Lett. 100,253701 (2012).]測量出受供體分子數(shù)之比為l:n的FRET串聯(lián)結(jié)構(gòu)的 效率E:
[0039]
(2)
[0040] 為了方別求解，直接將公式(2)代入到公式（1)中消去E，其中對于固定的FRET串聯(lián) 結(jié)構(gòu)fD=l，于是整理得到G值的表達(dá)式如下：
[0041 ]
(3)
[0042] 通過測量漂白前后的5個(gè)通道的值，即1^、1?、1^^)=和^￡'1后即可求出6因子。
[0043] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0044] 本發(fā)明是一種測量給定供受體對和測量系統(tǒng)的G因子的方法，具有測量過程簡單、 測量時(shí)間短和測量結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明對于活細(xì)胞FRET定量檢測具有重要的應(yīng) 用價(jià)值，必將極大地提高活細(xì)胞FRET檢測的成功率，從而推動(dòng)FRET定量檢測技術(shù)在細(xì)胞生 物學(xué)中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0045] 圖1是實(shí)例中所述的雙通道寬場熒光顯微鏡系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，（a)光源； (b)三孔的激發(fā)片拉板，裝載的激發(fā)片分別為：1、BP 445/25,2、BP 510/17,3、空擋；（c)衰減 片轉(zhuǎn)輪，成像時(shí)調(diào)為6檔，漂白時(shí)調(diào)為1檔；（d)參照樣本；（e)物鏡；（f)雙二色片:DFT 460+ 520;(g)二級濾光片組，裝載的濾光片分別為：1、BP 480/22;2、FT 510;3、LP 530;(h)和（i) 探測器(XD。
[0046] 圖2是雙通道寬場熒光顯微鏡系統(tǒng)探測的熒光圖以及對應(yīng)數(shù)據(jù)處理的x和G因子的 灰度圖；其中，（a)是雙通道寬場熒光顯微鏡系統(tǒng)探測到的漂白前后的5個(gè)通道的圖像，DD (漂白前，Idd:BP 445/25，DFT 460+520，BP 480/22)、AA(漂白前，Im:BP 510/17，DFT 460+ 520，LP 530)、DA(漂白前，IDA:BP 445/25，DFT 460+520，LP 530)、DDP(漂白后，右f )、AAP (漂白后，，白色比例尺表示20ym;(b)是運(yùn)用本發(fā)明中提出的G值的測量公式，通過對 (a)中的5個(gè)圖像進(jìn)行逐像素處理，得出對應(yīng)的漂白程度X的灰度圖和G值的灰度圖以及G的 灰度圖所對應(yīng)各像素灰度值的統(tǒng)計(jì)直方圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0048] 實(shí)施例1
[0049] 1、質(zhì)粒來源
[0050] 質(zhì)粒 C32V(Cerulean-32-Venus)和 CTV(Cerulean-TRAF-Venus，其中 TRAF 是一個(gè)腫 瘤壞死因子受體相關(guān)因子域，一個(gè)包括229個(gè)氨基酸的長鏈)購于美國addgene質(zhì)粒庫。
[00511 2、雙通道寬場熒光顯微鏡系統(tǒng)
[0052]該雙通道寬場焚光顯微鏡系統(tǒng)產(chǎn)自德國卡爾蔡司公司，型號為Axio Observer，結(jié) 構(gòu)如圖1所示。光源是美國Lumen Dynamics公司的X-Cite 120Q系列的金屬鹵化燈，物鏡是 放大倍數(shù)為40、數(shù)值孔徑為1.3(40 X 1.3NA)的油鏡，一個(gè)三孔的激發(fā)片拉板，一個(gè)衰減片轉(zhuǎn) 輪，一個(gè)cube(每個(gè)cube中可安裝激發(fā)片、分光片、發(fā)射片各一個(gè))轉(zhuǎn)輪，外接兩個(gè)CCD相機(jī)。 激發(fā)光波段通過推拉激發(fā)片拉板來進(jìn)行選擇，激發(fā)光強(qiáng)通過選擇光源輸出的5個(gè)不同檔位 (總光強(qiáng)的0 %，12.5%，25%，50%，100% )和衰減片轉(zhuǎn)輪的不同衰減程度(從1~6分別為原 光強(qiáng)的 100%，70%，50%，40%，20%，2%)來調(diào)節(jié)。
[0053] 3、細(xì)胞培養(yǎng)以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0054] HepG2細(xì)胞來自中國廣州暨南大學(xué)，用DMEM培養(yǎng)基加入10 %的新生牛血清放在含 有5%二氧化碳的37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞用胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞生長至70~90%時(shí)，用體外轉(zhuǎn)染試劑Turbofect?將質(zhì)粒短暫轉(zhuǎn)入細(xì)胞。 [0055]轉(zhuǎn)染的具體步驟：（1)取兩只滅菌的EP管，每個(gè)EP管中先加入40yL無血清的DMEM， 然后向一只EP管中加入1~2yL的轉(zhuǎn)染試劑，另一只EP管中加入1~2yL(500~600ngAxL)的 質(zhì)粒，靜置5分鐘；（2)5分鐘后，將兩只EP管混勻，輕輕吹打6~8次后靜置20分鐘，（3)20分鐘 后，將420yL的無血清的DMEM加入到剛剛混勻的EP管中，輕輕混勻；（4)用無血清的DMEM培養(yǎng) 基或PBS清洗培養(yǎng)皿中細(xì)胞2~3次，主要洗去死細(xì)胞等臟污，然后把上述的（3)中的混合物 移到培養(yǎng)皿中，把培養(yǎng)皿重新放回培養(yǎng)箱中4~6小時(shí)；（5)4~6小時(shí)后，吸去轉(zhuǎn)染液，然后用 用無血清的DMEM培養(yǎng)基或PBS清洗培養(yǎng)皿中細(xì)胞2~3次，再往培養(yǎng)皿中加入含有新生牛血 清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24~48小時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。
[0056] 4、測量G因子
[0057] 將載有表達(dá)C32V的HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于寬場熒光顯微鏡40 X 1.3NA的油鏡上 進(jìn)行熒光成像和受體光漂白。在FRET檢測時(shí)，使用445/25激發(fā)光(表示的是以425nm為中心、 帶寬為25nm的激發(fā)光)激發(fā)Cerulean，使用510/17激發(fā)光(表示的是以510nm為中心、帶寬為 17nm的激發(fā)光)激發(fā)Venus，雙通道的熒光探測通道分別是采用480/22(表示的是以480nm為 中心、帶寬為22nm的發(fā)射光)通道檢測Cerulean發(fā)射的熒光，LP 530(表示的是大于530的發(fā) 射光)通道檢測Venus發(fā)射的熒光。受體光漂白時(shí)，將激發(fā)光源調(diào)為最大功率100%，衰減片 調(diào)為100%透過率，并持續(xù)2~4秒的時(shí)間。測量得到漂白部分受體前后的轉(zhuǎn)染C32V細(xì)胞的熒 光強(qiáng)度圖，如圖2(a)所示。本次實(shí)驗(yàn)中，事先已分別用單轉(zhuǎn)供體和單轉(zhuǎn)受體的活細(xì)胞樣本測 量了供受體的光譜串?dāng)_系數(shù)，即a = 0.3163; b = 0.0077 ;c = 0.0008 ;d = 0· 8536。實(shí)驗(yàn)測量得 到的漂白程度x和G值如圖2(b)所示，在同樣條件下測量9組圖像得到統(tǒng)計(jì)的G值為3.634± 0.067。
[0058] 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以通過Chen [Η · Chen e t a 1 ·，"Measurements of FRET Efficiency and Ratio of Donor to Acceptor Concentration in living Cells," Biophys.J.91(5)，L39-L41(2006)]提出的在活細(xì)胞中用兩個(gè)E值未知的l:lFRET串聯(lián)結(jié)構(gòu) 來確定G因子的方法來進(jìn)行驗(yàn)證。對表達(dá)C32V和CTV的活細(xì)胞分別進(jìn)行三通道的熒光成像實(shí) 驗(yàn)，測量得到該系統(tǒng)的FRET敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子G為3.679 ± 0.389，與用本發(fā)明測量得到的結(jié) 果（3·634±0·067)-致。
[0059] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法，其特征在于包括以下具體的 步驟： (1) 在活細(xì)胞中表達(dá)一種含有1個(gè)供體和η個(gè)受體的FRET串聯(lián)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)； (2) 首先對步驟（1)中所述的細(xì)胞進(jìn)行三通道熒光成像，分別得到IDD、IAA、IDA三種熒光 強(qiáng)度圖，然后選擇性光漂白部分受體，再進(jìn)行熒光成像獲得igg和的熒光強(qiáng)度圖； (3) 計(jì)算G因子： G二^^I. IPUD-iD〇 ^ 其中，F(xiàn)c = lDA_a(lM_clDD)_d(lD『blM)，a、b、c、d是光譜串?dāng)_系數(shù)； Χ = 為漂白程度； η為正整數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法，其特征在 于:所述的X控制為10~80%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法，其特征在 于:所述的X控制為15~30%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法，其特征在 于:所述的η為1~50的整數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法。該測量方法包括以下具體的步驟：在活細(xì)胞中表達(dá)一種含有1個(gè)供體和n個(gè)受體的FRET串聯(lián)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)；首先對上述細(xì)胞進(jìn)行三通道熒光成像，分別得到IDD、IAA、IDA三種熒光強(qiáng)度圖，然后選擇性光漂白部分受體，再進(jìn)行熒光成像獲得和的熒光強(qiáng)度圖；(3)計(jì)算G因子：本發(fā)明的測量方法具有測量過程簡單、測量時(shí)間短和測量結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明對于活細(xì)胞FRET定量檢測具有重要的應(yīng)用價(jià)值，必將極大地提高活細(xì)胞FRET檢測的成功率，從而推動(dòng)FRET定量檢測技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105466902
【申請?zhí)枴緾N201610031821
【發(fā)明人】陳同生, 張江, 林方睿
【申請人】華南師范大學(xué)
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月18日