遺傳性血管水腫的檢測試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測試劑盒領(lǐng)域，具體地說，涉及一種遺傳性血管水腫的檢測試劑盒 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 遺傳性血管水腫化ereditary angioedema，HAE)是一種W反復(fù)發(fā)作的皮下和 (或）黏膜下水腫為主要表現(xiàn)的罕見遺傳性疾病。水腫為自發(fā)性或由某些因素誘發(fā)，具有局 限性、非凹陷性、自限性的特點(diǎn)。常見受累部位包括顏面部、四肢、消化道及上呼吸道黏膜。
[0003] 典型的HAE是由補(bǔ)體Cl醋酶抑制劑（Clinhibitor，C1-INH)基因突變導(dǎo)致的 Cl-INH量的減少和（或）功能缺乏所致。遺傳性血管水腫是一種常染色體先行遺傳病，發(fā) 病率 1/50000。
[0004] 由于HAE發(fā)病率低，臨床上易發(fā)生誤診、誤治。該疾病的診斷除需要了解家族史和 根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)外，主要依賴于實(shí)驗(yàn)室對Cl-INH功能活性檢測。近年來，國外較多推 薦采用比色法對Cl-INH的功能進(jìn)行檢測。但比色法的靈敏度和特異性較低，且操作較復(fù) 雜，用時(shí)較長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種遺傳性血管水腫的檢 測試劑盒及其制備方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種遺傳性血管水腫的檢測試劑盒，所述 試劑盒包括；包被抗人Cl-INH抗體的載體、生物素標(biāo)記的Cl-INH校準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián) 的辣根過氧化酶試劑、化學(xué)發(fā)光底物液A和B W及洗涂液。
[0007] 進(jìn)一步地，所述載體為化學(xué)發(fā)光板或磁珠微粒。
[0008] 進(jìn)一步地，所述抗人Cl-INH抗體選自鼠抗人Cl-INH單克隆抗體、兔抗人Cl-INH 多克隆抗體、羊抗人Cl-INH的多克隆抗體、雞抗人Cl-INH多克隆抗體中的一種或多種。
[0009] 作為優(yōu)選，所述抗人Cl-INH抗體選自鼠抗人Cl-INH單克隆抗體。
[0010] 進(jìn)一步地，所述鼠抗人Cl-INH單克隆抗體的純度不小于95%，濃度不小于Img/ HlL。
[0011] 作為優(yōu)選，所述抗人Cl-INH抗體濃度為5 U g/血。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述試劑盒的制備方法，包括W下步驟：
[001引 （1)包被抗人Cl-INH抗體的載體的制備：
[0014] 包被抗人ClINH抗體的96孔化學(xué)發(fā)光板；將包被用抗人Cl-INH抗體加至碳酸鹽 緩沖液中混勻，加入微孔板內(nèi)，每孔100 y L包被濃度1~5 U g/mL，4°C過夜，用含Tween 20 的磯酸鹽緩沖液洗涂微孔板2遍后，再加入含有BSA的磯酸鹽緩沖液，室溫靜置2小時(shí)后， 棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥發(fā)光板，于鉛巧袋真空包裝，放2-8C保存；
[0015] 或包被抗人Cl-INH抗體的磁珠微粒；將直徑0. 15 U m的磁珠微粒用戊二醒活化， 室溫混勻2~5小時(shí)候，用0.0 lmol/L PBS緩沖液沖洗4次，并將該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為 0.1 mg/mL~2. 5mg/mL ;然后，每毫升懸液中加入抗人Cl-INH抗體10 y g，于20~40°C混勻 賠育3~10小時(shí)；用等體積的0.0 lM PBS 2%~5% BSA pH7. 0~7. 4緩沖液于20~40°C 賠育2~8小時(shí)；最后，用2% BSA 0.0 l~0.1 M Tris-肥1 pH7. 5~抑9. 0緩沖液清洗H 次，并用該溶液配制成磁珠微粒濃度0. 1~1. Omg/mU即得；
[0016] (2)生物素標(biāo)記的Cl-INH校準(zhǔn)品的制備：將Cl-INH用0.1mol/L，P冊.0的碳酸氨 鋼緩沖液或0. 5mol/l，pH 8. 6的測酸緩沖液稀釋到Img/mU并用0. lmol/1，pW. 0的碳酸 氨鋼緩沖液或0. 5mol/L，抑8. 6的測酸緩沖液，對蛋白質(zhì)充分透析；用ImL DMSO溶解畑SB Img ;向1血Cl-INH溶液（即含蛋白質(zhì)Img)加入120 N服B溶液（即含畑SB 120 U g); 在室溫下持續(xù)攬拌，保溫2-4小時(shí)；加入9. 6 U Llmol/L NH4CI (每25 U g畑SB加1 U 1)，在 室溫下攬拌10分鐘；在4°C，對PBS充分透析，W除去游離的生物素；將樣品上ImL的分子 篩柱，W PBS緩慢洗脫，收集ImL/管，蛋白質(zhì)在l-3mL之間洗下；最后，樣品加入疊氮鋼（終 濃度0. 5g/L)及1. Og/L BSA.將結(jié)合產(chǎn)物置4°C，避光保存；
[0017] (3)鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑的制備：將鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧 化酶用2% BSA，0.0 lM Tris-肥1抑7. 4的緩沖液配制為0. Sug~Iug/血。
[0018] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了前述試劑盒的應(yīng)用：
[0019] 當(dāng)包被抗人ClINH抗體的的載體為96孔化學(xué)發(fā)光板時(shí)，應(yīng)用方法具體為：
[0020] 1)將濃度分別為 0U/mL、0. 12抓/mUO. 37抓/mUO. 6抓/mU 1. OU/mL、1. 2抓/mU 1. 抓/mL的Cl-INH校準(zhǔn)品各100 U L依次加入到微孔板中，然后將50 U L患者血清加入微孔 中，然后加入50y L生物標(biāo)記的C1-INH，室溫或37°C賠育15min~45min ;
[002。。賠育結(jié)束后，洗板5次；
[002引扣加入100化鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑，室溫或37°C賠育15min~ SOmin ；
[002引 4)賠育結(jié)束后，洗板5次；
[0024] 5)加入化學(xué)發(fā)光底物A液和底物B液各50 U L 5min后讀數(shù)；
[002引6)建立校準(zhǔn)品曲線，將樣本檢測孔化學(xué)發(fā)光值代入校準(zhǔn)品曲線，計(jì)算出樣本中的 Cl-INH的含量。
[0026] 當(dāng)包被抗人ClINH抗體的的載體為磁珠微粒時(shí)，應(yīng)用方法具體為：
[0027] 1)在校準(zhǔn)品檢測管中加入50 U L磁珠微粒試劑，加入50 U L校準(zhǔn)品；在樣本檢 測管中加入50 U L磁珠微粒試劑，然后加入25 U L血清樣本，再加入25 U L生物素標(biāo)記的 Cl-INH校準(zhǔn)品，37°C賠育5~15min ;
[0028] 2)將賠育后的檢測管在磁場中分離，去除上清液，經(jīng)洗液多次清洗后，取出磁場， 震蕩使磁珠微粒充分混懸；
[002引扣向步驟2中的檢測管中加入100化鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶試劑，37C 賠育5~15min ;
[0030] 4)將賠育后的檢測管在磁場中分離，去除上清液，經(jīng)洗液多次清洗后，取出磁場， 震蕩使磁珠微粒充分混懸；
[0031] 5)添加磁場，使步驟4)處理后的磁珠微粒在磁場中分離，去除上清液，然后加入 發(fā)光底物A和底物B，取出磁場，充分混勻厚雖檢測5min內(nèi)相對發(fā)光強(qiáng)度值。
[0032] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0033] 本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫分析法用于Cl-INH的檢測，達(dá)到對遺傳性血管 水腫疾病的診斷。相比比色法，化學(xué)發(fā)光免疫分析法，靈敏度和特異性更高，臨床上，操作更 簡單，對于多樣本實(shí)驗(yàn)室，相比比色法，操作時(shí)間更短，能用于全自動或半自動發(fā)光免疫分 析儀。
【附圖說明】
[0034] 圖1為0濃度點(diǎn)和鄰近濃度點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線（化學(xué)發(fā)光板為包被載體試劑盒）。
[0035] 圖2為0濃度點(diǎn)和鄰近濃度點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線（磁珠微粒為包被載體試劑盒）。
[0036] 圖3為試劑盒校準(zhǔn)品曲線（化學(xué)發(fā)光板為包被載體試劑盒）。
[0037] 圖4為試劑盒校準(zhǔn)品曲線（磁珠微粒為包被載體試劑盒）。
【具體實(shí)施方式】
[003引 W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0039] 實(shí)施例1包被抗人Cl-INH抗體載體為96孔化學(xué)發(fā)光板檢測試劑盒的制備
[0040] (一）化學(xué)發(fā)光板的制備：
[0041] 鼠抗人Cl-INH單克隆抗體由北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司制備；。將鼠抗 人Cl-INH用50mM碳酸鹽緩沖液NazCOsl. 59g/L和Na肥032. 93g/L稀釋到2. 5 U g/ml，加至 對應(yīng)發(fā)光板內(nèi)，每孔100 U L，4°C賠育過夜，用含Tween 20的磯酸緩沖液洗涂發(fā)光板3遍后， 再加入含有BSA的磯酸鹽緩沖液（化C18. Og/L、KCl 2. Og/L、胞2冊〇42. 87g/L、KH2PO4O. 2g/ L、Tween 200. 5ml/L、5% BSA)，室溫靜置化后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥發(fā)光板，于鉛袋真 空包裝，完成變應(yīng)原包被的預(yù)包被發(fā)光板的制備。
[004引（二）生物素標(biāo)記Cl-INH校準(zhǔn)品的制備
[004引將Cl-INH用0.1mol/L碳酸氨鋼緩沖液（pH 8. 0)或0. 5mol/L測酸緩沖液（pH 8. 6)稀釋到Img/ml，并用0.1mol/L碳酸氨鋼緩沖液（pH 8. 0)或0. 5mol/L測酸緩沖液 (pH 8. 6)，對蛋白質(zhì)充分透析；用Iml DMSO溶解畑SB Img;向ImlCl-INH溶液（即含蛋白 質(zhì)Img)加入120化N服B溶液（即含畑SB 120 U g);在室溫下持續(xù)攬拌，保溫2-4小時(shí)； 加入9. 6 y Llmol/L畑仍（每25 U g N服B加1 y L)，在室溫下攬拌10分鐘；在4°C，對PBS 充分透析，W除去游離的生物素；將樣品上Iml的分子篩柱，W PBS緩慢洗脫，收集Iml/管， 蛋白質(zhì)在l-3ml之間洗下；最后,樣品加入畳氮鋼（終濃度0. 5g/L)及1. Og/L BSA.將結(jié)合 產(chǎn)物置4°C，避光保存。
[0044] ( H )鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根化酶試劑制備
[0045] 鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶購自Sigma,用2% BSA 0.0 lM Tris-肥1 pH7. 4 的緩沖液配制為0. 5 y g~1 y g/ml。
[0046] 實(shí)施例2包被抗人Cl-INH抗體載體為磁珠微粒檢測試劑盒的制備
[0047] (一）磁珠微粒試劑的制備
[004引將直徑0. 15 U m的磁珠微粒用戊二醒活化，室溫混勻4小時(shí)，用0.0 lmol/L PBS緩 沖液沖洗4次，并將該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為Img/ml ;然后，每毫升懸液中加入