1-INH校準(zhǔn)品的制備：將C1-INH用0. lmol/L，pH8. 0的碳酸氫鈉 緩沖液或〇· 5mol/L，pH 8. 6的硼酸緩沖液稀釋到lmg/mL，并用0· lmol/L，ρΗ8· 0的碳酸氫 鈉緩沖液或〇. 5mol/L，pH 8. 6的硼酸緩沖液，對蛋白質(zhì)充分透析；用lmL DMS0溶解NHSB lmg ;向lmL C1-INH溶液加入120 μ 1 NHSB溶液；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4小時；加入 9. 6yLlmol/L NH4C1，在室溫下攪拌10分鐘；在4°C，對PBS充分透析，以除去游離的生物 素；將樣品上lmL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集lmL/管，蛋白質(zhì)在l-3mL之間洗下；最 后，樣品加入置氣納及l(fā).〇g/L BSA.將結(jié)合廣物直4C，避光保存； (3)鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑的制備：將鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶 用 2% BSA，0. 01M Tris-HCl ρΗ7· 4 的緩沖液配制為 0· 5ug ~lug/mL。8. 權(quán)利要求1-6任一項所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的具體方法為： 1) 將濃度分別為 〇U/mL、0. 125U/mL、0. 375U/mL、0. 65U/mL、l. 0U/mL、l· 25U/mL、l. 6U/ mL的Cl-INH校準(zhǔn)品各100 μ L依次加入到微孔板中，然后將50 μ L患者血清加入微孔中，然 后加入50 μ L生物標(biāo)記的C1-INH，室溫或37°C孵育15min~45min ; 2) 孵育結(jié)束后，洗板5次； 3) 加入lOOyL鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑，室溫或37°C孵育15min~ 30min ； 4) 孵育結(jié)束后，洗板5次； 5) 加入化學(xué)發(fā)光底物A液和底物B液各50 μ L，5min后讀數(shù)； 6) 建立校準(zhǔn)品曲線，將樣本檢測孔化學(xué)發(fā)光值代入校準(zhǔn)品曲線，計算出樣本中的 C1-INH的含量； 或為： 1) 在校準(zhǔn)品檢測管中加入50 μ L磁珠微粒試劑，加入50 μ L校準(zhǔn)品；在樣本檢測管中 加入50 μ L磁珠微粒試劑，然后加入25 μ L血清樣本，再加入25 μ L生物素標(biāo)記的C1-INH 校準(zhǔn)品，37°C孵育5~15min ; 2) 將孵育后的檢測管在磁場中分離，去除上清液，經(jīng)洗液多次清洗后，取出磁場，震蕩 使磁珠微粒充分混懸； 3) 向步驟2中的檢測管中加入100 μ L鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑，37°C孵育 5 ~15min ; 4) 將孵育后的檢測管在磁場中分離，去除上清液，經(jīng)洗液多次清洗后，取出磁場，震蕩 使磁珠微粒充分混懸； 5) 添加磁場，使步驟4)處理后的磁珠微粒在磁場中分離，去除上清液，然后加入發(fā)光 底物A和底物B，取出磁場，充分混勻厚繭檢測5min內(nèi)相對發(fā)光強度值。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種遺傳性血管水腫的檢測試劑盒，所述試劑盒包括：包被抗人C1-INH抗體的載體、生物素標(biāo)記的C1-INH校準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑、化學(xué)發(fā)光底物液A和B以及洗滌液。本發(fā)明提供的試劑盒及其應(yīng)用，相比比色法靈敏度和特異性更高，臨床上，操作更簡單，對于多樣本實驗室，且操作時間更短，能用于全自動或半自動發(fā)光免疫分析儀。
【IPC分類】G01N33/543, G01N33/577
【公開號】CN105527419
【申請?zhí)枴緾N201410768922
【發(fā)明人】白彩明
【申請人】北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2014年12月11日